孝感地区 7780 例 TCT 与 HPV 联合检测分析何惠华, 等 259 Keywords treatment programs was of significance. HPV; cervical intraepithelial neoplasia; SPR; the virus load 宫

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1 258 临床与病理杂志 J Clin Pathol Res 2015, 35(2) doi: /j.issn View this article at: 孝感地区 7780 例 TCT 与 HPV 联合检测分析何惠华, 刘汉忠, 李蓓, 杨继洲 ( 华中科技大学同济医院附属孝感市中心医院病理科, 湖北孝感 ) [ 摘要 ] 目的 : 探讨孝感地区妇女不同年龄阶段不同 TCT 结果中人乳头瘤病毒 (human papillomavirus, HPV) 感染特点方法 : 对 2010 年 1 月 ~2013 年 12 月在孝感市中心医院体检及门诊就诊的例宫颈细胞标本进行液基薄层细胞学 (liquid-based thinprep cytology test,tct) 检测及采用表面等离子体谐振 (SPR) 技术, 进行 HPV 基因分型检测结果 :24 型 HPV 均被检出, 阳性率为 20.55%, 感染以高危型 HPV(hrHPV) 为主 ;HrHPV 阳性率为 18.07%, 其中 HPV16 型阳性最多 ;7 075 例上皮内病变及恶性肿瘤为阴性 (negative for intraepithelial lesions and malignancies,nilm) 中 hrhpv 阳性率为 12.28%, 但 NILM 与其他各组的病毒平均负载量统计学有差异随着病毒平均负载量的增大,TCT 结果显示宫颈病变程度越重 HrHPV 感染者中 26 岁以下组感染率最高结论 : 孝感地区 HPV 感染状况具有地域性特点 TCT 结果 HPV 感染状况及其病毒负载量以及年龄因素的综合分析对指导临床制定下一步诊疗方案具有重要意义 [ 关键词 ] 人乳头状瘤病毒 ; 宫颈上皮内瘤病变 ; 表面等离子体谐振 (SPR); 病毒负载量 cases TCT combined with HPV testing correlation analysis in Xiaogan HE Huihua, LIU Hanzhong, LI Bei, YANG Jizhou (Department of Pathology, Huazhong University of Science and Technology, Tongji Hospital subsidiary Xiaogan Central Hospital, Xiaogan Hubei , China) Abstract Objective: To study the human papillomavirus (HPV) genotypes and their distribution character in uterine cervix in Xiaogan. Methods: The investigated group comprised patients from Xiaogan Central hospital since Jan 2010 to Oct All the cervical samples were analyzed by TCT and the SPR biosensor. The SPR biosensor could detect 16 types of high-risk HPV and 8 types of low-risk HPV at the same time. Results: Twenty four HPV genotypes were detected out, the positive rate was 20.55%, the infection based on hrhpv; the positive rate of hrhpv was 18.07%, among which the most HPV16 positive. HrHPV positive rate was 12.28% in cases NILM, but there was a statistical difference in the average virus load of NILM from other groups. With an average viral load increasing, TCT showed more severe cervical lesions. hrhpv infected persons in 26 years of age group has the highest infection rate. Conclusion: HPV infection has regional characteristics in Xiaogan. A comprehensive analysis of TCT results, HPV infection status, viral load and the age factor in guiding clinical 收稿日期 (Date of reception): 通信作者 (Corresponding author): 杨继洲, yangjizhou1@163.com

2 孝感地区 7780 例 TCT 与 HPV 联合检测分析何惠华, 等 259 Keywords treatment programs was of significance. HPV; cervical intraepithelial neoplasia; SPR; the virus load 宫颈癌是一种常见的女性恶性肿瘤, 就病原学而言, 几乎所有宫颈癌均与人乳头状瘤病毒 (human papillomavirus,hpv) 持续感染有关 [1] 根据 HPV 与宫颈癌患病风险的关系, 将 HPV 划分为高危型 HPV(hrHPV) 和低危型 HPV(lrHPV) [2] 本研究分析我院门诊及体检人员的液基薄层细胞学 (liquid-based ThinPrep cytology test,tct) 与 HPV 基因分型结果, 以了解湖北省孝感地区不同年龄妇女 HPV 宫颈感染及分布情况, 对于指导临床工作, 预防和治疗 HPV 感染的人群具有重要意义 1 资料与方法 1.1 资料收集 2010 年 1 月 ~2013 年 12 月在我院体检及门诊的例宫颈细胞学标本, 其中例自愿行 HPV 检测, 均为首次接受 HPV 检测, 年龄最大的 83 岁, 最小为 17 岁年龄分为 5 个年龄组 :<26 26~35 36~45 46~55 >55 岁 1.2 方法患者的宫颈细胞标本进行液基薄层细胞学检查, 由我院有经验的病理科医生阅片, 根据 2001 年 TBS(the Bethesda System) 诊断标准报告结果 [3] : 上皮内病变及恶性肿瘤为阴性 (negative for intraepithelial lesions and malignancies,nilm); 不能明确意义的非典型鳞状细胞 (atypical squamous cells of undetermined significance,asc-us); 低度鳞状上皮内病变 (low-grade squamous intraepithelial lesions, LSIL); 非典型鳞状细胞不排除高度鳞状上皮内病变 (atypical squamous cells,cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesions,asc-h); 高度鳞状上皮内病变 (high-grade squamous intraepithelial lesions,hsil); 非典型腺细胞 (atypical glandular cells,agc) 采用表面等离子体谐振 (SPR) 技术 ( 北京金菩嘉医疗科技有限公司 ) 进行 HPV 基因分型检查 ( 包括 16 种高危型 :16,18,31,33,35,39,45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 81; 8 种低危型 :6,11,40,42,43,44,54,70) HPV 基因分型检测过程为 :1) DNA 分离纯化, 用血液基因组 DNA 提取试剂盒提取样本, 产物立即使用或 20 冻存 2)PCR 扩增, 将扩增混合液与 DNA Tap 酶按照 89:1 的比例混合, 每个扩增管 90 μl 体系分装, 加入 10 μl DNA 样本或阳性对照流池内控品 ( 含有与 HPV 基因无关核酸序列的质粒 ), 混匀后进行 PCR 扩增 3) 扩增产物上机检测 ( 生物传感芯片阅读仪 ), 每管样本扩增产物中加入 20 μl 阳性对照流池内控品扩增产物和 60 μl 杂交缓冲液, 涡旋 10 s 混匀, 置水浴锅中 95 变性 3~5 min, 上机检测将表面包被有 24 种 HPV 基因型特异性探针的 SPR 生物传感芯片置入阅读仪, 启动 SPR 检测程序, 最后进行结果判读结果判读标准 :1) 结果有效 : 阳性对照流池的 SPR 角信号值 40 毫度 (m ), 且阴性对照流池信号值 <40 m, 则可认定为结果有效 2) 分型探针检测阳性 : 探针的信号值 40 m 3) 分型探针检测阴性 : 探针的信号值 <40 m 4) 结果无效 : 阳性对照流池的信号值小于 40 m, 或者阴性对照流池信号值 40 m, 则可认定为检测结果无效 1.3 统计学处理 91% 采用 SPSS13.0 软件进行统计分析, 组间比较采用 χ 2 检验, 两两比较采用 LSD-t 检验,P<0.05 表明有统计学意义 2 结果 2.1 TCT 结果例样本,NILM 病例共例, 占 90.94%;ASC-US 为 315 例, 占 4.05%;LSIL 为 182 例, 占 2.34%;ASC-H 为 57 例, 占 0.73%;HSIL 为 128 人, 占 1.65%; AGC 为 23 例, 占 0.30%( 见图 1) 4% 2% 3% 图例样本的 TCT 结果分布图 1% 2% 0% NILM ASC-US LSIL ASC-H HSIL AGC Figure 1 The distribution map of the results of TCT in patients

3 260 临床与病理杂志, 2015, 35(2) HPV 基因检测结果本院所检测的例样本中,6 181 例为阴性, 阳性样本例, 阳性率为 20.55% hrhpv 阳性例, 阳性率为 18.07%, 其中 387 例为多重感染, 包括 148 例同时伴 lrhpv 感染 ;lrhpv 阳性 193 例, 占 2.48%, 其中 24 例为多重感染例 NILM 中 hrhpv 阳性为 869 例, 阳性率为 12.28%; ASC-US 中 hrhpv 阳性为 205 例, 阳性率为 65.08%; LSIL 中 hrhpv 阳性为 147 例, 阳性率为 80.77%; ASC-H 中 hrhpv 阳性为 52 例, 阳性率为 91.23%; HSIL 中 hrhpv 阳性为 122 例, 阳性率为 95.31%; AGC 中 hrhpv 阳性为 11 例, 阳性率为 47.83%( 见表 1) HPV 多重感染共计 411 例, 占阳性样本中的 25.70% 以双重感染居多, 共 337 例, 其中 HPV16 型和 6 型同时感染最多, 共 28 例其次 HPV16 型和 52 型同时感染 12 例,HPV16 型和 18 型同时感染 8 例在 NILM ASC-US LSIL ASC-H HSIL 和 AGC 的 HPV 阳性样本中, 多重感染率分别为 25.5%,17.7%,23.8%,39.6%,37.9% 组间比较具有统计学意义 (χ 2 =23.6,P<0.01) 所有 HPV 阳性样本中,HPV16 型阳性最多, 为 397 例, 占全部 HPV 感染的 24.83%; 其次是 HPV58 型为 188 例, 占 11.76%, 再有 HPV52 为 165 例, 占 10.32%,HPV81 为 139 例, 占 8.69%, HPV53 型及 HPV18 型均为 90 例, 占 5.63% 常见低危型中,HPV6 为 83 例, 占 5.19%,HPV11 为 74 例, 占为 4.63%,HPV70 为 78 例, 占 4.88% 2.3 HPV 阳性病例的年龄分布 ( 见表 2) 表 2 显示 hrhpv 感染者年龄由低到高,5 个年龄组中 26 岁以下组 hrhpv 感染率最高, 随着年龄组增长, 感染率呈下降趋势, 但 55 岁以上组比 46~55 岁组略有升高, 阳性率分别为 24.73% 21.46% 16.69% 14.35% 14.60% 组间比较具有统计学意义 (χ 2 =69.5,P<0.01) 26 岁以下组 HPV 阳性率明显高于其他年龄组 ; 不同感染亚型中,HPV18 型和 33 型感染率是随年龄组的增大而一直下降 lrhpv 的感染率在 26 岁以下组感染率最高, 随年龄组的增大呈下降趋势表 1 不同 TCT 结果组中 HPV 感染分布 Table 1 The distribution of HPV infection in different groups of TCT results 病毒 NILM ASC-US LSIL ASC-H HSIL AGC 总计 (n=7 780) hrhpv HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV lrhpv 多重感染表 2 不同年龄组 HPV 感染分布 Table 2 The distribution of HPV infection in different age groups 病毒 <26 岁 (n=918)/% 26~35 岁 (n=1 966)/% 36~45 岁 (n=2 241)/% 46~55 岁 (n=874)/% >55 岁 (n=781)/% 总计 hrhpv 227 (24.73) 422 (21.46) 374 (16.69) 269 (14.35) 114 (14.60) HPV16 61 (6.64) 110 (5.60) 106 (4.73) 79 (4.22) 41 (5.25) 397 HPV18 15 (1.63) 26 (1.32) 25 (1.12) 17 (0.91) 7 (0.90) 90 HPV58 25 (2.72) 52 (2.64) 53 (2.37) 40 (2.13) 18 (2.30) 188 HPV52 28 (3.05) 49 (2.49) 44 (1.96) 30 (1.60) 14 (1.79) 165 HPV81 23 (2.51) 38 (1.93) 39 (1.74) 28 (1.49) 11 (1.41) 139 HPV53 16 (1.74) 25 (1.27) 24 (1.07) 16 (0.85) 9 (1.15) 90 HPV33 14 (1.53) 23 (1.17) 21 (0.94) 14 (0.75) 5 (0.64) 77 HPV31 10 (1.09) 17 (0.86) 19 (0.85) 12 (0.64) 6 (0.77) 64 lrhpv 31 (3.38) 54 (2.75) 52 (2.32) 43 (2.29) 13 (1.66) 193

4 孝感地区 7780 例 TCT 与 HPV 联合检测分析何惠华, 等 HPV 病毒负载量我们的检测方法阳性结果提示该样本病毒检测量大于 1 pg/μlb 标准品 ( 相当于大于 10 6 /ml 样本病毒治疗拷贝数 ) 病毒负载量不同细胞学结果组中 NILM 中 hrhpv 阳性样本的平均病毒负载量为 89 m,asc-us 为 151 m,lsil 为 244 m,asc-h 为 289 m,hsil 平均值 297 m 通过统计,5 组的病毒平均负载量组间比较统计学有差异 (F= , P<0.001),ASC-H 及 HSIL 组之间两两比较无统计学差异 (t= ,P< ) 不同年龄组中,26 岁以下组 hrhpv 阳性样本的平均病毒负载量为 126 m 26~35 岁为 165 m 36~45 岁 189 m 46~55 岁为 203 m 55 岁以上为 241 m 26 岁以下组分别与 46~55 岁组 55 岁以上组两两比较有统计学意义 (t= ,P<0.001;t= ,P<0.001) HrHPV 多重感染者, 取不同 hrhpv 型别中的病毒负载量最高值 3 讨论 HPV 是一种嗜上皮 ( 皮肤和粘膜上皮 ) 性的小 DNA 病毒, 有高度的特异性从 HPV 感染到癌前病变 (CIN), 再发展到子宫颈癌需要 5~8 年的时间, 而且病情的发展具有可逆性 [4] 筛查和治疗的及时彻底是关键因此, 对孝感地区妇女进行有效的筛查是目前我们做的工作本研究分析了近 3 年孝感地区不同年龄阶段妇女及不同 TCT 结果中 HPV 感染状况本地区 HPV 阳性病例以 hrhpv 感染为主, 感染率为 18.07% 在 NILM 中, 我们检测到 hrhpv 的 [5] 感染率为 12.27% Khan 等研究表明在正常人群中 [6] 存在 10% 左右的 HPV 感染率 Depuydt 等回顾性研究细胞学为 NILM 但病理组织学诊断为 CIN II 级及以上的病例, 发现所有病例 HPV 检测均阳性, 但重新阅片仍有部分细胞学诊断仍然为 NILM, 提示 HPV 检测敏感性更高我们的统计结果提示我们 HPV 检测方法其敏感性较高表面等离子体共振 (SPR) 技术是利用金属膜 / 液面界面光的全反射引起的物理光学现象来分析分子相互作用的技术在 HPV 检测中, 运用 PCR 和 SPR 芯片核酸杂交相结合的方法检测样品中的 HPV, 其取样简单, 可利用 TCT 检查剩下的标本, 重复性好, 敏感度高, 有重要的阴性预测价值 [7] 但敏感度高, 势必会造成临床的特异性降低因此我们在统计阳性率的同时, 也对每个样本进行了病毒负载量的统计 [8] 通过统计,NILM 与其他各组的病毒平均负载量统计学有差异,ASC-H 及 HSIL 组之间无统计学差异随着病毒平均负载量的增大,TCT 结果显示宫颈病变程度越重提示病毒负载量与宫颈上皮内瘤变的进展密切相关而且随年龄组的增大, 病毒平均负载量也逐渐增大因此,NILM 中 hrhpv 阳性患者的病毒负载量和年龄因素非常重要, 综合考虑, 可增加 HPV 检测的临床特异性所有 HPV 阳性样本中,HPV16 型阳性最多, 且在 HSIL 及 AUS-H 中也是以 HPV16 感染最常见接下来依次是 HPV58,HPV52,HPV81,HPV53 及 HPV18 我们统计中,HPV18 阳性率不高, 但在 AUS-H 及 HSIL 中比例较大 (21/90);HPV81 型的阳性率虽然较高, 但在 AUS-H 及 HSIL 中的比例较 [9-10] 小 (8/139) 与国内文献报道稍有不相同, 提示 HPV 感染的型别具有地域性差异, 但本地区宫颈高级别上皮内病变中仍然是以 HPV16 型和 HPV18 型为主我们发现 AUS-H 及 HISL 组, 多重感染率明显多于其他组, 以双重感染居多, 多重感染型别中常见 16 型和 18 型有学者认为 HPV 多重感染是发生宫颈高级别病变的一个显著的危险因素 [11-12], 并以 16 型和 18 型常见 [13], 本研究与报道相似 [14-15] 国内报道的 HPV 感染高峰年龄各不相同, 我们发现 5 个年龄组中 26 岁以下组 hrhpv 感染率最高, 随着年龄组增长, 感染率呈下降趋势, 但 55 岁以上组比 46~55 岁组略有升高同时我们也发现 26 岁以下组其病毒平均负载量最低, 提示 26 岁以下组虽然 hrhpv 感染率最高, 但病毒平均负载量最低, 可能一方面与我们检测方法的敏感性有关, 一方面部分患者存在一过性感染可能另外, 我们在 AUS-H 及 HISL 中发现 3 例为单一 HPV6 型感染, 最终组织学结果显示 1 例为宫颈鳞状细胞癌,1 例为 CIN III 级,1 例为 CIN I 级提示 lrhpv 中,HPV6 型相对于其他 lrhpv 型别而言更具危险性 [16] 综上, 我们对近 3 年孝感地区妇女的 HPV 感染情况进行了综合分析, 这对了解本地区 HPV 感染状况具有重要意义 SPR 技术在检测 HPV 方面有着其他 HPV 检测技术难以相比的优势, 不仅能进行分型, 还能提供病毒负载量, 特别是对通过不同 TCT 结果组及不同年龄阶段 HPV 病毒平均负载量的分析, 提示 TCT 结果 HPV 感染状况及其病毒负载量以及年龄因素的综合分析对临床下一步诊疗方案的实施具有重要指导意义

5 262 临床与病理杂志, 2015, 35(2) 参考文献 1. 杨兰, 孙振柱, 李锋. HLA 与 HPV 相关肿瘤的研究进展 [ J]. 国际病理科学与临床杂志, 2006, 26(4): YANG Lan, SUN Zhenzhu, LI Feng. Progression of HLA and HPVrelated tumors[ J]. International Journal of Pathology and Clinical Medicine, 2006, 26(4): 方玉才, 王秋英, 杨燕飞, 等例妇科患者 HPV 感染型别分布及临床分析 [ J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 2013, 27(6): FANG Yucai, WANG Qiuying, YANG Yanfei, et al. Clinical analysis of 1448 cases of gynecological patients with type HPV infection[ J]. Chinese Journal of Experimental and Clinical Virology, 2013, 27(6): 王玥元, 石清芳, 田芳. 宫颈液基薄层细胞学筛查中非典型鳞状细胞研究进展 [ J]. 国际病理科学与临床杂志, 2013, (4): WANG Yueyuan, SHI Qingfang, TIAN Fang, et al. Progress in research on atypical squamous cells at liquid based cytology[ J]. International Journal of Pathology and Clinical Medicine, 2013, (4): Cox T, Cuzick J. HPV DNA testing in cervical cancer screening: from evidence to policies[ J]. Gynecol Oncol, 2006, 103(1): Khan MJ, Schiffman M, Jeronimo J. Accuracy of human papillomavirus testing in primary screening of cervical neoplasia: results from a multicenter study in India[ J]. Int J Cancer, 2005, 116(5): Depuydt CE, Arbyn M, Benoy IH, et al. Quality control for normal liquid-based cytology: rescreening, high-risk HPV targeted reviewing and/or high-risk HPV detection?[ J]. J Cell Mol Med, 2009, 13(9B): 赵丽君, 陈楠, 江静, 等. 表面等离子共振技术检测人乳头瘤病毒亚型在宫颈病变中的临床应用 [ J]. 中国妇产科临床杂志, 2011, 12(4): ZHAO Lijun, CHEN Nan, JIANG Jing, et al. The clinical application of surface plasmon resonance in detection of human papillomavirus genotypes in patients with cervical lesions[ J]. Chinese Journal of Clinical Obstetrics and Gynecology, 2011, 12(4): 杨娟, 肖兰, 杨继洲. 高危型 HPV 负载量与宫颈癌前病变发展的相关性 [ J]. 实用癌症杂志, 2012, 27(6): YANG Juan, XIAO Lan, YANG Jizhou. Correlation between high-risk HPV virus load and development of cervical precancerous lesion[ J]. The Practical Journal of Cancer, 2012, 27(6): 何建方, 钱福初, 王翔, 等. 人乳头状瘤病毒 23 种基因型的分子流行病学调查 [ J]. 中华医院感染学杂志, 2011, 21(3): HE Jianfang, QIAN Fuchu, WANG Xiang, et al. Molecular epidemiology study on 23 genotypes of human papillomavirus[ J]. Chinese Journal of Nosocomiology, 2011, 21(3): 董长林, 陈国军, 陆建红. 人乳头状瘤病毒分型检测在宫颈癌防治中的应用价值 [ J]. 中华医院感染学杂志, 2011, 21(22): DONG Changlin, CHEN Guojun, LU Jianhong, et al. Role of human papilloma virus genotyping in prevention of cervical cancer[ J]. Chinese Journal of Nosocomiology, 2011, 21(22): 陶萍萍, 卞美璐, 李敏, 等. HPV 多重感染与宫颈病变关系探讨 [ J]. 中国妇产科临床杂志, 2006, 7(2):94-96, 127. TAO Pingping, BIAN Meilu, LI Min, et a1. Correlation of multiple HPV infection and cervical dysplasia[ J]. Chinese Journal of Clinical Obstetrics and Gynecology, 2006, 7(2): 94-96, Spinillo A, Dal Bello B, Gardella B, et al. Multiple human papillomavirus infection and high grade cervical intraepithelial neoplasia among women with cytological diagnosis of atypical squamous cells of undetermined significance or low grade squamous intraepithelial lesions[ J]. Gynecol Oncol, 2009, 113(1): Rijkaart DC, Berkhof J, van Kemenade FJ, et al. HPV DNA testing in population-based cervical screening (VUSA-Screen study): results and implications. Br J Cancer, 2012, 106(5): 赵瑾, 王小萼, 吕磊, 等. 不同宫颈病变中人乳头状瘤病毒的型别分布研究 [ J]. 中华医院感染学杂志, 2011, 21(10): ZHAO Jin, WANG Xiaoe, LV Lei, et al. Distribution of types of human papillomavirus causing cervical lesions[ J]. Chinese Journal of Nosocomiology, 2011,21(10): Zou Y, Guo XZ, Chen J, et al. Typing and epidemiological analysis of human papillomavirus on female genital tract in Zhejiang province[ J]. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi, 2010, 31(3): Arbyn M, Benoy I, Simoens C, et al. Prevaccination distribution of human papillomavirus types in women attending at cervical cancer screening in Belgium. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2009, 18(1): 本文引用 : 何惠华, 刘汉忠, 李蓓, 杨继洲. 孝感地区例 TCT 与 HPV 联合检测分析 [J]. 临床与病理杂志, 2015, 35(2): doi: /j.issn Cite this article as: HE Huihua, LIU Hanzhong, LI Bei, YANG Jizhou cases TCT combined with HPV testing correlation analysis in Xiaogan[ J]. Journal of Clinical and Pathological Research, 2015, 35(2): doi: /j.issn

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戊酸雌二醇片联合宫颈注射利多卡因用于绝经后妇女取环的临床效果评价陆琴芬, 等 371 Keywords groups, no removal difficulties and failure, was statistically s 370 临床与病理杂志 J Clin Pathol Res 2015, 35(3) http://www.lcbl.net doi: 10.3978/j.issn.2095-6959.2015.03.009 View this article at: http://dx.doi.org/10.3978/j.issn.2095-6959.2015.03.009 戊酸雌二醇片联