202,32(8) 郭云萍等 : 无标签重组人硫氧还蛋白的大规模表达纯化及活性检测引物合成据已报道的人 Trx 基因编码区序列 ( 基因登陆号为 GeneID:7295) 设计引物, 由北京华大基因公司合成上游引物 :5 GGAATTCCATATGGTGAAGCAGATC3, 下游

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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,202,32(8):62 67 檪檪技术与方法檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪无标签重组人硫氧还蛋白的大规模表达纯化及活性检测郭云萍孙璐张立剑 2 张英起 2 王增禄屈延高陶超凌杨强刘毅 ( 第四军医大学西京医院西安第四军医大学药学系生物技术中心西安 70032) 摘要目的 : 利用基因工程的方法原核表达无标签的重组人硫氧还蛋白 (rhtrx) 并对其进行大规模表达纯化和鉴定方法 : 从人胚胎肾 HEK293 细胞中提取总 RNA, 反转录合成 cdna, 经 PCR 扩增酶切后连入 pet 22b(+) 载体构建重组质粒, 重组质粒转化大肠杆菌 BL2(DE3) 感受态细胞,IPTG 诱导表达, 经两步离子交换层析纯化重组蛋白, 采用 SDS PAGE Westernbloting HPLC MALDI TOF MS 及经典的胰岛素二硫键还原法对重组蛋白进行鉴定结果 : 构建成功了 rhtrx 基因表达载体 ; 实现了 rhtrx 在原核细胞中的可溶性表达 ; 纯化出的蛋白经 SDS PAGE 和 Western bloting 分析证实为 rhtrx;hplc 和 MALDI TOF MS 分析表明, 纯化出的目的蛋白纯度大于 95%; 胰岛素二硫键还原法证实纯化出的 rhtrx 具有生物学活性结论 : 成功构建了 rhtrx 的原核表达体系, 建立了 rhtrx 的纯化和鉴定方法, 为其进一步的理论研究和生产开发提供了有效基础数据关键词重组人硫氧还蛋白 (rhtrx) 表达纯化生物活性中图分类号 Q786 硫氧还蛋白 (thioredoxin,trx) 是一个含有二硫键的相对分子质量为 2kDa,PI 为 4.82, 广泛存在于原核生物真核生物植物和哺乳动物中, 结构高度保守的小分子蛋白 [], 是细胞内进行氧化还原调节的主要分子之一, 具有抗氧化抗凋亡基因表达调控细胞因子样作用以及调控胚胎发育与衰老等多种生物学功能 [2] 研究发现 Trx 的水平活性与人类疾病特别是心血管系统疾病如动脉粥样硬化 [3 4], 缺血性心脏病 [5 7], 心肌肥大 [8] [8], 心肌炎关系密切已经证实外源性给予 Trx 可以减少心脏缺血 / 再灌注心律失常的发生, 抑制衰老相关的心肌肥大及纤维化, 改善肌球蛋白诱导的自身免收稿日期 : 修回日期 : 国家科技重大专项 (2009ZXJ ) 国家自然科学基金 ( ) 国家重大新药创制计划 (202ZX09J208 06B) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :lingtao2006@gmail.com 疫性心肌炎 [9] 目前国内外用于实验室及临床试验的 Trx 大都带有标签且仅限于实验室规模, 制作工艺难以扩大生产, 无法满足成药性评价这些都使 Trx 的应用受到限制本研究通过基因工程技术构建无标签重组人硫氧还蛋白 (recombinanthumanthioredoxin,rhtrx) 的大肠杆菌 BL2(DE3) 表达体系, 并建立相应的大规模发酵分离纯化及鉴定工艺, 旨在寻找简便易行经济有效地纯化和生产 htrx 的技术方案, 为今后的临床试验及大批量生产奠定切实可行的工艺流程基础材料与方法. 材料.. 菌株与细胞 E.coliBL2(DE3) 菌株,pET 22b (+) 载体均由第四军医大学生物技术中心馈赠 ; 人胚胎肾 HEK293 细胞株由本室冻存

202,32(8) 郭云萍等 : 无标签重组人硫氧还蛋白的大规模表达纯化及活性检测 63..2 引物合成据已报道的人 Trx 基因编码区序列 ( 基因登陆号为 GeneID:7295) 设计引物, 由北京华大基因公司合成上游引物 :5 GGAATTCCATATGGTGAAGCAGATC3, 下游引物 :5 GCGGATCCTTAGACTAATTCATTAA TGG3.

2 202,32(8) 郭云萍等 : 无标签重组人硫氧还蛋白的大规模表达纯化及活性检测引物合成据已报道的人 Trx 基因编码区序列 ( 基因登陆号为 GeneID:7295) 设计引物, 由北京华大基因公司合成上游引物 :5 GGAATTCCATATGGTGAAGCAGATC3, 下游引物 :5 GCGGATCCTTAGACTAATTCATTAA TGG3..3 主要试剂 DMEM 培养基胰蛋白酶购自 Gibco 公司 ; 质粒纯化试剂盒与核酸片段纯化试剂盒购自上海博亚公司 ; 限制性核酸内切酶 NdeⅠ 和 BamH Ⅰ T4DNA 连接酶 TaqDNA 聚合酶 DNAMarker 均购自 TaKaRa 公司 ; 蛋白 Marker 购自 Pharmacia 公司 ; 离子交换层析柱购自 GE 公司 ; 鼠抗人硫氧还蛋白单克隆抗体购于 Abcam 公司 ; 羊抗小鼠 IgG HRP 购自 Santa 公司 ; 硫氧还蛋白标准品, 硫氧还蛋白还原酶购自 Sigma 公司.2 方法.2. 重组质粒 pet 22b(+) Trx 的构建从 HEK293 细胞中提取总 RNA, 进行反转录反应合成 cdna, 通过 PCR 扩增获得基因编码区片段, 经 NdeⅠ 和 BamHⅠ 双酶切后连入 pet 22b(+) 载体中, 并转入 E.coliBL2(DE3) 细胞筛选阳性克隆, 提取质粒进行 PCR 及酶切和测序鉴定.2.2 rhtrx 的诱导表达取阳性克隆涂 LB(Amp + ) 平板, 挑取生长状态良好的单克隆, 接种于 LB(Amp + ) 液体培养基中,37 振荡过夜培养, 次日按 00 比例转接于新鲜 LB(Amp + ) 中,37 继续培养, 至细菌密度达到 OD 600 =0.4~0.6, 采用 5LBiostat CT5 自控发酵罐发酵, 调节通气流速搅拌转数以及溶氧, 当培养至 OD 600 =6.0~8.0 时加入终浓度为 mmol/l 的 IPTG, 诱导 4h 后收集菌体进行 SDS PAGE 和 Westernbloting 分析.2.3 rhtrx 的纯化取表达湿菌, 经冰浴超声裂菌后, 离心收集上清, 上清用 DEAESepharoseFastFlow 阴离子交换吸附目的蛋白,NaCl0.mol/L~0.35mol/L 线性梯度洗脱, 收集目的蛋白所在洗脱峰, 再经 SP SepharoseFastFlow 阳离子交换层析, 收集目的蛋白峰, 将其对 PBS 透析,Lowry s 法测蛋白质含量, 分装后 -80 保存备用.2.4 rhtrx 的 Westernbloting 分析 SDS PAGE 电泳后将胶上蛋白通过半干电转仪转移至 PVDF 膜上, 分别以鼠抗人 Trx 单克隆抗体作为一抗 ( 000 稀释 ) 羊抗小鼠 IgG HRP 作为二抗 ( 5000 稀释 ), 将 ECL 化学发光底物作用于 PVDF 膜上, 对 X 光片进行曝光显影和定影处理, 检测分析 Westernbloting 结果.2.5 rhtrx 的 HPLC 分析在柱温室温条件下, 用流动相 (20mmol/LTris HClpH8.0) 平衡色谱柱 TSK GELG2000SW( mm) 至基线平稳, 流速为 0.6 ml/min, 取 25μl 纯化的蛋白样品上样, 用流动相洗脱, 检测波长为 280nm, 记录并分析结果.2.6 rhtrx 的 MALDI TOF MS 分析用截留分子量为 3000Da 的超滤离心管对纯化的蛋白样品进行除盐浓缩,0.22μm 滤器过滤除菌后, 对其进行分子量测定.2.7 rhtrx 的体外生物学活性检测反应总体积为 ml, 加入总浓度为 0.3mmol/L 牛胰岛素,00mmol/L (ph7.0) 的磷酸钠缓冲液,6.0μmol/L 的重组蛋白, 室温孵育 30min, 然后加入二硫苏糖醇 (DTT) 至终浓度 mmol/l 启动反应,650nm 处每隔 min 测定一次光密度 (OD) 值 [0], 绘制反应曲线.3 统计学分析采用 SPSS3.0 软件进行统计学分析, 实验数据以 x±s 表示, 以 P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2. PCR 及酶切和序列测定 rhtrx 基因的 PCR 产物经 % 琼脂糖电泳检测, 在约 35bp 处可见特异性条带 ( 图 a), 该片段大小与预测结果一致用限制性内切酶 NdeⅠ 和 BamHⅠ 双酶切重组质粒 pet 22b(+) Trx, 在约 35bp 处可见 Trx 特异性条带 ( 图 b) 测序结果证实该特异性条带为序列正确的 rhtrx 基因, 说明重组质粒 pet 22b(+) Trx 构建成功 ( 图 2) 图 rhtrx 的 PCR 及酶切鉴定 Fig. TheidentificationofrhTrxbyPCRand digestionofrestrictionenzymes (a)agarosegelelectrophoresisofpcrproduct :PCRproductsof rhtrx;2:dnamarkerdl2000 (b)electrophoresisresultofrhtrx digestedbyndeⅠ /BamHⅠ :NdeⅠ /BamHⅠ doubleenzyme digestion;2:dnamarkerdl2000

64 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.32No.8202 mol/l 时被洗脱 ( 图 4b), 收集洗脱峰作 2%SDS PAGE 电泳, 显示所纯化蛋白呈单一条带 ( 图 5) 图 2 重组质粒 pet 22b(+) rhtrx 的测序结果图 Fig.

0( 约发酵开始 6h) 时, 重组菌的细胞增殖进入快速分裂增殖期, 此时是加入诱导剂的最佳时间 SDS PAGE 结果表明 ( 图 3b),IPTG 诱导重组菌 4h 后, 在 2kDa 处有明显的新生条带出现图 4 rhtrx 的离子层析图 Fig.

peak;2:targetpeak 图 3 rhtrx 诱导表达结果图 Fig.

/pet 22b(+) TrxafterIPTG inductionforone hour;4:totalprotein ofbl 2 /pet 22b(+) Trx afteriptg 图 5 rhtrx 纯化结果的 SDS PAGE 分析 Fig.

3 64 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.32No.8202 mol/l 时被洗脱 ( 图 4b), 收集洗脱峰作 2%SDS PAGE 电泳, 显示所纯化蛋白呈单一条带 ( 图 5) 图 2 重组质粒 pet 22b(+) rhtrx 的测序结果图 Fig.2 Sequencinganalysisofrecombinant plasmidpet 22b(+) rhtrx 2.2 rhtrx 的表达研究结果显示 ( 图 3a), 在 37 培养时细菌密度随发酵时间变化, 当培养至 OD 600 =6.0~8.0( 约发酵开始 6h) 时, 重组菌的细胞增殖进入快速分裂增殖期, 此时是加入诱导剂的最佳时间 SDS PAGE 结果表明 ( 图 3b),IPTG 诱导重组菌 4h 后, 在 2kDa 处有明显的新生条带出现图 4 rhtrx 的离子层析图 Fig.4 IonchromatographyofrhTrx (a)deaesepharosefastflowchromatographyofsupernatantof bacteriallysate :Through peak;2:targetpeak (b) SP SepharoseFastFlow chromatographyofcrudeproduct:through peak;2:targetpeak 图 3 rhtrx 诱导表达结果图 Fig.3 TheexpresionofrhTrx (a)efectsofculturetimeonrhtrx (b)2%sds PAGEanalysis ofproteinexpresionbymmol/liptg :Proteinmarker;2:Total proteinofbl 2 /pet 22b(+) TrxbeforeIPTGinduction;3:Total proteinofbl 2 /pet 22b(+) TrxafterIPTG inductionforone hour;4:totalprotein ofbl 2 /pet 22b(+) Trx afteriptg 图 5 rhtrx 纯化结果的 SDS PAGE 分析 Fig.5 SDS PAGEanalysisofrhTrxpurification :Proteinmarker;2:Supernatantofbacteriallysate;3:Targetpeak ofdeaesepharosefastflowchromatography;4:targetpeakofsp SepharoseFastFlowchromatography 2.4 rhtrx 的 Westernbloting 分析进一步的 Westernbloting 试验结果显示 ( 图 6), 上述制备的重组蛋白能与鼠抗人 Trx 单克隆抗体特异性结合, 并在与理论分子量 (~2kDa) 相符的位置显示单一条带 inductionfortwohour;5:totalproteinofbl 2 /pet 22b(+) Trx afteriptginductionfor3h;6:totalproteinofbl 2 /pet 22b(+) TrxafterIPTGinductionfor4h 2.3 rhtrx 的纯化超声裂菌后的 rhtrx 以可溶形式存在, 经 DEAE SepharoseFastFlow 层析柱层析, 重组蛋白在 NaCl 洗脱浓度为 0.24mol/L 时被洗脱 ( 图 4a) 收集洗脱峰进行 2%SDS PAGE 电泳 ( 图 5), 结果显示仅经过一步离子交换即可去除大部分杂蛋白再经 SPSepharoseFast Flow 层析柱层析, 重组蛋白在 NaCl 洗脱浓度为 0.68 图 6 rhtrx 的免疫印迹鉴定 Fig.6 Westernblotinganalysisofpurifiedprotein :Protein marker; 2 ~ 3:Purified protein of rhtrx (low concentration:5μgoftotalprotein);4~5:purifiedproteinofrhtrx (medium concentration:0μgoftotalprotein);6~8:purified proteinofrhtrx(highconcentration:5μgoftotalprotein)

4 202,32(8) 郭云萍等 : 无标签重组人硫氧还蛋白的大规模表达纯化及活性检测 rhtrx 的 HPLC 分析上述色谱条件下,rhTrx 的 HPLC 分析中出现一个面积百分比占 96.3% 的峰, 显示其纯度为 96.3%, 色谱图见图 7 图 9 rhtrx 室温下还原二硫键的 OD 650 值 Fig.9 TheOD 650 readingsforthereduction 图 7 rhtrx 的 HPLC 纯度鉴定 Fig.7 IdentificationofrhTrxonHPLC 2.6 rhtrx 的 MALDI TOF MS 分析质谱分析测得 rhtrx 的 Mr 为 735.0, 与理论分子量相近 ( 图 8) 图 8 rhtrx 的 MALDI TOF MS 分析 Fig.8 MALDI TOF MSanalysisofrhTrx 2.7 rhtrx 的体外生物学活性检测绘制本方法纯化出的 rhtrx 标准品 Trx 和空白对照三组胰岛素二硫键还原曲线 ( 图 9) 结果表明, 空白对照组较本方法纯化出的 rhtrx 组和标准品 Trx 组胰岛素二硫键还原能力明显减弱 (P<0.05), 本方法纯化出的 rhtrx 组和标准品 Trx 组无明显差异 (P>0.05), 证实了我们获得了与标准品 Trx 活性相当的 rhtrx 3 讨论正确克隆出目的基因是研究的基础, 高效表达相关蛋白是重组的关键, 高效表达重组蛋白需要选择合适的载体, 本研究在制备 rhtrx 的过程中, 载体的选择方面综合考虑了表达载体宿主菌株表达诱导条件等 3 大因素, 经反复摸索最终选择了具有严密的表达调控, 更低的渗漏表达特性的 pet 22b(+) 表达载体重组质粒 pet 22b(+) rhtrx 的高密度培养是增 ofinsulincatalyzedbythepurifiedrhtrx ComparedwiththerhTrxgroupandthecontrolgroup,P<0.05 加重组蛋白产率的最有效的方法, 高密度发酵在增加菌密度的同时提高蛋白的表达量, 从而有利于简化下游的纯化操作本研究中, 以实验室研究的生产工艺为基础, 采用 5L 发酵罐, 对培养基培养方式发酵条件控制等多种因素进行优化 [ 2], 建立了最佳的发酵工艺, 发酵获得菌体的产量为 80g/5L 左右目的蛋白表达量 >0% 建立了工程菌的高密度高表达发酵工艺, 工程菌目的蛋白的表达量高于三角摇瓶获得的目的蛋白的表达量, 为进一步中试生产提供了可能性对于 rhtrx 的纯化, 本着纯化工艺的基本原则 : 以最简单的技术最少的步骤最高的回收率最低的成本生产合格的产品由于没有单一的策略或条件是适用于所有目标蛋白的 [3 4], 所以对纯化条件进行优化选择是必须的由于离子层析具有开放性支持骨架, 大分子可以自由进入和迅速扩散, 吸附容量大 ; 并且具有亲水性, 对大分子的吸附不大牢固, 用温和的条件便可以洗脱, 不至引起蛋白质变性或酶的失活 ; 还具有多孔性, 可重复, 回收率高, 灵敏度高, 选择性好, 分离速度快等优点, 故经反复摸索最终采用了两步离子交换层析纯化蛋白的简便方法, 从而大大节省实验投入, 为今后此种蛋白的中试生产节省时间和成本对于 rhtrx 的体外生物学活性检测采用了浊度法, 由于 Trx 可被二硫苏糖醇 (DTT) 还原, 且还原型的 Trx 可以使胰岛素 α 链和 β 链间的二硫键还原成游离的 α β 两条链, 而 β 链的溶解度差, 可以使透明的反应液变混浊, 并在 650nm 处有强烈的光吸收 [5] 我们采用此方法检测了 rhtrx 的活性反应曲线, 证实本实验纯化的 rhtrx 具有二硫键还原酶活性, 可以应用于功能研究

5 66 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.32No.8202 本研究成功构建表达和纯化出了具有生物学活性的 rhtrx, 具有在原核细胞高效表达, 分离纯化简单, 合成成本低, 操作工艺程序化, 易于放大, 取材不受限制和活性高等优点, 为今后大批量生产打下了坚实的基础参考文献 []AhsanM K,LekliI,RayD,etal.Redoxregulationofcel survivalbythethioredoxinsuperfamily:animplicationofredox genetherapyintheheart.antioxidredoxsignal,2009,(): [2] Burke GafneyA,CalisterM E,NakamuraH.Thioredoxin: friendorfoe in human disease? Trendsin Pharmacological Sciences,2005,26(8): [3]ShiojiK,NakamuraH,MasutaniH,etal.Redoxregulationby thioredoxinin cardiovasculardiseases. Antioxidants Redox Signaling,2003,5(6): [4] YamawakiH,HaendelerJ,BerK B C.Thioredoxin:akey regulatorofcardiovascularhomeostasis. Circulation Research, 2003,93(): [5]TaoL,GaoE,BryanN S,etal.Cardioprotectiveefectsof thioredoxininmyocardialischemiaandreperfusion:roleofs nitrosation[corected].proceedingsofthenationalacademyof SciencesoftheUnitedStatesofAmerca,2004,0(3): [6] YamawakiH, BerK B C. Thioredoxin:a multifunctional antioxidantenzymeinkidney,heartandvesels.curentopinion innephrologyandhypertension,2005,4(2): [7]BerndtC,LiligCH,HolmgrenA.Thiol basedmechanismsof thethioredoxinandglutaredoxinsystems:implicationsfordiseases inthecardiovascularsystem.americanjournalofphysiology, 2007,292(3): [8]AgoT,SadoshimaJ.Thioredoxinandventricularremodeling. JournalofMolecularandCelularCardiology,2006,4(5): [9]NakamuraH.Thioredoxinanditsrelatedmolecules:update2005. Antioxidants RedoxSignaling,2005,7(5 6): [0]AnnaDF,RosaM,EmiliaP,etal,High levelexpresionof AliciclobacilusacidocaldariusthioredoxininPichiapastorisand Bacilussubtilis.ProteinExprPurif,2003,30: [] Khalilzadeh R, ShojaosadatiSA, BahramiA, etal. Over expresionofrecombinanthumaninterferon gammainhighcel densityfermentationofescherichiacoli.biotechnollet,2003,25 (23): [2]TabandehF,ShojaosadatiSA,ZomorodipourA,etal.Heat inducedproductionofhumangrowthhormonebyhighceldensity cultivationofrecombinantescherichiacoli.biotechnollet,2004, 26(3): [3] WolmanE E,d AuriolL,RimskyL,etal.Cloningand expresionofacdnaforhumanthioredoxin.journalofbiological Chemistry,988,263(30): [4]Miranda VizueteA,DamdimopoulosA E,GustafsonJ,etal. Cloning,expresionandcharacterzationofanovelEscherichiacoli thioredoxin.journalofbiologicalchemistry,997,272(49): [5]ReckenfelderbaumerN, Ludemann H, SchmidtH, etal. Identificationandfunctionalcharacterizationofthioredoxinfrom Trypanosomabrucei.JournalofBiologicalChemistry,2000,275 (): Expresion,PurificationandCharacterizationofNon taged RecombinantHumanThioredoxin GUOYun ping SUNLu ZHANGLi jian WANGZeng lu 2 GAOChao YANGQiang LIUYi ZHANGYing qi 2 QUYan TAOLing (DepartmentofCardiology,XiJingHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi an 70032,China) (2BiotechnologyCenter,SchoolofPharmacy,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi an 70032,China) Abstract Objective:Toconstructprokaryoticexpresionsystemformasproductionofrecombinanthuman thioredoxinand establish thepurification procesofthioredoxin. Methods: TotalRNA wasextracted from HEK293(humanembryonickidneycels).ThethioredoxincodingsequencewassubclonedintothepET 22b

6 202,32(8) 郭云萍等 : 无标签重组人硫氧还蛋白的大规模表达纯化及活性检测 67 (+)vectorafteramplifiedbypcr.therecombinantplasmidsweretransformedintoe.colibl2(de3),and thethioredoxinwasexpresedwithiptg induction.theexpresedthioredoxinwaspurifiedbytwo stepion exchangechromatographyandtestedbysds PAGE,Westernbloting,MALDI TOF M,HPLC,andinsulin disulfidereductionasayforidentification,purityasayandactivitydetermination,respectively.results:gene sequencingdemonstratedthatthioredoxincodingsequencewasclonedintopet 22b(+)vectorsuccesfuly.The prokaryoticexpresionsystemachievedhighyieldofthioredoxin(80mg/5loffermentationbroth),whichwas identifiedbywesternblotingandmaldi TOF MS,withanestimatedthemolecularweightof2000.The purityofthioredoxinismorethan95%.theactivityofpurifiedthioredoxinhadthesameactivityasthestandard control.conclusion:theprokaryoticexpresionsystem couldachievemasproductionofrecombinanthuman thioredoxin,whichcanbehighlypurifiedbytwo stepsionexchangechromatography.thispreliminarystudy providesthefoundationforthelarge scaleindustrialproductionofthioredoxin. Keywords Recombinanthumanthioredoxin Expresionandpurification Biologicalactivity

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽

202,32(8) 郭云萍等 : 无标签重组人硫氧还蛋白的大规模表达 纯化及活性检测 引物合成据已报道的人 Trx 基因编码区序列 ( 基因登陆号为 GeneID:7295) 设计引物, 由北京华大基因公司合成 上游引物 :5 GGAATTCCATATGGTGAAGCAGATC3, 下游

202,32(8) 郭云萍等 : 无标签重组人硫氧还蛋白的大规模表达纯化及活性检测引物合成据已报道的人 Trx 基因编码区序列 ( 基因登陆号为 GeneID:7295) 设计引物, 由北京华大基因公司合成上游引物 :5 GGAATTCCATATGGTGAAGCAGATC3, 下游