2009,29(4) 汪洋等 : 重组人谷氨酸脱羧酶 65 的表达及活性研究 13 5?TTAGGTACCGACGACGACGACAAGGCATCTCCGGG CTCT?3 包括 KpnⅠ 酶切位点和肠激酶酶切位点 (GACGACGACGACAAG), 下游引物 5?GCTGGATCCT GGAAC

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史樊
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2009,29(4):12~16 重组人谷氨酸脱羧酶 65 的表达及活性研究汪洋马明浩冯震吴叶林张绪瑛金明飞黄静吴自荣 ( 华东师范大学生命科学学院上海 ) 摘要目的 : 获得有活性的人谷氨酸脱羧酶 65(humanglutamatedecarboxylase65,hGAD65) 用于 Ⅰ 型糖尿病 (type1diabetesmelitus,t1dm) 检测方法 : 将 hgad65 基因插入质粒 pet32a(+) 中, 与硫氧还蛋白 (thioredox) 及六聚组氨酸 (hexahistidine) 融合, 由 IPTG 诱导融合蛋白 (Trx? hgad65) 表达, 经两次镍离子亲和层析纯化, 通过薄层层析和 ELISA 研究 hgad65 及 Trx?hGAD65 的活性结果 : 在大肠杆菌中实现 hgad65 的可溶性表达, 经亲和层析得到较纯 hgad65 和 Trx? hgad65 蛋白, 二者具有相同酶学活性, 但 Trx?hGAD65 稳定性更高, 并能检测出 T1DM 患者血清中的 hgad65 抗体 (hgad65?ab) 结论:Trx?hGAD65 能在大肠杆菌中可溶性表达, 从而为 Trx? hgad65 用于 T1DM 诊断预防和治疗打下基础关键词 Ⅰ 型糖尿病人谷氨酸脱羧酶 65 可溶性表达酶学活性中图分类号 Q786 谷氨酸脱羧酶 (glutamatedecarboxylase,gad) 是特异性催化 L? 谷氨酸脱羧生成 γ? 氨基丁酸的一种酶, 有两种同功酶 :GAD65 和 GAD67, 人胰岛中仅有 GAD65 表达 [1] 研究发现,Ⅰ 型糖尿病是一种由遗传易感个体自身抗原介导免疫反应而引起的胰岛 β 细胞破坏的自身免疫疾病,GAD65 正是此自身免疫反应关键的始动靶抗原 [2] 研究表明约 80% 的糖尿病患者体内存在 hgad65? Ab [3], 是诊断 T1DM 免疫指标中最有效和特异的一个所以, 用 GAD65 来检测 GAD65?Ab 可作为 T1DM 的诊断和预测手段 ; 此外, 把 GAD65 开发为基因疫苗或蛋白疫苗来预防和治疗 T1DM 将有很大应用前景糖尿病检测防治需获得一定数量的 GAD65 猪脑中提取的 GAD65 价格昂贵, 且存在异源性问题, 故近年来人们试图用基因工程方法来获得 GAD 国内在很长时期内对于 GAD 的研究都集中在鼠源 GAD [4], 尚未见研究者尝试用基因工程方法来获得人源 GAD65 本研究将人 GAD65 基因克隆到大肠杆菌中表达, 利用镍离子亲合层析技术获得了人 GAD65, 并对其活性进行了研究收稿日期 : 修回日期 : 上海市科委重大科技项目登山计划 (06DZ19016) 资助项目并列第一作者通讯作者, 电子信箱 :zrwu@bio.ecnu.edu.cn 1 材料与方法 1.1 菌种和质粒大肠杆菌 DH5α BL21(DE3) 和质粒 pet32a(+) 均为本实验室保藏 ; 质粒 pbsgad65 是插入 hgad65 基因的大肠杆菌克隆质粒, 由澳大利亚动物健康研究所惠赠 1.2 试剂及材料 Taq 酶限制性内切酶 T4DNA 连接酶 DNA 分子量标准 DNA 回收试剂盒为 TaKaRa 生物工程公司产品 ; 氨苄青霉素 IPTG 丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺 OPD 显色底物为 Sigma 公司产品 ; 琼脂糖咪唑为 AMRESCO 公司产品 ;Protino?Ni?IDA 1000 packed column 为 Macherey?Nagel 公司产品 ;AmiconUltra5000 超滤离心管为 Milipore 公司产品 ; 低分子量蛋白质标准, 为上海升正生物技术有限公司产品 ; 辣根过氧化物酶标记山羊抗人 IgG, 为北京博大泰克生物技术有限公司产品 ; 正常人血清 Ⅰ 型糖尿病病人血清, 由上海市普陀区中心医院提供 ; 其它试剂均为国产分析纯 1.3 实验方法表达载体的构建根据已报道的 hgad65 基因序列, 借助软件 CloneManager 设计一对引物 : 上游引物

2 2009,29(4) 汪洋等 : 重组人谷氨酸脱羧酶 65 的表达及活性研究 13 5?TTAGGTACCGACGACGACGACAAGGCATCTCCGGG CTCT?3 包括 KpnⅠ 酶切位点和肠激酶酶切位点 (GACGACGACGACAAG), 下游引物 5?GCTGGATCCT GGAACAGCTTGGTGAGCA?3 包括 BamHⅠ 酶切位点以质粒 pbsgad65 为模板, 通过 PCR 扩增人谷氨酸脱羧酶 65 基因,PCR 反应条件为 :94 预变性 5min;94 变性 40s,50 复性 40s,72 延伸 2min, 扩增 28 个循环 ; 72 再延伸 5min PCR 产物和载体 pet32a(+) 分别用 BamHⅠ 和 KpnⅠ 双酶切并纯化回收大片段,T4DNA 连接酶 16 连接过夜, 转化大肠杆菌 DH5α, 抽提转化子质粒用于 PCR 酶切鉴定基因工程菌的诱导表达抽提测序正确的重组质粒 pet32a(+)?hgad65, 转化大肠杆菌 BL21 (DE3), 得基因工程表达菌挑单菌落接种于含 100μg/mlAmp 的 LB 培养基,37 210r/min 培养过夜, 得种子液种子液以 4% 接种量接种于含 100μg/ml Amp 的 LB 培养基,37 210r/min 培养至 OD 600 =0.4, 加 IPTG 至终浓度 0.6mmol/L,15 诱导 12h hgad65 的分离纯化参照 Protino?Ni?IDA 1000packedcolumn 使用说明, 将菌体重悬于 LEW bufer, 冰浴中超声破菌, r/min 离心 30min, 上清液过 Protino?Ni?IDA1000packedcolumn 收集含融合蛋白的 Elutionbufer 洗脱组分, 用 5kDa 超滤离心管将融合蛋白脱盐浓缩至 2mg/ml 加入 ph7.9 的 50mmol/LTris?Cl 10mmol/LCaCl 2 和 1% Tween?20, 每 0.8mg 融合蛋白加 1U 肠激酶,25 酶切 16h 酶切反应液再过 Protino?Ni?IDA1000packedcolumn, 收集穿柱液, 即为 hgad65,sds?page 电泳检测纯度 hgad65 及 Trx?hGAD65 的酶学活性薄层层析法检测 γ? 氨基丁酸的生成取人谷氨酸脱羧酶 65 (hgad65) 加入酶反应底物液 (50mmol/L 磷酸缓冲液, ph7.2,1mmol/ledta,0.2mmol/l5?plp,20mmol/l L? 谷氨酸钠 ),37 12h 取反应液 20μl, 加等体积 100mmol/LpH9.0 硼酸缓冲液和 4μlNBD?Cl(4mg/ml) 荧光染液,55 1h 取染色后反应液, 点薄层层析硅胶板, 置于展层剂 ( 正丁醇冰乙酸水 = ) 中, 展层完毕后在紫外灯下观察荧光生成 Trx?hGAD65 的免疫学活性 ELISA 法测定抗体结合活性 :(1)Trx?hGAD65 以 CBS 包被缓冲液做不同稀释度,100μl/ 孔点样,4 包被过夜 ;(2) 加 PBST(PBS ph7.4,0.05%,tween?20)300μl/ 孔洗涤 3 次, 弃尽液体 ; (3) 加封阻液 (PBSpH7.4,0.05% Tween?20,2%BSA 或 5% 脱脂奶粉 )200μl/ 孔,37 孵育 1h;(4) 重复步骤 (2); (5) 加 T1DM 患者血清 100μl/ 孔,37 孵育 1h;(6) 重复步骤 (2);(7) 加辣根过氧化物酶标记的山羊抗人 IgG, 100μl/ 孔,37 孵育 1h;(8) 重复步骤 (2);(9) 加 OPD 显色液 (OPD0.5g/L, 溶于 0.05mol/L 柠檬酸缓冲液 ph5. 0, 含 0.06% H 2 O 2 )100μl/ 孔,25 显色 30min;(10) 加 50μl/ 孔终止液 (2mol/LH 2 SO 4 ), 测 OD 结果与分析 2.1 pet32a(+)?hgad65 的构建鉴定构建过程见图 1,PCR 扩增的 hgad65 基因经 BamHⅠ 和 KpnⅠ 酶切后, 插入载体 pet32a(+) 的多克隆位点, 得到重组表达载体 pet32a(+)?hgad65 抽提重组质粒及载体质粒, 用 KpnⅠ 单酶切, 结果如图 2 ( 泳道 2 4), 表明重组质粒大小约 7665bp, 比载体大, 与理论相符 BamHⅠ 和 KpnⅠ 双酶切重组质粒, 得到 2 个片段, 大片段为 5900bp, 与载体一致 ; 小片段约 1813bp, 与 hgad65 的 PCR 扩增片段相符质粒大小比较和双酶切鉴定结果都证明成功获得 pet32a(+)? hgad65 阳性克隆, 经测序后证明 hgad65 基因序列与报道的序列完全一致图 1 hgad65 在大肠杆菌中的克隆 Fig.1 StrategyforcloningofthehGAD65 geneine.coli 2.2 hgad65 的表达和纯化含 pet32a(+)?hgad65 的基因工程菌经 IPTG 诱

14 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No.42009 图 2 重组质粒的 PCR 和酶切鉴定 Fig.

hGAD65digestedbyBamHⅠ and KpnⅠ;6:DNAmarkerDL2000 导后, 在分子量约 82kDa 处出现表达条带, 与理论值相符超声破菌后, 分别取上清和沉淀电泳, 结果如图 3 可以看出, 目的蛋白大部分以包涵体形式表达, 但可溶性表达条带能直接通过 SDS?

hgad65, 肠激酶酶解融合蛋白后再经第二次亲和层析, 即可收集穿透液中高纯度的 hgad65 图 4 hgad65 的分离纯化 Fig.4 IsolationandpurificationofhGAD65 1:Proteinmarker;2:PurifiedTrx?hGAD65;3:PurifiedTrx?

gaba), 即 hgad65 与硫氧还蛋白融合不影响其酶学活性, 进而推测硫氧还蛋白的存在也不会影响其免疫学活性 ; 此外还可发现样品 2 的产物点比样品 3 亮, 表明 Trx?hGAD65 酶学活性比 hgad65 高, 从而推测 hgad65 可能不稳定, 易失活由于 Trx?hGAD65 更易获得, 稳定性更好, 因此后续实验采用 Trx?

3 14 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No 图 2 重组质粒的 PCR 和酶切鉴定 Fig.2 Identificationoftherecombinantplasmid bypcrandenzymedigestion 1:DNAmarkerDL15000;2:pET32a(+)digestedbyKpnⅠ; 3:hGAD65PCRproduct;4:pET32a(+)?hGAD65digestedby KpnⅠ;5:pET32a(+)?hGAD65digestedbyBamHⅠ and KpnⅠ;6:DNAmarkerDL2000 导后, 在分子量约 82kDa 处出现表达条带, 与理论值相符超声破菌后, 分别取上清和沉淀电泳, 结果如图 3 可以看出, 目的蛋白大部分以包涵体形式表达, 但可溶性表达条带能直接通过 SDS?PAGE 观察到, 而在 [5] [6] Papouchado 等和 Davis 等的实验中, 可溶性蛋白条带需要用 Westernbloting 才能显现, 故本实验是一个明显的进步 hgad65 的纯化结果如图 4, 破菌上清经第一次镍离子亲和层析得到纯化的融合蛋白 Trx? hgad65, 肠激酶酶解融合蛋白后再经第二次亲和层析, 即可收集穿透液中高纯度的 hgad65 图 4 hgad65 的分离纯化 Fig.4 IsolationandpurificationofhGAD65 1:Proteinmarker;2:PurifiedTrx?hGAD65;3:PurifiedTrx?hGAD65 digestedbyenterokinase;4:purifiedhgad65;5:elutionbuferwith thioredoxandhexahistidine 进行反应, 产物量与荧光强度成正比, 故可通过此法比较二者的酶学活性, 结果如图 5 由图可知, 两者都能催化底物 L? 谷氨酸钠 (L?MSG) 脱羧生成产物 γ? 氨基丁酸 (γ?gaba), 即 hgad65 与硫氧还蛋白融合不影响其酶学活性, 进而推测硫氧还蛋白的存在也不会影响其免疫学活性 ; 此外还可发现样品 2 的产物点比样品 3 亮, 表明 Trx?hGAD65 酶学活性比 hgad65 高, 从而推测 hgad65 可能不稳定, 易失活由于 Trx?hGAD65 更易获得, 稳定性更好, 因此后续实验采用 Trx?hGAD65 来研究其免疫学性质图 5 Trx?hGAD65 和 hgad65 的酶学活性比较 Fig.5 EnzymaticactivityofTrx?hGAD65 andhgad65 1:Control(γ?GABA+L?MSG);2:Trx?hGAD65+L?MSG; 3:hGAD65+L?MSG 图 3 Trx?hGAD65 的可溶性表达 Fig.3 SolubleexpresionofTrx?hGAD65 1:Proteinmarker;2:TotallysateofBL21(DE3)containingpET32a (+)?hgad65boforeinduction;3:solublelysateofbl21(de3) containingpet32a(+)?hgad65afterinduction;4:insolublelysate ofbl21(de3)containingpet32a(+)?hgad65afterinduction 2.3 hgad65 及 Trx?hGAD65 的酶学活性取等量 hgad65 和 Trx?hGAD65 分别与等量底物 2.4 Trx?hGAD65 的免疫学活性以纯化的 Trx?hGAD65 融合蛋白 (1mg/ml) 为检测试剂,T1DM 病人血清为待测样品, 正常人血清为阴性对照, 空白对照则不加 Trx?hGAD65, 通过 ELISA 验证 Trx? hgad65 对 T1DM 病人血清中 hgad65 抗体的识别结合能力, 结果见表 1 与对照相比,T1DM 病人血清样本 A 和 B 均明显呈阳性, 说明本研究制备的 Trx?hGAD65 能明显检测出 T1DM 病人血清中的 hgad65?ab

4 2009,29(4) 汪洋等 : 重组人谷氨酸脱羧酶 65 的表达及活性研究 15 表 1 Trx?hGAD65 的免疫学活性检测结果 Table1 ImmunologicactivityofTrx?hGAD65 Trx?hGAD65( 稀释度 ) 讨论空白对照阴性对照血清 A 血清 B 糖尿病人群中约有 90% 是 Ⅱ 型糖尿病 (T2DM) 病人, 其中有部分是成人隐匿性自身免疫糖尿病 (LADA) 患者 [7] 这些患者具有从 T2DM 转变为 T1DM 的倾向 [7], 从 T2DM 人群中诊断出 LADA 患者将有助于进行早期的干涉治疗因此, 开发高效廉价的 T1DM 诊断预防治疗药物具有重要的应用价值目前, 通过从组织中分离纯化或化学合成来获得大量 hgad65 是不现实的国外研究者试图在兔网织红细胞 [8] CHO 细胞 [9] [10] 酵母细胞以及大肠杆菌系统中表达重组 hgad65, 但存在以下缺点 :hgad65 表达量很低, 多以包涵体形式表达, 很难正确复性, 导致蛋白没有活性 ; 耗时费力, 花费较大, 不适合广泛应用因此, 迫切需要研究高效低价并能广泛应用的 hgad65 制备方法本研究通过基因工程方法, 把 hgad65 与 pet32a (+) 上的硫氧还蛋白及 HisTag 融合, 在大肠杆菌中表达一方面, 硫氧还蛋白能为细胞提供还原性环境便于 hgad65 蛋白分子正确折叠, 提高可溶性 ; 另一方面, 利用 HisTag 经一次亲和层析就可获得较纯的融合蛋白 Trx?hGAD65, 简化了纯化过程 [11] 考虑到 hgad65 蛋白的结构特性 : 分子量很大 (65kDa), 含有 15 个半胱氨酸二硫键较多, 表达时极易形成包涵体, 且复性难度很高, 而其免疫学活性必须依赖正确的蛋白立体构型因此为提高融合蛋白 Trx? hgad65 的可溶性表达程度, 本研究对其可溶性表达条件也进行了探索, 总结出最优发酵条件 : 接种量 4% 在 OD 600 =0.4 时诱导 IPTG 终浓度 0.6mmol/L 诱导温度 15 诱导时间 12h 大量研究证明, 蛋白表达的可溶性主要与诱导温度有关, 低温有利于可溶性表达本实验采用低温长时间诱导法, 使表达量达到 10%, 而可溶性蛋白条带可通过 SDS?PAGE 直接观察到, 最终实现了 hgad65 在大肠杆菌中的可溶性表达对于 hgad65 酶学活性的检测, 有研究者采用比色法 [12], 但步骤复杂重复性不强易产生误差 ; 也有研究 [13] 者用氨基酸分析和 HPLC [14], 虽准确但耗时, 且需贵重仪器, 不适合常规实验室检测本研究建立了一种极为简便的检测 hgad65 酶学活性的方法实验中采用一种氨基化合物的荧光衍生试剂 NBD?CL, 它在水和有机溶剂中能与伯氨和仲氨反应 [15] 用 NBD?CL 对 L? MSG 和 γ?gaba 进行荧光染色然后利用二者极性不同, 通过薄层层析使二者分离, 在紫外光下, 被荧光染色的氨基酸会表现出强烈荧光该法较直观, 且步骤简单无需贵重仪器, 适合常规实验室检测与国外相比, 本研究在 hgad65 的可溶性表达上有显著提高, 建立了一种简单高效的酶学活性测定方法在国内, 首次在大肠杆菌中成功表达出有活性的 hgad65, 并建立一套有效的纯化检测体系为今后把人谷氨酸脱羧酶 65 开发为 Ⅰ 型糖尿病检测预防和治疗药物奠定基础参考文献 [1]ShiY,KanaaniJ,Menard?RoseV,etal.Increasedexpresionof GAD65andGABAinpancreaticbeta?celsimpairsfirst?phase insulinsecretion.am JPhysiolEndocrinolMetab,2000,279 (3):E684~694 [2] 马明浩, 汪洋, 金明飞, 等. 谷氨酸脱羧酶与 Ⅰ 型糖尿病发病机制. 生命的化学,2006,26(1):60~62 MaM H,WangY,JinM F,etal.ChemistryofLife,2006,26 (1):60~62 [3]ZimmetP.Antibodiestoglutamicaciddecarboxylaseinthe predictionofinsulin dependency.diabetesresclin Pract, 1996,34:125~131 [4] 张颖, 郭善一, 梁东春, 等. 大鼠谷氨酸脱羧酶 (GAD) 毕赤酵母表达重组子的构建. 天津医科大学学报,2004,10(1):43 ~46 ZhangY,GuoSY,LiangDC,etal.JournalofTianjinMedical University,2004,10(1):43~46 [5]PapouchadoM L,ValdezSN,GhiringheliD,etal.Expresionof properlyfoldedhumanglutamatedecarboxylase65asafusion proteininescherichiacoli.eurjbiochem,1997,246(2):350~359 [6]DavisK M,FoosT,BatesC S,etal.A novelmethodfor expresionand large?scale production ofhuman brain l? glutamatedecarboxylase.biochembiophysrescommun,2000, 267(3):777~782 [7] 刘芳. 血清谷氨酸脱羧酶抗体测定的临床意义. 中华内分泌代谢杂志,1997,13(2):116~118 LiuF.ChinJEndocrinolMetab,1997,13(2):116~118

5 16 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No [8]RowleyMJ,ChenQY,TeohKL,etal.Diabeticserareactwith the glutamic acid decarboxylase molecule in a dimeric? oligomericform.clinexpimmunol,1996,106(2):323~328 [9] PapouchadoM L,ErmácoraM R,PoskusE.Detection of glutamicaciddecarboxylase(gad)autoantibodiesbyindirect immunofluorescenceusingcho celsexpresingrecombinant humangad65.jautoimmun,1996,9(5):689~697 [10]Law R H,RowleyM J,MackayIR,etal.Expresionin Sacharomycescerevisiae ofantigenicaly and enzymaticaly activerecombinantglutamicaciddecarboxylase.jbiotechnol, 1998,61(1):57~68 [11] 黄静, 徐进, 左翼, 等. 重组人胰高血糖素样肽?1 表达及生物学活性. 中国生物工程杂志,2006,26(1):50~55 HuangJ,XuJ,ZuoY,etal.ChinaBiotechnology,2006,26 (1):50~55 [12] 杨胜远, 陆兆新, 吕凤霞, 等. 谷氨酸脱羧酶活力测定中 GABA 比色定量方法研究. 食品科学,2006,26(6):205~ 209 YangSY,LuZX,LuFX,etal.FoodScience,2006,26(6): 205~209 [13] 范军, 李纯, 朱苏文, 等. 小麦谷氨酸脱羧酶的纯化及部分性质研究. 中国生物化学与分子生物学学报,1998,14(5): 641~644 FanJ,LiC,ZhuSW,etal.ChineseJournalofBiochemistry andmolecularbiology,1998,14(5):641~644 [14]EricsonC,WictorinK,LundbergC.Exvivoandinvitrostudies oftransgene expresion in ratastrocytes transduced with lentiviralvectors.expneurol,2002,173(1):22~30 [15] 郁美娟, 孟庆华, 任吉存, 等. 基于生命体系中氨基键合标记的荧光探针研究进展. 染料与染色,2004,41(3):137~144 YuM J,MengQH,RenJC,etal.DyestufsandColoration, 2004,41(3):137~144 ExpresionandActivityofRecombinantHumanGlutamateDecarboxylase65 WANGYang MAMing?hao FENGZhen WUYe?lin ZHANGXu?ying JINMing?fei HUANGJing WUZi?rong (SchoolofLifeScienceEastChinaNormalUniversity,Shanghai ,China) Abstract Humanglutamatedecarboxylase65(hGAD65)isanenzymethatcatalyzesthetransformationof L?glutamicacidintoγ?aminobutyricacid.IthasbeenfoundthatType1diabetesmelitus(T1DM)isan autoimmunedisease,inwhichpancreaticisletβ?celsaredestroyedduetoimmuneresponsemediatedby autoantigen.hgad65isconsideredasakeyautoantigenoftheautoimmuneresponse,soanti?hgad65antibody (hgad65?ab)isthemostefectiveandspecificimmunemarkerfort1dm diagnosis,andhgad65canbeused todetecthgad65?abinserum oft1dm patients.thehgad65genewasclonedintopet32a(+),thenthe recombinantplasmidwithhgad65wastransformedintoe.colibl21(de3)andexpresedbyiptginduction. Thefusionproteincontainingthioredox,hexahistidineandhGAD65(Trx?hGAD65)wasmostlyinsoluble,butthe bandofsolubletrx?hgad65couldalsobedetectedbysds?page,anditwasagreatimprovementcomparedwith theresultsreported.trx?hgad65 wasisolatedfrom lysateandpurifiedbyimmobilizedmetalionafinity chromatography(imac).afterenterokinasedigestionandimac purification,hgad65withhighpuritywas obtained.detectionofthin?layerchromatography(tlc) showedthatbothtrx?hgad65 andhgad65 had enzymaticactivity,whereastrx?hgad65hadbeterstability.furthermore,itwasconfirmedthattrx?hgad65was abletoconjugatewithhgad65?abintheserum oft1dm patientsbyelisaasay.inconclusion,trx?hgad65 insteadofhgad65canbeusedfort1dm diagnosis,anditsapplicationinprophylaxisandtherapyoft1dm is expectable. Keywords Type1diabetesmelitus(T1DM) Humanglutamatedecarboxylase65(hGAD65) Soluble expresion Enzymaticactivity

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌