66 分子诊断与治疗杂志 203 年 5 月第 5 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, May 203, Vol. 5 No. 3 3 天内不使用阴道内药物或对阴道进行冲洗 ; 2 24 小时内不应有性行为 ;3 检查应在非月经期内进行 ;4 检查前阴道不进行醋酸或碘液涂抹.2.2 标

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抛方
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1 分子诊断与治疗杂志 203 年 5 月第 5 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, May 203, Vol. 5 No 论著实时荧光定量 PCR 法与基因芯片法检测 HPV 的比较曾华刘晓强庄豪郑明慧 2 李烈军 [ 摘要 ] 目的比较基于 PCR 的基因芯片方法和实时荧光定量 PCR 方法检测女性子宫颈脱落细胞 HPV DNA 的相关性方法收集 2050 份样本采用基因芯片法和实时荧光定量 PCR 方法进行比对试验, 两者结果不符的进行测序验证, 并对检测结果进行一致率及阳性率统计分析结果两种方法总一致率阳性一致率及阴性一致率都在 95.0% 以上 ; 荧光定量 PCR 法检测 HPV6 阳性率 50.0%,HPV8 阳性率 3.9% 结论两种方法检测的一致性良好, 本实验中所使用的新型 2+2 高危型人乳头状瘤病毒核酸检测试剂盒适合应用于育龄期妇女的宫颈癌筛查及随访 [ 关键词 ] 基因芯片法 ; 实时荧光 PCR;2+2 高危 HPV;2 分型 Real-time quantitative PCR and Gene-chip in detecting human papilloma virus ZENG Hua, LIU Xiaoqiang, ZHUANG Hao, ZHENG Minghui, LI Liejun 2 (.Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Yat-Sen University, Guangdong, Guangzhou 5020, China; 2.Chaozhou Hybribio Limited Corporation, Guangdong, Chaozhou 52000, China) [ABSTRACT] Objective To explore the correlation of HPV DNA test between gene-chip based on PCR technique and real-time fluorescent PCR in cervical exfoliated cells. Methods 2050 samples were measured by the gene-chip and real-time fluorescent PCR, which inconsistent results would be verified by sequencing, and statistical analysis of the consistent rate and positive rate. Results The total concordance rate, the positive concordance rate and the negative concordance rate of the two detection methods were more than 95.0%. The positive rate of HPV6 and HPV8 detected by fluorescence quantitative PCR method were 50.0% and 3.9%, respectively. Conclusion The consistence of two detection methods was good, and HPV2+2 type detection kit was suitable for application in the childbearing age women at risk of cervical cancer screening and follow-up. [KEY WORDS] Gene-chip; Real-time fluorescent PCR; High risk HPV2+2; 2 types 自 977 年,Laverty 在电镜中观察到宫颈癌活检组织中人乳头状瘤病毒 (human papilloma virus, HPV) 颗粒的存在 [], 目前, 已通过 DNA 检测技术发现 90% 以上的宫颈癌病人都存在 HPV 持续感染至今发现的 HPV 约有 00 多种, 根据 HPV 感染人体后可致宫颈癌的相关性, 分为低危型 HPV 以及高危型 HPV 研究表明 [2], 宫颈癌组织中 HPV6 和 HPV8 型感染率最高, 故本文对 2 型高危 HPV 进行定性检测, 同时定量检测 HPV6 HPV8 型材料和方法. 研究对象本研究对象为 20 年 4 月至 20 年 2 月在中山大学孙逸仙纪念医院妇科门诊和体检中心进行妇科检查的 2050 例女性患者年龄为 36.48±9.38 (x±s), 最小 7 岁, 最大 73 岁.2 样本采集.2. 标本采集要求作者单位 :. 中山大学孙逸仙纪念医院检验科, 广东, 广州潮州凯普生物化学有限公司, 广东, 潮州通讯作者 : 李烈军, ljli@hybribio.cn

2 66 分子诊断与治疗杂志 203 年 5 月第 5 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, May 203, Vol. 5 No. 3 3 天内不使用阴道内药物或对阴道进行冲洗 ; 2 24 小时内不应有性行为 ;3 检查应在非月经期内进行 ;4 检查前阴道不进行醋酸或碘液涂抹.2.2 标本采集及保存标本采集 : 由医生以窥阴器暴露宫颈, 用棉拭子将宫颈过多的分泌物擦去将宫颈刷置于宫颈口, 轻轻搓动宫颈刷使其顺时针旋转 3~5 圈慢慢取出宫颈刷, 将其放入装有细胞保存液的样品管中在管口处将多余的刷柄折断, 将刷头留在样品管中, 旋紧管盖, 做好标本标识并保持洗脱管直立放置送检验室检测标本保存 : 送检标本如不能马上送检, 存放于 4 保存, 并于 2 个星期之内进行检测.3 试剂及仪器使用试剂及仪器情况见表.4 检测方法.4. DNA 模板的准备取宫颈脱落细胞标本 0.5~ ml( 如果细胞数量少可以加大体积到 2 ml) r/min 离心 min 3 弃上清, 加入 0.5 ml 细胞保存液重悬细胞 r/min 离心 min, 尽量弃干净上清 5 每样本加入 50μL 细胞裂解液, 充分振荡重悬细胞, 煮沸 0 min r/min 离心 0 min, 保留上清备用 ( 上清中为释放的 DNA).4.2 实时荧光 PCR 检测用提取的 DNA 作为模板在 ABI7500 上扩增, 严格按照说明书操作.4.3 基因分型检测采用 HPV 分型检测试剂盒 (PCR+ 膜杂交法 ) 检测 2 种 HPV 基因型用提取的 DNA 作为模板在 ABI9600 PCR 仪上扩增, 之后将 PCR 产物在 HybriMax 医用核酸分子快速杂交仪 HHM-2I 完成杂交分型.4.4 测序对于荧光定量 PCR 法和基因芯片法检测结果不一致的样本, 将 PCR 产物及相应测序引物交英潍捷基 ( 上海 ) 贸易有限公司进行 DNA 序列测定, 并以测序法结果作为金标准.5 统计学处理基于 Excel 数据库, 统计分析用 SPSS7.0 处理 2 结果 2. 荧光定量 PCR 法与基因芯片法检测结果荧光定量 PCR 法检测可对 6 8 分型, 合并检测 , 实验结果见图当荧光定量 PCR 法检测结果为阳性, 若型别与基因芯片法检测的结果不一致, 则定义为不相符, 共有 92 例, 分析结果见表 2 由表 2 见, 荧光定量 PCR 法检测与基因芯片法检测的总一致率为 95.5% (958/2050); 阳性一致率为 95.9%(786/820); 阴性一致率为 95.3%(72/230) 2.2 测序法检测结果两种方法检测结果不一致共有 92 例, 采用测序的方法进行验证, 测序图见图 2 一致性分析见表 3, 以测序结果为金标准, 荧光定量 PCR 法检测结果吻合例数率为 45%; 基因芯片法检测结果吻合率为 55% 表使用试剂及仪器情况 Table The reagent and instrument 荧光定量 PCR 法基因芯片法 * 用于宫颈脱落细胞样本中 2 种高危型 HPV 定性检检测指标测, 同时分型检测 HPV6 HPV8 2 种 HPV 的分型检测试剂名称 2+2 高危型人乳头状瘤病毒核酸检测试剂盒人乳头状瘤病毒 (HPV) 分型检测试剂盒 ( 潮州凯普生物化学有限公司 ) ( 潮州凯普生物化学有限公司 ) 使用仪器实时荧光定量 PCR 仪 :ABI7500 PCR 扩增仪 :PE9600; 杂交仪 :HybriMax 医用核酸分子快速杂交仪 HHM-2I * 注 :2 高危型包括 :HPV3,33,35,39,45,5,52,56,58,59,66,68 型 2 分型包括 :HPV6,,53,6,8,3,33,58,35,39,45,5,52,56,59,66,68,42,43,44 及 CP8304 型表 2 荧光定量 PCR 法与基因芯片法检测结果一致性分析 Table2 Consistency analysis between real-time fluorescent PCR and gene-chip 基因芯片法一致率 (%) 一致率 95% CI* 合计阳性阴性阳性阴性阳性阴性荧光定量阳性 % %~97.4% - PCR 法阴性 % %~96.7% 合计 % 94.%~96.6% * 95% CI 采用 Wilson's score confidence interval 方法计算

3 分子诊断与治疗杂志 203 年 5 月第 5 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, May 203, Vol. 5 No 荧光定量 PCR 法检测阳性结果型别分类将荧光定量 PCR 法检测阳性的 798 例标本进行型别分析,HPV6 阳性有 399 例, 占 50.0%;HPV8 阳性有例, 占 3.9%; 其余 2 型高危阳性有 288 例, 占 36.% ( 表 4) 3 讨论早在 977 年,Laverty [3] 在电镜中观察到宫颈癌活检组织中有 HPV 颗粒的存在, 以及 Zur Hausen [4] 提出 HPV 病毒与宫颈癌发病相关联的假设后, 国内 HPV6 型阳性 HPV 其他型别阳性 HPV8 型阳性图荧光定量 PCR 检测结果 Figure Result of PCR-fluorescence probing assay HPV 阴性表 3 两种检测方法与测序结果的一致性分析 Table 3 Consistency analysis between sequencing figure and two detection methods 荧光定量测序法结果 ( 金标准 ) 基因芯片法例数 PCR 法阳性阴性阳性阴性阴性阳性合计 HPV6 阳性测序图表 4 荧光定量 PCR 法检测阳性检测结果分类 Table 4 The classification of positive results in real-time fluorescent PCR 型别荧光定量 PCR 法阳性例数 (%) HPV6 399(50.0) HPV8 (3.9) 其余 2 型 HPV 288(36.) 合计 798 HPV8 阳性测序图 HPV66 阳性测序图图 2 HPV 各型别阳性测序图 Figure 2 HPV sequencing figure

4 68 分子诊断与治疗杂志 203 年 5 月第 5 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, May 203, Vol. 5 No. 3 外学者进行了大量的研究, 并在 995 年的 IARC 专题讨论会上达成了 HPV 感染是宫颈癌的主要原因的观点根据 HPV 感染人体后可致宫颈癌的相关性, 将其分为低危型 HPV 以及高危型 HPV 低危型 HPV 可导致生殖器尖锐湿疣, 影响生活质量 ; 高危型 HPV 除可引起外生殖器疣外, 更重要的是引起外生殖器癌宫颈癌及高度宫颈上皮内瘤样病变, 其已明确的高危型 HPV 型别主要有 HPVl 型等宫颈癌患者中,HPV6 和 HPV8 型感染率最高 [5] 高危型 HPV 导致癌症的机会较高, 在 99.8 % 的宫颈癌患者中发现 HPV 的感染 [6], 现已知至少有 3 种高危型 HPV 与 95% 的早期浸润和浸润性子宫颈癌有关 [7] 世界卫生组织明确提出 3 种 HPV 高危型应该单独或联合细胞学应用于宫颈癌筛查 [8] 美国国立综合癌症网络 (National Comprehensive Cancer Network,NCCN) 宫颈癌筛查实践指南及美国阴道镜检查与宫颈病理学会 (American Society for Colposcopy and Cervical Pathology,ASCCP) [9] 另外指出, 检测高危型 HPV 时,HPV6 和 HPV8 必须特别重视他们明确指出即使宫颈细胞学无异常而 HPV 阳性的 30 岁以上女性, 如其为 HPV6 HPV8 感染者, 应立即进行阴道镜检查亚洲妇女宫颈癌组织中 HPV 常见型别最新报道显示 [0] : 无论是在西亚和东亚地区,HPV6 和 HPV8 都是感染率最高的型别由于宫颈病变的严重程度与感染 HPV 的具体亚型相关, 在单一感染型别中,HPV6 占居首位并随病变级别增加而阳性率逐步增高 Clifford 等现 HPV6 在宫颈浸润癌 (invasive cervical cancer) 患者中的检出率是低度鳞状上皮内病变 (low-grade squamous intraepithelial lesion,lsil) 中的 2 倍, HPV8 是.5 倍, 说明感染 HPV6 HPV8 更容易进展为宫颈浸润癌同时研究表明,HPV6 的感染由于清除率降低可能更易导致持续性感染, 发生 CIN2 3(cervical intraepithelial neoplasia II,III), 甚至 SCC (squamous cell carcinoma) [2] 因此对于 HPV 感染患者不仅需要重视其是否已经导致宫颈病变, 还要重视其感染的具体型别, 特别是 HPV6 HPV8 型感染患者应密切随访综上所述,HPV 分型检测, 特别是 HPV6 HPV8 的分型检测比 3 种高危型综合笼统归类检测更具临床指导意义故本文研究的 HPV2+2 高危型检测试剂盒应用于育龄期妇女的宫 [] 发颈癌筛查及随访意义重大目前临床上常用的宫颈细胞学检查方法主要有两种 : 巴氏涂片法 ( 即宫颈刮片 ) 和液基薄层细胞学检查法 (TCT) [3], 由于主观因素的影响, 这两种方法的假阴性较高, 容易造成漏诊因此, 采用合理廉价的筛查方法, 对提早预防诊断和治疗宫颈癌有非常重要的意义本研究采用的 HPV 基因分型检测试剂盒 (PCR+ 膜杂交法 ), 现已广泛应用于宫颈疾病的诊治全过程, 可降低宫颈病变的漏诊以及避免过度治疗, 目前已成为宫颈疾病的随访指标, 在临床中发挥着重要作用但该试剂盒存在成本较高, 操作步骤复杂等, 临床应用受到一定限制美国 HC2 捕获杂交法 (3 种高危型检测试剂盒 ) 及国内现有的 3 种高危型 HPV 核酸扩增荧光检测试剂盒, 具有操作简单, 自动化程度高的优点, 但不能直接对 HPV 进行分型, 特别是无法直接鉴定 HPV6 和 HPV8, 在临床应用中存在一定的不足而本研究中所使用的 2+2 高危型人乳头状瘤病毒核酸检测试剂盒, 以实时荧光定量 PCR 核酸检测为技术平台, 在同一试管中, 既能检测 2 种高危型 HPV, 又能同时将 HPV6 HPV8 分型 ( 表 4), 且操作简单因此, 通过本研究, 比较此新型 2+2 高危 HPV 核酸检测试剂盒与市场上已有质量较好的基因分型试剂盒在临床上的使用情况, 评价这种新型试剂盒的使用价值, 而根据试验结果可推断, 此 2+2 高危 HPV 检测试剂盒用于临床检验是有效和安全的参考文献 [] Walboomers J M, Jacobs M V, Manos M M, et al. Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide[j]. J Pathol, 999, 89(): 2-9. [2] Moscarini M, Lukic A, Franco C. Anti human papillomavirus vaccine: the checkmate to human papillomavirus[j]. Eur J Gynaecol Oncol, 2004, 25(2): [3] Bekkers R L, Massuger L F, Bulten J, et al. Epidemiological and clinical aspects of human papillomavirus detection in the prevention of cervical cancer[j]. Rev Med Virol, 2004, 4(2): [4] 程娇影, 卞美璐, 马莉, 等. 杂交捕获二代与核酸扩增荧光检测宫颈癌前病变及宫颈癌的临床价值 [J]. 中国实用妇科与产科杂志, 200, 26(5):

5 分子诊断与治疗杂志 203 年 5 月第 5 卷第 3 期 J Mol Diagn Ther, May 203, Vol. 5 No [5] 钟奇志. 第二代捕获杂交法 (HC-II) 检测 HPV-DNA 在宫颈癌筛查中应用 [J]. 中国妇幼保健, 2008, 23(7): [6] Rowe L R, Aldeen W, Bentz J S. Prevalence and typing of HPV DNA by hybrid capture II in women with ASCUS, ASC-H, LSIL, and AGC on ThinPrep Pap tests[j]. Diagn Cytopathol, 2004, 30(6): [7] 杨玲, 章文华, 李爱玲, 等. 山西子宫颈癌筛查方法比较的可行性研究 [J]. 中国肿瘤, 2000, 9(9): [8] Ye J, Cheng X, Chen X, et al. Prevalence and risk profile of cervical human papillomavirus infection in Zhejiang Province, southeast China: a population-based study[j]. Virol J, 200, 7: 66. [9] Bouvard V, Baan R, Straif K, et al. A review of human carcinogens-part B: biological agents[j]. Lancet Oncol, 2009, 0(4): [0] 李霓, 张思维, 陈万青, 等. 亚洲妇女宫颈癌中人乳头状瘤病毒型别分布的 Meta 分析 [J]. 中国肿瘤, 200, 9(3): [] Clifford G M, Smith J S, Plummer M, et al. Human Papillomavirus types in invasive cervical cancer worldwide: a meta-analysis[j]. Br J Cancer, 2003, 88(): [2] 毕蕙, 赵健, 陈锐, 等. 人乳头瘤病毒感染亚型与宫颈上皮内瘤变的相关性 [J]. 中国实用妇科与产科杂志, 200, 26(5): [3] Liu S S, Leung R C, Chan K K, et al. Evaluation of a newly developed GenoArray human papillomavirus (HPV) genotyping assay and comparison with the Roche Linear Array HPV genotyping assay[j]. J Clin Microbiol, 200, 48(3):

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