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1 25 临床百科 DOI: /j x 清热解毒制剂宫颈用药对 HPV 感染者局部免疫因子变化的影响 陶萍萍 1, 周庆华 1, 杨玉梅 1, 郑伟平 2, 王运根 2 1, 杨宾烈 1. 上海市浦东新区人民医院 ( 上海 ) 2. 浙江大学绍兴医院 ( 浙江绍兴 ) 摘要 目的 : 观察清热解毒制剂宫颈用药对人乳头状瘤病毒 (HPV) 感染者的临床疗效及对局部免疫因子的影响 方法 : 将高危型人乳头状瘤病毒 (HR HPV) 持续感染而无宫颈组织学病变患者 100 例随机分为治疗组和对照组, 治疗组以中药清热解毒制剂宫颈局部上药处理, 对照组仅随访观察 采用酶联免疫法 (ELISA) 测定入组时及随访 6 12 个月时两组患者宫颈局部环境中 γ 干扰素 (IFN γ) 及白介素 4(IL 4) 的水平 ; 随访 6 12 个月复查 HR HPV 及宫颈液基细胞 (TCT), 以 HPV 清除率为指标评价临床疗效 结果 : 与入组时比较, 随访期间两组患者宫颈局部环境中 IFN γ 水平均明显升高,IL 4 水平均明显下降,IFN γ/il 4 均明显升高 (P<0.01), 其中治疗组各指标与对照组同期比较均有显著性差异 (P<0.05 或 P<0.01); 在随访期间, 治疗组 6 个月时的 HPV 转阴率明显高于对照组 (P<0.01), 随访 12 个月时治疗组仍优于对照组 (P<0.05) 在随访 6 和 12 个月时,HPV 清除者的 IFN γ 水平和 IFN γ/il 4 均明显高于未清除者 (P<0. 01), 而 IL 4 的水平明显低于未清除者 (P<0.01); 所有患者在治疗过程中均无严重不良反应 结论 : 清热解毒制剂宫颈局部上药可清除 HPV 感染, 且安全有效 ; 其作用可能与上调 IFN γ 表达 下调 IL 4 表达, 扭转 IFN γ/il 4 比值有关 关键词 高危型人乳头状瘤病毒 ; 清热解毒 ; 免疫因子 ;γ 干扰素 ; 白介素 4 宫颈癌是感染性疾病, 几乎所有宫颈癌患者都与高危型人乳头状瘤病毒 (HR HPV) 有关 [1] 虽然 90% 人乳头状瘤病毒 (HPV) 感染可在首次发现的 2 年内自然清除, 但 HPV 持续感染者清除率明显下降, 疾病进展风险增加 [2 3] 近年的研究表明,HPV 未清除者进展到宫颈上皮内瘤变 Ⅱ 级 (CINⅡ) 或更高级别病变者占 39.1%, 因此有必要对 HPV 持续感染者进行适当干预 [4] HR HPV 的清除与机体免疫状态密切相关, 目前关于宫颈局部微环境中辅助性 T 细胞 (Th) 亚群失衡的研究越来越受重视, 且有研究表明机体 Th1/Th2 平衡失调, 可介导肿瘤免 [ 基金项目 ] 上海市浦东新区卫生系统重点专科项目 (PWZz ); 上海市浦东新区卫生系统学科带头人培养项目 (PWRD ) [ 作者简介 ] 陶萍萍, 女, 硕士, 副主任医师, 主要从事妇产科临床研究 [ 通讯作者 ] 杨宾烈, 主任医师, 硕士生导师 ; E mail:tpp001@sina.com 疫逃逸及细菌 病毒等微生物的感染 [5 7] 本课题组在前期研究已发现清热解毒燥湿中草药宫颈局部应用可加快 HPV 病毒的清除, 促进宫颈病变消退, 加快 Leep 术后残留病毒的清除及病变的消退 [8] 为此, 本研究拟从免疫学角度观察清热解毒制剂宫颈用药对 HR HPV 持续感染者阴道灌洗液中 Th1 相关细胞因子水平的影响, 并探讨其可能的作用机制 1 资料与方法 1.1 研究对象所有病例均为 2013 年 5 月 ~2015 年 4 月间就诊于上海市浦东新区人民医院及浙江大学绍兴医院妇科门诊的 HR HPV 持续感染者, 共 100 例 用随机数字表法分为治疗组与对照组, 每组各 50 例 治疗组年龄 30~50 岁, 其中 30~39 岁 26 例 40~50 岁 24 例 ; 对照组年龄 30~48 岁, 其中 30~39 岁 31 例 40~50 岁 19 例 经卡方检验两组患者的年龄构成比无统计学显著差异 (P<0.05), 具有可比性

2 26 ACTAUNIVERSITATISTRADITIONISMEDICALISSINENSISPHARMACOLOGIAEQUESHANGHAIVol.30No.6Nov., 纳入标准 病例采集需符合以下条件 :1 有性 于月经干净后 3~7d 内留取 方法如下 : 充分暴露 生活女性, 年龄 30~50 岁 ;2HPV 分型检测高危型阳性, 持续 1 年及以上 ;3 经宫颈三阶梯诊断明确无宫颈癌前病变及宫颈癌 ;4 已阅读受试者须知, 愿意按照方案予以合作, 经医院伦理委员会批准, 并签署知情同意书 同时排除 : 合并生殖器官器质性疾病者, 妊娠或哺乳期妇女, 生殖器急慢性炎症及免疫功能低下者 ( 如患有各种免疫性疾病 艾滋病 恶性肿瘤 长期使用免疫抑制剂或者皮质类固醇激素 ) 宫颈口, 用体积为 5ml 灭菌生理盐水冲洗宫颈口及宫颈表面, 于后穹窿吸出体积约为 4ml 的灌洗液, 混匀后分装入 2 个 1.5ml 无菌 EP 管中, 将灌洗液离心后取上清, 并在 4h 内将上清液冻于 -80 冰箱保存备用 用酶联免疫吸附法 (ELISA) 检测上清液中 γ 干扰素 (IFN γ) 和白介素 4(IL 4) 的含量, 操作方法严格按照试剂盒的说明 IFN γelisa 试剂盒为美国 R&D 公司产品,IL 4ELISA 试剂盒为奥地利 Biosource 公司产品 以 IFN γ/il 4 的比值 1.3 治疗方法 治疗组以中药清热解毒制剂宫颈 为 Th1/Th2 [9] 局部上药处理, 对照组仅随访观察 清热解毒中药 临床疗效评价 以 HPV 清除率为评价指 制剂主要成份为白花蛇舌草 苦参 鸦胆子 大青叶 黄柏等, 为高浓缩药液, 可安全用于皮肤和黏膜, 由北京派特博恩生物技术开发有限公司提供 标 复查 HPV 如转阴, 为清除 ; 如有 HR HPV 阳性, 不管细胞学诊断如何, 均为未清除 如原 HR HPV 转阴, 但出现新的感染亚型, 也为未清除 ( 专利号 :ZL ) 经专门培训的技术 1.5 统计学方法 所有患者观察数据由专人录入, 人员负责上药, 上药范围包括宫颈管 ; 要求患者坚持全程规范治疗, 并做好记录 用药期间禁止坐浴及性生活, 经期停药 ; 全程密切观察有无不良反应 1.4 检测项目与方法 核实无误后用 SPSS12.0 软件进行统计分析 计量资料用 x±s 表示, 组间比较采用方差分析 ; 计数资料用率 (%) 表示, 采用卡方检验 以 P<0.05 为差异有统计学意义 HPV 分型检测及宫颈三阶梯诊断与随访用凯普导流杂交法分型检测 21 种 HPV 亚型, 包括 2 结果 下列高危型 : 对免疫因子 IFN γ 和 IL 4 的影响 纳入观察 CP8304, 确定其中任何一种阳性者 ( 不包括多重感染 ) 为 HR HPV 感染 ; 随访 1 年后复测, 同一 HPV 亚型阳性为持续感染 同时行宫颈液基细胞 (TCT) 检查, 以细胞学非典型鳞状上皮细胞 (ASC US) 以上者为异常 ; 行阴道镜检查及活检组织病理学检查, 排除宫颈癌前病变及宫颈癌 如 HR HPV 阳性而细胞学正常, 或 HR HPV 阳性 细胞学异常, 但组织病理学无异常, 则进入研究 于治疗或入组后 6 12 个月复查 HR HPV 及 TCT 的两组患者, 在随访期间宫颈局部环境中 IFN γ 水平均持续上升 IL 4 水平持续下降, 相应的 IFN γ 与 IL 4 的比值均持续升高, 其中治疗组各指标与对照组同期比较均有显著性差异 (P<0.05 或 P<0.01) 与入组时比较, 除对照组 6 个月时的 IL 4 水平无显著性差异 (P>0.05) 外, 随访 6 个月 12 个月时两组的其余各指标差异均有统计学意义 (P<0.01); 与随访 6 个月时比较,12 个月时治疗组的 IFN γ IL 4 水平及 IFN γ/il 4 比值, 对照组的 IFN γ 水平及 免疫因子检测 于入组时及治疗后 6 12 个 IFN γ/il 4 比值, 均有显著性差异 (P<0.01) 见 月采集宫颈阴道灌洗液进行免疫因子检测 一般 表 1 表 1 两组患者宫颈局部环境中 IFN γ 和 IL 4 水平比较 (x±s) 组 别 n 随访时间 IFN γ(ng/l) IL 4(ng/L) IFN γ/il 4 50 入组时 6.58± ± ±0.03 治疗组 49 6 个月 12.11±4.25 ## 47.98±11.32 ## 0.27±0.12 ## 个月 15.01±3.66 # 41.28±13.58 ## 0.41±0.14 ## 50 入组时 7.11± ± ±0.13 对照组 48 6 个月 9.08± ± ± 个月 13.03± ± ±0.13 注 : 治疗组有 1 例因阴道炎中断治疗,2 例在 12 个月时失访 ; 对照组有 2 例在 6 个月时失访,3 例在 12 个月时失访 与入组时比较, P<0.01; 与随访 6 个月时比较, P<0.01; 与对照组同期比较,#P<0.05,##P<0.01

3 临床疗效评价在随访期间, 治疗组 6 个月时的 HPV 转阴率明显高于对照组, 两组比较有显著性差异 (P<0.01); 随访 12 个月时, 治疗组仍优于对照组 (P<0.05) 见表 HPV 清除与未清除患者 IFN γ/il 4 变化无论在随访 6 个月还是 12 个月时, 两组 HPV 清除者的 IFN γ 水平 IFN γ/il 4 比值均明显高于未清除者,IL 4 水平明显低于未清除者, 差异均有统计 表 3 HPV 清除与未清除患者免疫因子变化情况比较 (x±s) 学意义 (P<0.01) 见表 3 表 2 两组患者随访不同时间 HPV 转阴率比较 组 别 n 随访时间 阳性 ( 例 ) 阴性 ( 例 ) 转阴率 (%) 治疗组 49 6 个月 ## 个月 # 对照组 48 6 个月 个月 注 : 与对照组同期比较,#P<0.05,##P<0.01 随访时间 n 清除与否 IFN γ(ng/l) IL 4(ng/L) IFN γ/il 4 6 个月 12 个月 42 清除 15.19± ± ± 未清除 7.04± ± ± 清除 16.26± ± ± 未清除 7.72± ± ±0.02 注 : 与 未清除 者比较, P< 不良反应评价治疗组 50 例中有 1 例用药后出现阴道灼烧感, 检查发现合并阴道炎, 停药后无不适感, 自愿终止观察 ;2 例宫颈局部上药初期出现外阴局部轻微刺痛 灼热感, 检查局部未见皮肤 黏膜破损, 休息 1 周后继续治疗, 症状缓解 所有患者在治疗过程中均无严重不良反应 3 讨论 HPV 导致宫颈癌的确切病因目前仍不清楚, 但机体不能建立起有效的免疫反应被认为是导致 HR HPV 持续性感染的重要因素 [10] HIV 阳性的患者, 其 HPV 感染及患高级别宫颈上皮内瘤变的危险度显著提高 [11], 佐证了机体免疫机制对于 HPV 清除的重要性 HR HPV 持续感染者是宫颈疾病进展的高危人群, 本研究正是以 HPV 感染时间 1 年的持续感染者为研究对象 宫颈局部免疫微环境在 HPV 感染结局中发挥关键作用 研究发现, 在 HPV 自行清除患者体内, 存在大量的 HPVE2 E6 特异性 T 细胞 [12] Thl 型细胞因子富集与清除 HPV 感染密切相关 [13],HPV 持续感染时存在 Th1 免疫应答受损 Th1/Th2 细胞亚群失衡且向 Th2 方向漂移, 造成细胞免疫抑制状态而不利于病毒清除 [6 7] ; 而 HPV16E6 E7 蛋白可以降低 Th1 型细胞因子在宿主细胞中的表达 [14] IFN γ 被视为最好的 Th1 型免疫调节细胞因子, 能减缓正常细胞发展成为肿瘤细胞 [15] IFN γ 升高有助于 HPV 清除, 在一过性及持续性 HPV 感染妇女宫颈黏液中 IFN γ 含量前者显著升高 [5] IFN γ 分泌下降与 HPV 持续感染密切相关, 并促使其向高级别 CIN 和宫颈癌发展 在与 HPV 感染有关的宫颈浸润癌和 CIN 女性患者中, 血液中的 IFN γ 浓度显著下降 [16] 而 IL 4 是一种促肿瘤细胞生长因子, 并且可以促进 Th0 细胞向 Th2 细胞分化, 可单独维持 Th2 细胞的增殖 [17] [18] Saleh 等发现, 随着 CIN 病变程度的增加,IL 4 阳性细胞的浓度相应升高 Th2 细胞产生大量的 IL 4 可以启动肿瘤细胞产生 IL 10, 与此同时 IL 4 IL 10 可以抑制 IL 12 对 Th1 细胞分化的促进作用 [19] 近年, 中医药在 HPV 感染防治方面的相关性研究已经成为热点之一 笔者先期研究发现, 清热解毒制剂宫颈局部应用可以加快 HPV 病毒的清除, 缩短 HPV 感染持续时间 [8] ; 也有报道认为中医药干预能促进宫颈病变消退, 加快 Leep 术后残留病毒的清除及病变的消退 [20 23], 但对宫颈局部免疫的影响未见文献报道 本研究选择 IFN γ IL 4 分别作为 Th1 Th2 代表因子, 运用 ELISA 法对阴道灌洗液 IFN γ IL 4 浓度进行检测, 更能直观了解宫颈局部免疫环境的改变 比较宫颈局部上药前后上述因子的变化, 发现上药后 6 12 个月阴道宫颈局部 IFN γ 水平与治疗前比较均升高,IL 4 含量呈下降趋势, IFN γ/il 4 比值明显升高 ; 同时发现在随访 6 和 12 个月时, 治疗组患者宫颈局部环境中 IFN γ 水平均高于对照组,IL 4 水平低于对照组, 相应的 IFN γ/ IL 4 高于对照组 上述结果同时表明 : 中药制剂宫颈局部治疗可使阴道微环境中 IFN γ 分泌增加,IL 4 含量下降,Th1/Th2 升高 推测宫颈局部上药可

4 28 ACTAUNIVERSITATISTRADITIONISMEDICALISSINENSISPHARMACOLOGIAEQUESHANGHAIVol.30No.6Nov.,2016 能通过调节 Th1/Th2 的功能失衡, 使其向 Th1 倾斜而增加 HPV 清除率, 与文献报道一致 [9] 研究同时发现, 对照组虽未经任何处理, 但在随访 6 12 个月时 IFN γ 水平 IFN γ/il 4 比值均值逐渐上升, 可能与随访过程中部分患者 HPV 自动清除有关 HPV 的清除, 伴随着 IFN γ 水平的升高,Th1/Th2 平衡向 Th1 倾斜 为进一步比较 HPV 清除与未清除患者上述指标的变化差异, 笔者将研究对象分为 HPV 清除组与未清除组, 发现无论在随访 6 个月和 12 个月时,HPV 清除患者 IFN γ 水平 IFN γ/il 4 比值均明显高于对照组, 而 IL 4 水平则明显低于对照组, 进一步证实了 HPV 清除伴随着 Th1/Th2 平衡向 Th1 的倾斜 清热解毒中药制剂的主要成分为白花蛇舌草 苦参 大青叶 黄柏 鸦胆子油等 现代药理研究发现, 大青叶 苦参 蛇床子具有强效的抗菌 抗病毒作用, 可干扰 阻止 HPV 的 DNA 合成, 抑制病毒生长与繁殖, 同时具有清热解毒 活血化瘀 提高和激发皮肤免疫的作用 ; 鸦胆子油乳对癌细胞具有较强的亲和力, 具有选择和靶向性, 能干扰癌细胞的能量代谢, 使癌细胞发生退行性变与坏死, 对体液免疫和细胞免疫都有促进作用 该制剂能选择性破坏细胞膜和线粒体等膜性系统, 抑制细胞增殖, 对感染的 HPV 有很好的抑制作用 ; 同时有表皮剥脱作用可使寄生在表皮细胞内的 HPV 病毒来不及复制繁殖就随着细胞脱落而被彻底清除 [8] 本研究提示, 清热解毒制剂宫颈局部上药可增加 HPV 清除率, 其机制可能与上调 Th1 免疫因子 IFN γ 表达 下调 Th2 免疫因子 IL 4 的表达, 从而使 Th1/Th2 平衡向 Th1 方向倾斜有关 参考文献 : [1] 周晖, 卢淮武, 彭永排, 等.2015 年 NCCN 宫颈癌临床实践指南 [J]. 中国实用妇科与产科杂志,2015,3(3): [2]WoodmanCB,ColinsS,WinterH,etal.Naturalhistoryofcervical humanpapilomavirusinfection in youngwomen:alongitudinal cohortstudy[j].lancet,2001,357(9271): [3]QinGY,TaoMF.StudyonDetecttheNaturalClearanceRateof High oncogenicriskhumanpapilomavirusincervicaldormant [J].ChineseJournalofClinicalMedicine,2011,18(3): [4]KimJW,SongSH,JinCH,etal.FactorsAfectingtheClearanceof HighriskHumanPapilomavirusInfectionandtheProgresionof CervicalIntraepithelialNeoplasia[J].TheJournalofInternational MedicalResearch,2012,40(2): [5]TeleshevaLF,DolgushinaVF,AbramovskikhOS,etal.Cytokine statusofcervicalmucusinwomenwithtransitoryandpersistent courseofpapilomavirusinfection[j]. Zh MikrobiolEpidemiol Immunobiol,2012(4): [6]XuY,Zhu KJ,Zhu N.Expresion offoxp3 + CD4 + CD25 + regulatorytcelsandth1/th2,tc1/tc2profilesintheperipheral blood ofpatientswith condyloma acuminatum[j]. Clin Exp Dermatol,2009,34(2): [7] 陆继红, 熊苗, 杨宾烈, 等. 诱骗受体 3 在宫颈上皮内瘤变及子宫颈癌中的表达及临床意义 [J]. 中国妇产科杂志,2012,47(2): [8] 陶萍萍, 寿清和, 王运根, 等. 派特灵对宫颈高危型人乳头瘤病毒感染转归的影响 [J]. 国际流行病学传染病学杂,2014,41 (1): [9] 徐又先, 袁林. 从 Th1/Th2 角度探讨二黄散对伴有 HPV 感染的 CIN 患者宫颈局部微环境影响 [J]. 辽宁中医杂志,2016,43 (5): [10]Leigh IM, Glover MJ. Cutaneous warts and tumours in immunosuppresedpatients[j].jr SocMed,1995,88(2) : [11]VermundSH,KeleyKF,KleinRS,etal.Highriskofhuman papilomavirusinfection and cervicalsquamousintraepithelial lesionsamongwomenwithsymptomatichumanimmunodeficiency virusinfection[j].am JObstetGynecol,1991,165 (2): [12]WeltersMJ,deJongA,vandenEedenSJ,etal.Frequentdisplay ofhumanpapilomavirustype16e6 specificmemoryt Helpereel Isinthehealthypopulationaswitnesofpreviousviralencounter [J].CancerRes,2003,63(3): [13]ScotM,StitesDP,MoscickiAB.Thlcytokinepaternsincervical humanpapilomavirusinfection[j].clindiagnlabimmunol, 1999,6(5): [14]SasagawaT,TakagiH,MakinodaS.Immuneresponsesagainst humanpapilomavirus(hpv)infectionandevasionofhostdefense incervicalcancer[j].infectionandchemotherapy,2012,18(6): [15]GatoniA,ParlatoA,VangieriB,etal.Interferon gamma:biologic functionsandhcvtherapy(typei/i)[j].clinter,2006,157 (4): [16]BaisAG,BeckmannI,LindemansJ,etal.Ashifttoaperipheral Th2 typecytokinepaternduringthecarcinogenesisofcervical cancerbecomesmanifestincin Ilesions[J].JClinPathol, 2005,58(10): [17]WangHW,JoyceJA.Alternativeactivationoftumor asociated macrophagesbyil 4[J].CelCycle,2010,9(24): [18]SalehW,GianniniSL,JacobsN,etal.CorelationofT elper secretorydiferentiation and typesofantigen prsentingcelsin squamousintraepitheliallesions ofthe uterine cervix[j]. Pathology,1998,184(3): [19] 孙敬, 洪杰华, 郑世民.IL 12 及其免疫调节作用 [J]. 动物医学进展,2010,31(2): [20] 陈锐, 赵健, 廖秦平. 派特灵治疗宫颈上皮内瘤变 1 2 级临床疗效观察 [J]. 中国实用妇科与产科杂志,2011,27(9):

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