台 296 灣 獸 醫 誌 Taiwan Vet J 36 (4): 296-304, 200 台 灣 中 南 部 地 區 生 乳 中 潛 在 細 菌 種 類 與 藥 物 感 受 性 之 調 查 郭 鴻 志 2 莊 士 德 2 周 濟 眾 費 昌 勇 * 張 紹 光 國 立 台 灣 大 學 獸 醫 專 業 學 院 獸 醫 學 研 究 所 台 北 市 2 國 立 中 興 大 學 獸 醫 學 院 獸 醫 學 系 台 中 市 ( 收 稿 日 期 :99 年 04 月 02 日 接 受 日 期 :99 年 05 月 24 日 ) 摘 要 感 染 菌 對 治 療 藥 品 的 感 受 性, 為 影 響 療 效 的 首 要 因 素 之 一 本 調 查 在 了 解 台 灣 中 南 部 地 區 乳 牛 乳 汁 中 潛 在 細 菌 種 類 對 常 用 治 療 藥 物 的 感 受 性 由 試 驗 結 果 得 知, 於 無 臨 床 症 狀 乳 牛 之 生 乳 中, 細 菌 分 離 率 為 39.6 % (482/26); 革 蘭 氏 陰 性 分 離 菌 中, 以 大 腸 桿 菌 與 克 雷 伯 氏 菌 為 多 ; 革 蘭 氏 陽 性 分 離 菌 中, 以 葡 萄 球 菌 屬 為 最 多 而 腸 球 菌 屬 與 鏈 球 菌 屬 次 之 藥 物 感 受 性 試 驗 的 結 果 指 出, 除 了 畜 福 紅 黴 素 與 羥 四 環 黴 素 外, 葡 萄 球 菌 屬 與 鏈 球 菌 屬 對 於 常 用 抗 菌 劑 的 抗 藥 性 比 率 均 遠 較 腸 球 菌 屬 為 高, 葡 萄 球 菌 屬 與 鏈 球 菌 屬 對 於 恩 氟 奎 林 羧 酸 仍 具 有 較 佳 的 感 受 性 對 大 腸 桿 菌 與 其 他 陰 性 菌 而 言, 具 有 相 似 且 一 致 性 的 敏 感 性 結 果, 即 對 恩 氟 奎 林 羧 酸 與 健 牠 黴 素 具 最 佳 的 感 受 性 由 於 乳 汁 中 可 存 在 的 細 菌 種 類 繁 多, 對 常 用 治 療 藥 物 的 敏 感 性 各 異, 故 適 當 且 定 期 監 測, 確 有 其 必 要 性 [ 郭 鴻 志 莊 士 德 周 濟 眾 費 昌 勇 * 張 紹 光 台 灣 中 南 部 地 區 生 乳 中 潛 在 細 菌 種 類 與 藥 物 感 受 性 之 調 查 台 灣 獸 醫 誌 36 (4): 296-304 * 通 訊 作 者 TEL:+886-2-3366-3864,FAX:+886-2-2366-475,E-mail:changsk@ntu.edu.tw] 緒 言 乳 房 炎 為 乳 牛 最 重 要 的 疾 病 之 一, 亦 是 世 界 酪 農 產 業 最 普 遍 的 疾 病 之 一 [3,6,2] 可 引 起 乳 房 炎 的 原 因, 雖 然 包 括 了 細 菌 黴 菌 黴 漿 菌 和 病 微 生 物 的 感 染 與 各 種 外 在 理 化 因 子 的 刺 激 [9], 但 最 常 見 者, 仍 為 細 菌 性 的 感 染 ; 這 包 括 了 鏈 球 菌 (Streptococcus spp.) 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus spp.) 大 腸 桿 菌 (Escherichia coli) 棒 狀 桿 菌 (Corynebacterium spp.) 芽 胞 梭 菌 (Clostridium spp.) 奴 卡 氏 菌 (Nocardia spp.) 和 假 單 胞 菌 (Pseudomonas spp.) 對 乳 房 直 接 的 感 染, 當 然, 分 枝 桿 菌 (Mycobacterium spp.) 及 布 氏 桿 菌 (Brucella spp.) 的 全 身 性 感 染, 亦 可 以 導 致 乳 房 病 變 的 產 生 [3,7,0] 由 於 上 述 微 生 物 多 可 廣 泛 的 存 在 於 乳 牛 周 圍 的 環 境 與 排 泄 物 中 正 常 牛 隻 的 體 表 和 天 然 孔 道 內 出 現 於 被 感 染 牛 隻 的 乳 腺 與 乳 汁 中 與 / 或 其 他 組 織 的 分 泌 物 中, 故 再 經 由 直 接 乳 頭 口 部 乳 房 皮 膚 傷 口 或 各 種 接 觸 與 血 液 循 環 感 染 乳 腺 組 織 均 可 能 發 生 但 在 現 場 最 主 要 且 常 見 的 感 染 方 式 為 : 被 感 染 的 乳 分 房 排 出 定 著 於 乳 腺 的 菌 種, 經 由 榨 乳 相 關 用 具 ( 抹 布 乳 杯 水 桶 ) 與 榨 乳 者 手 部 的 污 染 或 昆 蟲 媒 介, 經 由 乳 頭 口 部 侵 入 乳 房 內 [3,5]; 另 經 由 牛 隻 體 表 或 天 然 孔 道 常 在 菌 叢 直 接 入 侵 乳 房 者 則 較 少 見 [5] 若 依 乳 房 炎 發 生 時 的 全 身 症 狀 乳 房 狀 態 乳 汁 異 常 和 細 菌 感 染 的 有 無, 可 將 乳 房 炎 細 分 成 甚 急 性 急 性 亞 急 性 慢 性 潛 在 性, 非 特 異 性 六 種, 其 中 除 了 非 特 異 性 乳 房 炎 外, 均 可 由 細 菌 的 感 染 所 產 生 [4,20] 若 是 依 照 國 際 乳 業 聯 盟 建 議, 則 可 將 乳 房 炎 依 病 原 的 有 無, 乳 質 與 乳 房 的 肉 眼 變 化 而 將 乳 房 炎 分 為 感 染 性 臨 床 型 感 染 性 亞 臨 床 型 非 特 異 性 臨 床 型 與 非 特 異 性 亞 臨 床 型 [5, 2,3] 而 上 述 的 感 染 性 臨 床 與 亞 臨 床 型 亦 均 可 分 離 到 病 原
生 乳 中 潛 在 細 菌 種 類 與 藥 物 感 受 性 297 菌 另 若 再 以 臨 床 治 療 實 用 的 觀 點 而 言, 依 照 感 染 微 生 物 的 種 類 分 類, 應 是 最 為 實 際 且 和 治 療 相 關 的 分 類 方 法 ; 此 法 可 將 常 見 的 乳 房 炎 次 分 為 : 鏈 球 菌 性 葡 萄 球 菌 性 腸 道 菌 類 假 單 胞 菌 性 化 膿 棒 狀 桿 菌 性 黴 漿 菌 性 黴 菌 性 及 其 他 較 少 發 生 之 細 菌 性 乳 房 炎 以 國 內 近 年 來 針 對 生 乳 樣 本 進 行 調 查 的 結 果 得 知, 葡 萄 球 菌 (4-2%) 及 鏈 球 菌 (0-20%) 感 染 居 多, 大 腸 桿 菌 群 的 感 染 (5%) 次 之, 而 黴 漿 菌 與 黴 菌 性 感 染 則 相 對 較 少 [,2] 但 不 論 乳 房 炎 是 以 何 種 形 式 分 類, 其 可 造 成 的 經 濟 損 失, 在 全 世 界 估 計 每 年 約 為 360 億 美 元, 而 平 均 每 一 頭 受 感 染 的 母 牛 約 損 失 200 美 元, 這 些 損 失 包 括 了 牛 乳 的 減 產 治 療 期 間 因 藥 物 殘 留 所 去 棄 的 乳 汁 藥 物 治 療 花 費 及 勞 力 的 付 出, 因 此, 乳 房 炎 的 防 治, 一 直 均 為 酪 農 業 者 與 相 關 獸 醫 師 的 重 點 工 作 之 一 對 台 灣 現 況 而 言, 近 幾 十 年 來, 臨 床 乳 房 炎 一 直 均 是 以 抗 菌 劑 治 療 為 主, 現 可 見 核 可 的 市 售 乳 房 炎 軟 膏 ( 乳 房 內 灌 注 ) 或 注 射 用 藥 約 十 數 種, 這 包 括 了 鏈 黴 素 (streptomycin) 羥 四 環 黴 素 (oxytetracycline) 配 尼 西 林 (penicillin) 氯 噁 唑 西 林 (cloxacillin) 與 雙 氯 噁 唑 西 林 (dicloxacillin) ; 相 對 而 言, 因 乳 房 炎 治 療 用 抗 菌 劑 長 期 反 覆 與 廣 泛 的 使 用, 部 分 病 原 菌 亦 已 對 特 定 治 療 用 的 藥 物, 產 生 高 比 例 的 抗 藥 性 對 畜 主 而 言, 在 常 無 送 檢 患 病 乳 牛 乳 汁 樣 本 意 願 的 情 況, 加 上 抗 菌 劑 使 用 所 造 成 的 選 擇 性 壓 力, 均 會 使 得 具 有 抗 藥 性 ( 或 多 重 抗 藥 性 ) 的 特 定 菌 種 在 場 中 環 境 常 存, 最 後 除 又 勢 必 再 導 致 因 重 複 感 染 與 治 療 的 困 境 外, 亦 可 能 造 成 乳 品 與 人 畜 公 共 衛 生 上 的 問 題 故 持 續 針 對 乳 汁 中 細 菌 進 行 抗 菌 劑 藥 物 敏 感 性 試 驗 與 監 控, 為 改 善 療 效 與 減 少 農 民 經 濟 損 失 的 不 二 手 段 基 於 上 述 原 因, 本 研 究 為 針 對 健 康 牛 隻 的 乳 汁 進 行 採 樣, 分 離 與 乳 房 炎 最 常 見 的 相 關 細 菌 ( 革 蘭 氏 陽 性 菌 : 葡 萄 球 菌 鏈 球 菌 與 腸 球 菌 ; 革 蘭 氏 陰 性 菌 : 以 大 腸 桿 菌 為 主 ), 了 解 其 在 生 乳 中 的 發 生 率, 並 且 經 由 選 定 藥 物 的 感 受 性 試 驗, 了 解 現 用 治 療 藥 物, 在 臨 床 上 的 療 效 材 料 與 方 法 樣 本 收 集 針 對 選 定 並 有 意 願 配 合 的 6 個 中 大 型 乳 牛 場 進 行 採 樣, 乳 汁 樣 品 的 採 集 時 間, 均 多 為 清 晨 或 傍 晚, 即 各 場 集 乳 前 乳 汁 樣 本 收 集 前, 均 先 以 70% 酒 精 噴 灑 後, 由 內 而 外 仔 細 擦 拭 乳 房 與 乳 頭 管 末 端 ( 乳 頭 口 ), 於 去 棄 前 3-5 次 榨 出 的 前 段 乳 汁 後, 再 直 接 以 5 ml 無 菌 離 心 管 收 集 乳 汁 ; 收 集 時, 均 會 避 免 乳 頭 直 接 碰 觸 管 壁, 採 集 乳 汁 量 約 5-0 ml 後, 立 即 緊 閉 管 蓋, 並 暫 將 樣 品 置 於 預 置 有 碎 冰 的 冰 箱 中 保 存, 待 整 場 採 樣 完 畢 後, 盡 快 將 樣 本 送 回 試 驗 室, 於 十 二 小 時 內 進 行 細 菌 分 離 與 培 養 於 本 調 查 中, 除 了 不 泌 乳 或 最 近 曾 接 受 治 療 的 乳 房 外, 每 一 頭 乳 牛 均 分 別 採 取 四 個 乳 分 房 的 生 乳 樣 本 細 菌 培 養 將 乳 汁 樣 本 以 滅 菌 棉 棒 塗 抹 於 血 液 培 養 基 與 MacConkey (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA) 培 養 基 上, 置 於 37 恆 溫 箱 中 經 6-20 小 時 後, 挑 選 疑 似 菌 落 進 行 次 培 養 與 純 化, 經 純 化 後 的 疑 似 菌, 再 挑 取 單 一 菌 落, 以 20% 甘 油 保 存 於 -70 冰 箱 中, 供 鑑 定 或 藥 物 感 受 性 試 驗 使 用 細 菌 鑑 定 以 革 蘭 氏 染 色 與 3% KOH 區 分 革 蘭 氏 陽 性 或 陰 性 菌 本 試 驗 所 選 的 革 蘭 氏 陽 性 菌 包 括 : 葡 萄 球 菌 鏈 球 菌 與 腸 球 菌, 上 述 陽 性 菌 的 鑑 定, 均 係 抽 取 細 菌 的 去 氧 核 糖 核 酸 (DNA), 以 多 重 引 子 進 行 聚 合 鏈 鎖 反 應 進 行 ( 引 子 對 如 Table 所 示 ) 屬 革 蘭 氏 陰 性 的 大 腸 桿 菌 (Escherichia coli) 克 雷 伯 氏 菌 (Klebsiella oxytoca) 弗 氏 檸 檬 酸 桿 菌 (Citrobacter freundii) 綠 膿 桿 菌 (Pseudomonas aeruginosa), 則 是 以 GFB 4E 及 API 20NE (BioMérieux, Marcy l Etoile, France) 細 菌 鑑 定 系 統 對 已 純 化 的 菌 株 進 行 鑑 定 藥 物 感 受 性 試 驗 本 試 驗 是 依 照 美 國 臨 床 實 驗 室 國 家 標 準 委 員 會 (Clinical Laboratory Standard Intistitute; CLSI, 2006) 的 標 準 操 作 程 序, 以 肉 湯 微 量 稀 釋 法 (micro broth dilution) 測 定 抗 菌 劑 對 分 離 菌 株 的 最 小 抑 制 濃 度 (minimal inhibitory concentrations; MICs) [6] 預 選 擇 的 藥 物 包 括 了 市 售 乳 房 炎 軟 膏 常 用 注 射 製 劑 的 主 要 成 分 與 少 數 研 究 者 有 興 趣 的 藥 物, 這 包 含 了 : 配 尼 西 林 (penicillin) 安 比 西 林 (ampicillin) 安 默 西 林 (amoxicillin) 畜 福 (ceftiofur) 噁 唑 西 林 (oxacillin) 可 利 斯 汀 (colistin) 鏈 黴 素 (streptomycin) 健 牠 黴 素 (gentamicin) 紅 黴 素 (erythromycin) 羥 四 環 黴 素 (oxytetracycline) 恩 氟 奎 寧 羥 酸 (enrofloxacin) 氯 黴 素 (chloramphenicol) 與 西 氟 奎 寧 羥 酸 (ciprofloxacin) 常 用 抗 菌 劑 ; 此 外, 研 究 者 亦 會 依 分 離 株 的 特 性, 自 上 述 藥 品 中, 選 擇 所 需 進 行 抗 生 素 感 受 性 試 驗
298 The sequence of primers used for the identification of Gram (+) bacteria Name of bacteria Sequence of primer (5-3 ) Size of PCR product (bp) Reference Streptococcus agalactiae F-GGAAACCTGCCATTGCG 280 8 R-TAACTTAACCTTATTAACCTAG Streptococcus dysgalactiae F-TGGAACACGTTAGGGTCG 270 8 R-CTTTTACTAGTATATCTTAACTA Streptococcus uberis F-TAAGGAACACGTTGGTTAAG 330 8 R-TCCAGTCCTTAGACCTTCT Staphylococcus aureus F-TCTTCAGAAGATGCGGAATA 420 8 R-TAAGTCAAACGTTAACATACG Staphylococcus chromogenes F-ACGGAATATCGCTTTTAAGC 250 8 R-CGTTTACATTCGGCTTTCG Staphylococcus epidermidis F-TCTACGAAGATGAGGGATA 240 8 R-TTTCCACCATATTTTGAATTGT Staphylococcus hyicus F-TACGGAATATCGCCTTAGG 250 8 R-AAAACATCTGTCATCCGAAG Staphylococcus simulans F-ATTCGGAACAGTTTCGCAG 220 8 R-ATTGTGAGTAATCGTTTGCC Staphylococcus xylosus F-TCTTTAGAAGATGACAGAGG 260 8 R-TGACTTTTAACACGACGAAG Streptococcus spp. F-TGTTTAGTTTTGAGAGGTCTTG 50-20 8 R-CGTGGAATTTGATATAGATATTC Staphylococcus spp. F-GGAATAACGTGACATATTGTA 00-200 8 R-TTCACTCGGTTTTGCTTGG Enterococcus faecalis F-ATCAAGTACAGTTAGTCTTTATTAG 94 4 R-ACGATTCAAAGCTAACTGAATCAGT Enterococcus faecium F-TTGAGGCAGACCAGATTGACG 658 4 R-TATGACAGCGACTCCGATTCC 市 售 乳 房 炎 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 試 劑 組 MAS- TiK (MASTiK Antibiotic Susceptibility Test ImmuCell Corporation U. S. A.) 的 使 用, 則 是 依 套 組 生 產 廠 商 說 明 書 所 提 供 的 操 作 程 序 進 行 操 作 與 判 讀 結 果 針 對 國 內 中 南 部 6 個 酪 農 戶 共 366 頭 乳 牛, 以 上 述 方 法 所 採 集 的 生 乳 樣 本 共 26 件 (Table 2), 其 中 總 含 菌 生 乳 佔 39.6% (482/26) 對 上 述 分 離 株 而 言, 革 蘭 氏 陽 性 菌 的 總 分 離 株 數 (350 株 ) 遠 較 革 蘭 氏 陰 性 菌 為 多 (32 株 ), 但 兩 者 均 可 隨 機 在 各 場 不 同 的 牛 隻 出 現, 而 不 見 有 場 次 間 的 明 顯 差 異 對 各 單 一 菌 種 所 佔 的 百 分 比 而 言, 以 大 腸 桿 菌 最 高 (74 株 /482,5.3%), 次 為 Staphylococcus chromogenes (53 株 /482,.0%) 與 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (52 株 /482,0.8%), 其 他 較 多 被 分 離 到 的 陽 性 菌 則 包 括 :Staphylococcus epidermidis (4 株 /482, 8.5%) 無 乳 鏈 球 菌 (Streptococcus agalactiae;8 株 /482,3.7%) Staphylococcus haemolyticus (7 株 /482,3.5%) 糞 腸 球 菌 (Enterococcus faecalis;
生 乳 中 潛 在 細 菌 種 類 與 藥 物 感 受 性 299 45 株 /482,9.3%) 與 Enterococcus faecium (8 株 / 482,3.7%), 其 他 分 離 率 較 低 的 各 革 蘭 氏 陽 性 菌 的 分 離 率 詳 如 Table 2 所 列 對 革 蘭 氏 陰 性 菌 而 言, 除 大 腸 桿 菌 具 最 高 分 離 率 外, 尚 有 產 酸 克 雷 伯 氏 菌 (Klebsiella oxytoca;34 株 /482,7.%) 弗 氏 檸 檬 酸 桿 菌 (Citrobacter freundii;2 株 /482, 2.5%) 與 兩 株 伺 機 性 病 原 菌 - 綠 膿 桿 菌 (Pseudomonas aeruginosa) (Table 2) 藥 物 感 受 性 試 驗 由 於 本 調 查 從 生 乳 中 所 分 得 的 革 蘭 氏 陰 陽 性 細 菌 種 類 多 達 23 種, 且 各 個 菌 種 分 離 數 差 異 極 大, 多 者 可 達 74 株 而 最 少 者 僅 為 2 株 (Table 2), 若 對 單 一 分 離 菌 種 的 藥 物 感 受 性 試 驗 分 The species, number and percentage of isolated bacteria from 26 raw milk samples Name of bacteria Number of bacteria Percentage Streptococcus agalactiae 8 3.7 Streptococcus bovis 9.9 Streptococcus dysgalactiae 8.7 Streptococcus uberis 5.0 Aerococcus viridans 9.9 Staphylococcus aureus 52 0.8 Staphylococcus chromogenes 53.0 Staphylococcus epidermidis 4 8.5 Staphylococcus hyicus 9.9 Staphylococcus simulans 5 3. Staphylococcus xylosus 3 2.7 Staphylococcus haemolyticus 7 3.5 Other Staphylococcus spp. 9 3.9 Enterococcus faecalis 45 9.3 Enterococcus faecium 8 3.7 Other Enterococcus spp. 9 3.9 Escherichia coli 74 5.4 Pseudomonas aeruginosa 2 0.4 Corynebacterium efficiens 4 0.8 Citrobacter freundii 2 2.5 Klebsiella oxytoca 34 7. Shigella boydii 4 0.8 Proteus mirabilis 2 0.4 Total 482 00 別 列 表, 則 將 過 於 瑣 碎 冗 長, 故 研 究 者 參 考 前 人 經 驗 [], 將 上 述 分 離 菌 株 以 臨 床 最 常 導 致 乳 房 炎 的 細 菌, 為 藥 物 敏 感 性 試 驗 歸 類 標 準, 這 包 含 了 金 黃 色 葡 萄 球 菌 鏈 球 菌 方 面 腸 球 菌 大 腸 桿 菌 與 其 他 革 蘭 氏 陽 性 與 陰 性 菌 屬 8 大 類 (Table 3 to Table 5) 試 驗 分 離 所 得 的 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus) 對 於 安 比 西 林 青 黴 素 紅 黴 素 羥 四 環 黴 素 與 氯 黴 素 均 已 具 有 高 比 率 的 抗 藥 性 ( 分 別 為 88.5% 86.5% 86.5% 78.8% 與 65.4%), 對 於 枯 草 菌 素 安 默 西 林 與 噁 唑 西 林 則 具 有 中 程 度 的 抗 藥 性 比 率 ( 分 別 為 48.% 36.5% 與 28.8%), 對 於 氟 奎 林 類 的 恩 氟 奎 林 羧 酸 與 人 用 的 ciprofloxacin 僅 有 較 低 的 抗 藥 性 比 率 ( 分 別 為.5% 與 9.6%) 其 他 79 株 葡 萄 球 菌 屬 細 菌 的 抗 藥 性 比 例, 雖 與 金 黃 色 葡 萄 球 菌 的 感 受 性 值 具 有 差 異, 但 均 略 高 或 約 略 相 似 (Table 3) 對 鏈 球 菌 而 言, 前 述 金 黃 色 葡 萄 球 菌 具 高 比 率 的 抗 藥 性 的 五 種 藥 品 ( 即 安 比 西 林 青 黴 素 紅 黴 素 羥 四 環 黴 素 與 氯 黴 素 ) 與 枯 草 菌 素, 其 所 呈 現 的 抗 藥 性 比 率 亦 相 對 具 有 高 比 例 的 抗 藥 性 ( 分 別 為 9.8% 8.6% 89.8% 7.4% 7.4% 與 65.3%), 但 對 於 安 默 西 林 恩 氟 奎 林 羧 酸 與 ciprofloxacin 則 具 有 中 至 低 抗 藥 性 比 率 ( 分 別 為 36.7% 4.3% 與 0.2%) (Table 3) 對 最 常 見 的 指 標 性 革 蘭 氏 陽 性 腸 球 菌 而 言, 其 對 所 選 藥 物 的 藥 物 感 受 性 遠 較 葡 萄 球 菌 屬 與 鏈 球 菌 屬 的 細 菌 為 高, 其 中 又 以 安 比 西 林 (88.9-9.2%) 與 青 黴 素 (94.4-95.6%) 最 為 明 顯 但 對 於 紅 黴 素 與 羥 四 環 黴 素 仍 保 持 極 高 比 例 的 抗 藥 性 ( 分 別 為 97.7-00% 與 00%) 對 分 離 株 最 多 的 大 腸 桿 菌 與 其 他 陰 性 菌 而 言, 則 見 具 有 相 似 且 一 致 性 的 敏 感 性 趨 勢, 即 對 恩 氟 奎 林 羧 酸 (86.2-83.8%) 與 健 牠 黴 素 (77-8.%) 具 最 佳 的 感 受 性 ; 但 對 雙 氫 鏈 黴 素 與 羥 四 環 黴 素 的 抗 藥 性 比 例 為 最 高 ( 分 別 為 00% 與 94.6-96.5%), 其 他 具 低 中 抗 藥 性 比 率 的 藥 品 與 對 細 菌 的 MIC 50 與 MIC 90 則 如 Table 5 所 列 對 市 售 乳 房 炎 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 試 劑 組 MAS- TiK 的 測 試 結 果, 則 會 因 分 離 菌 的 種 類 與 其 感 受 性 而 明 顯 有 所 不 同 即 部 份 分 離 菌 對 某 些 藥 物 可 準 確 估 計 其 感 受 性 ( 例 : 部 分 鏈 球 菌 對 紅 黴 素 ), 但 部 份 藥 物 則 會 超 出 本 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 試 劑 組 所 包 含 的 範 圍 ( 例 : 部 分 金 黃 色 葡 萄 球 菌 對 配 尼 西 林 與 紅 黴 素 )
300 The MIC 50,MIC 90 and the percentage of resistance of spp. and spp. for ten preselected antimicrobials Streptococcus spp. (n = 49) Staphylococcus aureus (n = 52) other Staphylococcus spp. (n = 67) Amoxicillin 4 64 36.7 0.25 2 36.5 4 40.7 Ampicillin 6 28 9.8 2 32 88.5 8 64 00 Bacitracin 256 52 65.3 28 52 48. 256 52 65.3 Penicillin 6 64 8.6 4 64 86.5 6 28 9 Oxicillin 32 256 *** 6 28.8 4 35.9 Erythromycin 4 28 89.8 32 256 86.5 64 28 88 Oxytetracycline 32 52 7.4 64 256 78.8 28 024 86.8 Enrofloxacin 0.25 4 4.3 0.5 8.5 0.5 4 3.8 Ciprofloxacin 0.25 2 0.2 0.25 2 9.6 0.25 2 2 Chloramphenicol 64 256 7.4 28 256 65.4 28 52 77.8 The MIC 50,MIC 90 and the percentage of resistance of spp. for nine pre-selected antimicrobials Enterococcus faecalis (n = 45) Enterococcus faecium (n = 8) other Enterococcus spp. (n = 9) Ampicillin 4 8 8.8 4 8. 2 4 0.5 Penicillin 2 4 4.4 2 5.6 2 4 5.3 Oxicillin 6 256 *** 8 28 *** 6 256 *** Ceftiofur 28 256 97.7 28 256 94.4 28 52 94.7 Erythromycin 256 52 97.7 28 256 00 28 256 00 Oxytetracycline 256 024 00 28 52 00 28 024 00 Enrofloxacin 2 8 5.6 2 4 6.7 2 8 5.8 Ciprofloxacin 4 5.6 2. 2 4 0.5 Gentamicin 64 024 37.8 28 024 44.4 64 024 36.8 討 論 本 次 試 驗 中, 於 收 集 的 26 個 生 乳 樣 本 中, 共 有 482 個 樣 本 (39.6 %) 含 菌 上 述 分 離 率 的 結 果 若 與 劉 (2002 年 ) 及 趙 (997 年 ) 的 研 究 結 果 比 較 得 知 : 劉 人 的 分 離 率 高 達 73%, 此 結 果 遠 高 於 本 次 調 查 所 見, 造 成 上 述 差 異 的 主 要 原 因 為 劉 人 是 針 對 頑 固 性 細 菌 性 乳 房 炎 病 例 進 行 細 菌 分 離, 故 獲 得 如 此 高 的 分 離 率 亦 不 足 為 奇 [,2] 反 觀 趙 人 的 研 究 條 件, 其 亦 是 針 對 生 乳 樣 本 進 行 採 樣, 結 果 顯 示 有 菌 性 乳 房 炎 分 離 率 為 5.4% 本 次 試 驗 主 針 對 乳 牛 場 外 表 健 康 的 乳 牛 進 行 採 樣 調 查, 此 採 樣 條 件 與 莊 人 的 採 樣 條 件 較 為 相 似 又 於 每 一 個 採 樣 場, 或 多 或 少 均 可 見 到 含 菌 生 乳 樣 本, 故 場 分 離 率 為 00% 此 一 結 果 當 然 可 能 會 被 質 疑 肇 因 於 污 染, 但 若 反 推 之, 約 60% 的 生 乳 樣 本 中 為 無 菌, 因 此, 採 樣 前 的 消 步 驟 與 採 樣 中 的 小 心 操 作 ( 避 免 碰 觸 管 壁 ) 手 續 均 應 屬 有 效 此 外, 綠 膿 桿 菌 與 變 形 桿 菌 環 境 中 常 見 的 污 染 菌 分 離 菌 株 數 均 低, 更 證 明 其 應 非 來 自 污 染
生 乳 中 潛 在 細 菌 種 類 與 藥 物 感 受 性 30 and other gram-negative bacteria for nine pre-se- The MIC 50,MIC 90 and the percentage of resistance of lected antimicrobials E. coli (n = 74) Other G (-) bacteria (n = 58) Ampicillin 28 52 82.4 28 52 94.8 Colistin 4 8 63.5 4 6 86.2 Ceftiofur 8 32 43.2 8 32 5.7 Ceftriaxone 6 28 48.6 8 64 46.5 Oxytetracycline 256 024 94.6 256 024 96.5 Enrofloxacin 8 6.2 8 3.8 Ciprofloxacin 0.5 4 2.2 0.5 2 8.6 Streptomycin 64 256 00 64 52 00 Gentamicin 4 6 23 4 6 8.9 細 菌 性 乳 房 炎 又 可 以 分 為 : 傳 染 性 環 境 性 與 伺 機 性 三 種 病 原 菌, 傳 染 性 病 原 菌 主 要 以 金 黃 色 葡 萄 球 菌 與 無 乳 鏈 球 菌 為 主, 環 境 性 病 原 菌 則 包 括 了 大 腸 桿 菌 與 乳 房 鏈 球 菌 (Streptococcus uberis) [0,,7,8,9]; 在 本 次 調 查 中, 以 環 境 性 大 腸 桿 菌 分 離 率 最 高 (74/482,5.4%), 其 次 為 Staphylococcus chromogenes (53/482,.0%) 與 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (52/482,0.8%), 此 結 果 與 劉 人 於 2002 年 研 究 所 得 結 果 約 略 相 似 [] 但 若 將 所 有 分 離 菌 以 菌 屬 為 最 低 劃 分 標 準 時, 對 分 離 率 而 言, 則 會 見 不 同 的 排 序, 即 由 多 而 少 的 順 序 為 葡 萄 球 菌 屬 > 腸 球 菌 屬 > 大 腸 桿 菌 > 鏈 球 菌 屬 > 與 其 他 革 蘭 氏 陰 性 菌 屬 此 外, 雖 然 於 分 離 株 中 可 見 Corynebacterium efficiens Klebsiella oxytoca Shigella boydii 不 同 的 革 蘭 氏 陽 性 或 陰 性 菌, 由 已 發 表 的 文 獻 中 得 知, 其 雖 可 引 起 各 種 不 同 的 系 統 性 感 染, 但 並 未 查 到 上 述 細 菌 在 乳 牛 引 起 乳 房 炎 的 相 關 報 告 故 對 上 述 細 菌 的 存 在 與 乳 房 炎 間 的 確 實 因 果 關 係, 需 要 更 近 一 步 的 研 究 細 菌 性 乳 房 炎 的 感 染 菌 對 治 療 用 藥 的 感 受 性, 成 為 影 響 療 效 的 首 要 因 素 市 售 含 抗 菌 劑 的 乳 房 炎 軟 膏 種 類 主 要 成 分 包 括 : 四 環 素 類 ( 四 環 黴 素 與 羥 四 環 黴 素 ) 胺 基 醣 類 ( 新 黴 素 與 雙 氫 鏈 黴 素 ) 乙 內 醯 胺 與 頭 孢 子 素 類 ( 安 比 西 林 青 黴 素 安 默 西 林 氯 噁 唑 西 林 雙 氯 噁 唑 西 林 cefuroxime 與 cephapirin) 與 枯 草 菌 素 由 本 次 分 離 菌 株 進 行 藥 物 感 受 性 試 驗 結 果 發 現, 金 黃 色 葡 萄 球 菌 對 於 安 比 西 林 青 黴 素 羥 四 環 黴 素 與 枯 草 菌 素 均 已 具 有 高 抗 藥 性 比 例 ; 相 同 情 形 亦 見 於 無 乳 鏈 球 菌 與 其 他 鏈 球 菌 環 境 性 細 菌 - 大 腸 桿 菌 對 於 安 比 西 林 可 利 斯 汀 畜 福 ceftriaxone 鏈 黴 素 抗 菌 劑 亦 具 有 中 至 高 抗 藥 性 比 例 雖 然 各 場 次 間 的 抗 藥 性 情 形 不 盡 相 同, 但 若 由 上 述 感 受 性 結 果 仍 可 輕 易 推 知, 一 般 常 用 的 乳 房 炎 軟 膏, 現 可 能 已 無 法 達 到 預 期 的 療 效, 而 需 要 增 加 使 用 劑 量 或 更 換 種 類 才 能 達 到 治 療 效 果, 相 對 而 言, 增 加 劑 量 的 方 式 不 但 會 增 加 治 療 支 出 外, 同 時 亦 會 增 加 停 藥 期 與 增 強 抗 生 素 選 擇 性 壓 力 與 / 或 未 來 抗 藥 性 產 生 的 風 險, 而 更 需 在 獸 醫 師 ( 佐 ) 的 診 治 下 進 行 另 由 感 受 性 結 果 得 知, 恩 氟 奎 林 羧 酸 ( 與 健 牠 黴 素 對 革 蘭 氏 陰 性 菌 ) 對 所 有 分 離 菌 仍 均 保 持 良 好 的 感 受 性, 這 可 能 是 因 為 臨 床 上 多 為 注 射 劑 型, 使 用 不 若 乳 房 灌 注 劑 型 為 方 便, 故 較 少 使 用 所 至 但 也 因 恩 氟 奎 林 羧 酸 主 為 注 射 而 非 乳 房 灌 注 劑 型 且 被 建 議 用 於 乾 乳 期, 故 若 一 定 需 要 使 用 時, 其 乳 汁 去 棄 期 將 更 需 注 意 又 因 國 內 研 究 者 多 著 重 金 黃 色 葡 萄 球 菌 的 研 究 與 感 受 性 試 驗, 故 若 要 以 本 次 結 果 與 國 內 相 似 調 查 且 已 發 表 的 論 文 進 行 比 較 [], 亦 僅 能 比 較 此 菌 與 共 同 測 試 過 的 相 同 抗 菌 劑 ; 由 本 次 分 離 菌 株 進 行 藥 物 感 受 性 試 驗 結 果 發 現, 金 黃 色 葡 萄 球 菌 對 於 安 比 西 林 與 青 黴 素 與 羥 四 環 黴 素 的 抗 藥 性 比 例, 均 較 以 往 提 高 約 5-20%, 此 應 明 顯 與 長 期 使 用 及 選 擇 性 壓 力 相 關 若 對 單 一 牧 場 內 金 黃 色 葡 萄 球 菌 分 離 株 較 多 的 場 進 行 該 菌 感 受 性 值 的 比 較 ( 於 結 果 中 未 單 獨 標 示 ), 結 果 發 現 各 分 離 菌 株 的 感 受 性 值 多 均 極 相 似, 此 結
302 果 應 是 代 表 場 內 有 相 同 單 一 型 態 金 黃 色 葡 萄 球 菌, 於 場 內 環 境 或 個 體 間 進 行 散 播 感 染 所 致 至 於 推 究 造 成 原 因, 則 可 能 是 由 於 金 黃 色 葡 萄 球 菌 所 引 起 乳 房 炎 常 為 亞 臨 床 型 乳 房 炎, 乳 房 外 觀 與 乳 汁 於 肉 眼 下 觀 察 並 無 異 常, 所 以 場 內 散 播 較 容 易 被 忽 視 所 致 此 外, 本 菌 亦 可 為 體 表 常 在 菌 之 一 且 極 易 存 在 於 環 境 中, 所 以 藉 由 不 同 的 機 械 性 媒 介 或 動 物 直 接 接 觸 而 散 播, 亦 可 能 為 重 要 原 因 之 一 另 由 此 結 果 亦 可 旁 證 牧 場 內 環 境 及 榨 乳 設 備 清 潔 衛 生 與 消 工 作 的 重 要 性 由 採 樣 過 程 口 頭 詢 問 的 結 果 得 知, 酪 農 戶 在 初 見 乳 房 炎 的 症 狀 時, 雖 會 延 請 獸 醫 師 ( 佐 ) 進 行 診 療, 但 不 論 處 理 方 式 為 何, 均 很 少 會 將 治 療 前 後 的 乳 汁 樣 本, 主 動 送 交 地 方 防 疫 機 關 或 學 術 單 位 的 實 驗 室, 進 行 病 原 分 離 與 藥 物 感 受 性 試 驗 ; 另 一 方 面, 因 為 採 樣 過 程 會 影 響 集 乳 時 間 與 乳 牛 泌 乳 量, 所 以 酪 農 戶 多 無 進 行 大 規 模 例 行 性 採 樣 送 檢 的 意 願 至 於 國 內 大 動 物 獸 醫 師 人 數 較 少, 亦 為 國 內 並 未 見 定 期 性 大 規 模 地 調 查 或 較 少 見 病 例 報 告 的 原 因 之 ㄧ 另 實 際 購 買 自 國 外 進 口 且 可 自 行 快 速 操 作 的 乳 房 炎 抗 生 素 感 受 性 試 驗 試 劑 套 組 MASTiK 進 行 測 試, 探 討 該 產 品 在 我 國 的 適 用 性 由 產 品 說 明 書 得 知, 其 所 含 抗 菌 劑 的 濃 度 如 下 :erythromycin (0.5-4.0 g/ml) oxacillin (0.5-4.0 g/ml) ampicillin (0.25-4.0 g/ml) penicillin (0.2-2.0 g/ml) cephalothin (0.5-6.0 g/ml) pirllmycin (0.25-4.0 g/ ml) oxytetracycline (2.0-6.0 g/ml) sulfadimethoxine (0.25-2.0 g/ml) 若 與 本 次 以 微 量 肉 湯 稀 釋 法 的 試 驗 結 果 比 較, 以 金 黃 色 葡 萄 球 菌 為 例, 對 於 penicillin (4 g/ml) erythromycin (32 g/ml) 與 oxytetracycline (64 g/ml) 的 MIC 50 值, 均 超 過 套 組 所 標 示 的 有 效 範 圍 以 鏈 球 菌 為 例 :ampicillin (6 g/ml) penicillin (6 g/ml) oxacillin (32 g/ml) erythromycin (4 g/ml) 與 oxytetracycline (32 g/ml) 的 MIC 50 值 亦 多 超 過 套 組 所 所 標 示 的 有 效 範 圍 故 對 此 二 菌 而 言, 超 過 50 % 的 分 離 菌 無 法 以 此 套 組 測 試 所 需 的 抗 菌 劑 濃 度 而 大 腸 桿 菌 方 面 ampicillin (28 g/ml) 與 oxytetracycline (256 g/ml) 亦 有 相 同 情 況 發 生 另 由 本 試 驗 中 的 藥 物 敏 感 性 試 驗 結 果 得 知, 部 分 藥 物 如 增 加 劑 量, 即 可 達 到 治 療 的 效 果, 但 部 份 藥 物 幾 乎 完 全 無 效, 而 進 口 套 組 中 所 含 藥 物 濃 度 多 偏 低, 篩 選 能 力 有 限, 故 自 行 設 計 與 發 展 符 合 我 國 現 況 的 藥 物 敏 感 性 試 驗 套 組, 確 有 其 必 要 性 總 之, 由 本 調 查 結 果 得 知, 外 表 健 康 乳 牛 生 乳 中 含 菌 量 約 佔 採 樣 數 三 分 之 ㄧ 強, 分 離 株 對 乳 房 炎 常 用 治 療 藥 品 的 抗 藥 性, 在 場 次 間 常 明 顯 不 同, 因 此, 適 當 的 藥 物 感 受 性 試 驗 或 場 內 定 期 的 監 測, 均 將 有 助 於 細 菌 性 乳 房 炎 的 預 防 與 治 療 此 外, 發 展 適 合 我 國 現 況 的 藥 物 敏 感 性 試 驗 套 組, 實 有 其 必 要 性 致 謝 作 者 除 要 感 謝 王 郁 菁 孫 友 梅 中 興 大 學 莊 士 德 老 師 研 究 室 同 學 與 曾 參 與 本 次 調 查 的 酪 農 場 外, 並 要 感 謝 行 政 院 農 業 委 員 會 動 植 物 防 疫 檢 疫 局 提 供 研 究 經 費 參 考 文 獻. 劉 世 賢 施 閔 郡 劉 炳 燦 黃 森 源 吳 虹 惠 余 明 德 廖 明 輝 乳 牛 乳 房 炎 細 菌 分 離 鑑 定 及 藥 物 敏 感 性 試 驗 中 華 民 國 獸 醫 學 會 暨 台 灣 省 畜 牧 學 會 9 年 度 聯 合 學 術 發 表 會 P35, 2002 2. 趙 瑞 龍 楊 忠 亮 董 好 德 張 登 欽 台 灣 中 部 地 區 乳 牛 潛 在 性 乳 房 炎 調 查 中 華 獸 醫 誌 23: 6-65,997 3. Barkema HW, Schukken YH, Lam TJ, Beiboer ML, Wilmink H, Benedictus G, Brand A. Incidence of clinical mastitis in dairy herds grouped in three categories by bulk milk somatic cell counts. J Dairy Sci 8: 4-49, 998. 4. Bradley A. Bovine mastitis: An evolving disease. Vet J 64: 6-28, 2002. 5. Chagunda MG, Larsen GT, Bjerring M, Ingvartsen KL. L-lactate dehydrogenase and N-acetyl- -D-glucosaminidase activities in bovine milk as indicators of non-specific mastitis. J Dairy Res 73: 43-440, 2006. 6. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Document M7-A7. Wayne, PA, 2006. 7. Erskine RJ, Kirk JH, Tyler JW, DeGraves FJ. Advances in the therapy for mastitis.vet Clin North Am Food Anim Pract 9: 499-57, 993. 8. Forsman P, Tilsala-Timisjärvi A, Alatossava T. Identification of staphylococcal and streptococcal causes of bovine mastitis using 6S-23S rrna spacer regions. Microbiology 43: 349-3500, 997. 9. Gröhn, YT, Wilson DJ, González RN, Hertl JA, Schulte H, Bennett G, Schukken YH. Effect of pathogenspecific clinical mastitis on milk yield in dairy cows. J Dairy Sci 87: 3358-3374, 2004. 0. Hogan JS, Smith KL. Coliform mastitis. Vet Res 34: 507-59, 2003.. Hogan JS, Weiss WP, Smith KL, Todhunter DA, Schoenberger PS, Sordillo LM. Effects of an J5 vaccine on mild clinical coliform mastitis. J Dairy Sci 78: 285-290, 995.
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