32期

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祥时
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1 中国农学通报,3(3):4347 Chinese Agricultural cience Bulletin 市售草鱼鳃中细菌的分离鉴定及分析胡秀彩 1, 兰云, 沈晓静, 吕爱军 1 1, 朱爱华 ( 1 江苏师范大学江苏省药用植物生物技术重点实验室, 江苏徐州 ; 江苏师范大学生命科学学院, 江苏徐州 ) 摘要 : 对徐州市售草鱼细菌带染状况及分析, 结果表明从其鳃中分离到 4 株革兰氏阴性短杆菌, 暂时编号为 ZYF1 ZYF ZYF3 和 ZYF4, 查阅数值编码鉴定 ZYF1 菌株为志贺菌 (higella sp.), ZYF ZYF3 菌株为大肠埃希菌 (Escherichia coli),zyf4 菌株为泉居沙雷菌 (erratia fonticola) 药敏试验结果表明,4 株分离菌的耐药率分别为 7.8% 7.4% 6.% 和 8.8%, 均对氨苄西林阿莫西林复方新诺明磺胺异恶唑和甲氧苄啶等种抗生素耐药本研究显示市售草鱼存在志贺菌大肠埃希菌带染现象, 对多种抗生素耐药, 这为食源性细菌鉴定及鱼病防治提供参考关键词 : 草鱼 ; 鳃 ; 分离鉴定 ; 药敏试验中图分类号 :378 文献标志码 :A 论文编号 :3 dentification and Antimicrobial esistance Analysis of Bacteria solated from the Gills of Commercial Grass Carp (Ctenopharyngodon idellus) Hu Xiucai 1, Lan Yun, hen Xiaojing, Lv Aijun, Zhu Aihua ( 1 Key Laboratory of Biotechnology for Medicinal Plant of Jiangsu Province, Jiangsu Normal University, Xuzhou Jiangsu ; chool of Life ciences, Jiangsu Normal University, Xuzhou Jiangsu ) Abstract: nvestigation was conducted on bacterial contamination and antimicrobial resistance of the strains isolated from the gills of commercial Grass carp (Ctenopharyngodon idellus) in Xuzhou, four isolated strains were gramnegative and short rodshaped bacteria, and tentatively named ZYF 1, ZYF, ZYF3 and ZYF 4, respectively. According to the values of coding method of four strains, ZYF1 was identified as higella sp., ZYF and ZYF3 were identified as Escherichia coli, and ZYF 4 was identified as erratia fonticola. The antimicrobial susceptibility assay indicated that the resistance rates of ZYF 1, ZYF, ZYF 3 and ZYF 4 strains were 7.8% 7.4% 6.% and 8.8%, respectively. Four strains showed antibiotic resistance to eleven kinds of antibiotics, such as ampicillin, amoxicillin, trimethoprim sulfamethoxazole, sulfisoxazole, trimethoprim and so on. t is concluded that there are higella and Escherichia coli contamination in commercially available Ctenopharyngodon idellus in Xuzhou, and the bacteria showed multidrug resistances in antimicrobial susceptibility assay. The conclusion will provide scientific references for identification of foodborne bacteria and control of bacterial disease in fish. Key words: Ctenopharyngodon idellus; gill; isolation and identification; antimicrobial susceptibility assay 引言志贺菌属 (higella) 埃希菌属 (Escherichia) 和沙雷菌属 (erratia) 等均为肠杆菌科细菌, 也是主要的肠道 [] 致病菌, 可引起人兽及鱼类疾病张红见等从鲫鱼基金项目 : 国家自然科学基金项目嗜水气单胞菌诱导斑马鱼皮肤免疫应答的分子机制 (38847), 江苏省青蓝工程 () 第一作者简介 : 胡秀彩, 女,76 年出生, 江苏铜山人, 实验师, 硕士, 主要从事资源微生物学研究 Tel:8343, [email protected] 通讯作者 : 吕爱军, 男,73 年出生, 内蒙古锡盟人, 副教授, 博士, 主要从事微生物及免疫学研究通信地址 : 江苏省徐州市铜山区上海路号, 江苏师范大学生命科学学院,Tel:8343, [email protected] 收稿日期 :3, 修回日期 :3

), ZYF ZYF3 菌株为大肠埃希菌 (Escherichia coli),zyf4 菌株为泉居沙雷菌 (erratia fonticola) 药敏试验结果表明,4 株分离菌的耐药率分别为 7.8% 7.4% 6.% 和 8.

2 44 中国农学通报 (Carassius carp) 鳃中分离到沙门菌 (almonella) 和志贺菌 (higella), 发现鱼类污染肠道致病菌现象严重胡秀彩等研究鲤鱼 (Cyprinus carpio) 肠道细菌获得结果 [] [4] 与张红见等报道基本一致 Onyango 等研究表明罗非鱼 (Oreochromis mossambicus) 带染细菌主要为志 [] 贺菌大肠埃希菌和沙门菌等肠杆菌 Baya 等从白鲈鱼 (White perch) 中分离到粘质沙雷菌 (erratia marcescens), 报道该菌为鱼类潜在病原菌之一 Akoachere 等从赤鯛 (Pagrus pagrus) 金鲳 (Monodactylus sebae) 和鲇鱼 (Arius heudelottii) 等多种鱼类鳃皮肤和肠道中分离到埃希菌沙雷菌和克雷伯菌 (Klebsiella) 等条件致病菌, 表明人类致病菌污染鱼类现象普遍因此, 研究鱼类食源性细菌污染状况及, 对鱼类健康养殖公共卫生及水产品安全检疫等具有重要意义鱼类鳃具有气体交换排泄代谢物和参与渗透调节功能, 其表面积大细菌易聚集, 是细菌栖息繁殖场所之一近年来, 关于鱼类鳃中细菌研究, 仍处于起步阶段最近, 王艺等从市售鲫鱼 (Carassius carp) 鳃中分离到 1 株迟钝爱德华氏菌 (Edwardsiella tarda), 报道是一种人鱼共患病原菌目前, 针对草鱼 (Ctenopharyngodon idellus) 鳃中细菌的分离鉴定及耐药性分析, 国内外尚未见文献报道本研究从徐州市售草鱼鳃中分离到 4 株细菌, 并进行生理生化鉴定相关研究, 不仅有助于了解鱼类食源性细菌污染情况及耐药机制, 而且为鱼病防治等提供科学参考 1 材料与方法 1.1 材料草鱼 ( 体重约. kg) 购自江苏省徐州市某农贸市场, 随机选择健康活泼的草鱼, 迅速带回实验室饲养备用 LB 培养基肠杆菌科细菌生化编码鉴定管 (GYZ e) 和药敏纸片等均购自杭州微生物试剂有限公司 1. 方法细菌分离参照王艺等方法进行无菌操作取适量的鳃组织, 用无菌生理盐水冲洗 3 次, 放入生理盐水中振荡 min, 取 µl 生理盐水涂布于 LB 平板, 培养过夜, 挑取单菌落经 ~3 次反复传代获得纯种菌株, 分别接种于 LB 培养基, 培养 ~4 h, 于 4 保存备用, 进行革兰氏染色和镜检细菌生理生化及药敏试验参照胡秀彩等方法进行无菌操作挑取适量细菌接种于细菌生化鉴定管, 于恒温培养 48 h 后, 观察记录结果采用 KB 法进行药敏试验, 选用种抗生素对 4 株细菌进行药物抑菌试验, 测量抑菌圈直径取平均值结果与分析.1 细菌的形态及生化特征从徐州市售草鱼鳃中分离得到 4 株细菌, 暂时编号为 ZYF1 ZYF ZYF3 和 ZYF4, 革兰氏染色均为革兰氏阴性短杆菌 ; 其中 ZYF1 菌落为黄色中等大小半透明表面光滑,ZYF 和 ZYF3 菌落均为浅黄色圆形边缘整齐,ZYF4 菌落呈白色较小不透明选用肠杆菌科细菌生化编码鉴定管进行项生化特性检测, 包括硫化氢产生苯丙氨酸脱氨酶葡萄糖酸盐靛基质 M 枸橼酸盐尿素动力葡萄糖产气赖氨酸脱羧酶鸟氨酸脱羧酶棉子糖山梨醇侧金盏花醇和木糖试验结果表明 :4 株细菌均能利用葡萄糖产酸产气,M 试验阳性, 硫化氢苯丙氨酸脱氨酶葡萄糖酸盐和脲酶试验阴性 ( 见表 1); 结合菌落及形态特征生理生化特性,ZYF1 菌株编码值为 61,ZYF ZYF3 菌株编码值为 6,ZYF4 菌株编码值为 3377, 查询数值编码表, 鉴定结果表明 ZYF1 菌株为志贺菌 (higella sp.),zyf 和 ZYF3 菌株为大肠埃希菌 (Escherichia coli),zyf4 菌株为泉居沙雷菌 (erratia fonticola) 表 1 草鱼鳃中分离菌的生化特性肠杆菌科细菌生化编码鉴定管菌株硫化氢产生苯丙氨酸脱氨酶葡萄糖酸盐靛基质 M 试验枸橼酸盐尿素动力葡萄糖产气赖氨酸脱羧酶鸟氨酸脱羧酶棉子糖山梨醇侧金盏花醇木糖 ZYF1 ZYF/ZYF3 ZYF4 注 : 代表阴性, 代表阳性. 药敏试验结果对所测种抗生素药敏试验结果分析发现,4 株细菌耐药率达 6% 以上,ZYF 1 ZYF ZYF 3 和 ZYF4 分离株的耐药率分别为 7.8% 7.4% 6.% 和

(Oreochromis mossambicus) 带染细菌主要为志 [] 贺菌大肠埃希菌和沙门菌等肠杆菌 Baya 等从白鲈鱼 (White perch) 中分离到粘质沙雷菌 (erratia marcescens), 报道该菌为鱼类潜在病原菌之一 Akoachere 等从赤鯛 (Pagrus

3 胡秀彩等 : 市售草鱼鳃中细菌的分离鉴定及分析 4 8.8%, 均对氨苄西林阿莫西林哌拉西林复方新诺明磺胺异恶唑洁霉素甲硝唑甲氧苄啶替考拉宁制菌霉素和克林霉素等种抗生素耐药 ; 其中 ZYF ZYF3 相似, 仅对丁胺卡那霉素红霉素和奥复星存在差异, 这与 ZYF ZYF3 均为大肠埃希菌的生化鉴定结果相符 ;ZYF1 ZYF4 耐药率达 7% 以上, 而对头孢噻吩头孢克肟头孢噻肟先锋霉素 Ⅳ 四环素制菌霉素萘啶酸诺氟沙星奥复星氯霉素利福平等多种抗生素不同此外,4 株细菌对庆大霉素卡那霉素乙基西梭霉素和阿奇霉素敏感 ; 表草鱼鳃中分离菌药敏试验抗生素浓度 /μg ZYF1 ZYF ZYF3 ZYF4 丁胺卡那霉素 3 4 庆大霉素 1 1 卡那霉素 3 乙基西梭霉素 3 头孢噻吩 3 1 头孢克肟 3 4 先锋霉素 Ⅳ 3 氨苄西林 1 1 阿莫西林 1 哌拉西林 1 复方新诺明 3 4 磺胺异恶唑 3 洁霉素 8 甲硝唑甲氧苄啶替考拉宁 3 四环素 3 8 头孢孟多 3 头孢噻肟 3 4 阿奇霉素红霉素制霉菌素 1 萘啶酸 3 诺氟沙星 1 31 奥复星氯霉素利福平克林霉素呋喃妥因 3 注 : 表示耐药, 表示中敏, 表示高度敏感 ZYF1 对诺氟沙星氯霉素耐药, 而 ZYF ZYF3 和 ZYF4 菌株对种抗生素均敏感 ( 见表 ) 3 讨论鱼类鳃不仅在呼吸代谢毒物降解及排泄等方

生化鉴定结果相符 ;ZYF1 ZYF4 耐药率达 7% 以上, 而对头孢噻吩头孢克肟头孢噻肟先锋霉素 Ⅳ 四环素制菌霉素萘啶酸诺氟沙星奥复星氯霉素利福平等多种抗生素不同此外,4 株细菌对庆大霉素卡那霉素乙基西梭霉素和阿奇霉素敏感

4 46 中国农学通报面发挥功能, 也是鱼类细菌的主要栖息繁殖场所, 易受病原菌污染因此, 研究鱼类鳃中细菌对了解食源性细菌污染状况鱼类健康养殖等有重要意义近年来, 环境污染导致养殖鱼类带染细菌现状, 倍受国内外学者关注 [4,6,8] 与鱼类肠道细菌研究相比 [], 目前对鳃中细菌的分离鉴定研究报道较少近几 [] [4] [] 年, 相继从鲫鲤罗非鱼和鲈鱼等鱼类鳃肠道中检测到志贺菌沙门菌大肠杆菌和沙雷菌等致病菌, 揭示鱼类细菌污染情况严重试验从市售草鱼鳃中分离到志贺菌大肠埃希菌和泉居沙雷菌, 并且市售草鱼尚无明显病变, 说明很可能为水体污染所致, 其导致人类食源性细菌污染发病规律有待进一步研究研究表明, 鱼类鳃中细菌与周围水环境有关, 水中 [] 病原菌可通过鳃而感染鱼类 himotori 等报道志贺菌人工接种鱼贝类可再分离获得, 证实志贺菌能引起 [1] 养殖水体污染 AlBahry 等通过研究城市污水污染海水和鱼中细菌, 指出城市污水给沿海鱼类带来严重污染, 认为鱼鳃肠道细菌是监测沿海污水排放对鱼 [4] 类影响因素之一 Onyango 等通过对市售罗非鱼体内细菌检测, 发现主要为志贺菌大肠杆菌和沙门菌等肠杆菌, 推测城市污水污染为罗非鱼感染主要原因之一 Akoachere 等通过对鱼皮肤鳃和肠道细菌进行分离鉴定, 发现细菌主要来自污染水体中的埃希菌沙雷菌和柠檬酸杆菌 (Citrobacter) 等肠道致病菌, 其中皮肤污染率为 4.6%, 鳃污染率为 8.% 由此可见, 这些细菌可能来自养殖水体, 从水中进入鳃后再大量繁殖, 推断鱼鳃很可能是一些条件致病菌的栖息场所笔者对市售草鱼鳃中细菌进行分离鉴定, 得到与国外学者类似结论 [1,1] 因此, 应该引起相关部门和消费者重视, 对市售鱼类等水产品加强监管监测, 积极做好预防控制工作, 以减少食源性水产品病原菌污染发生在鱼类养殖过程中, 水环境条件改变, 如水温溶解氧和水污染等均可破坏鳃中菌群平衡, 促使条件致病菌异常增殖, 导致鱼病常有暴发 ; 同时, 药物不合理使用或滥用, 导致诸多耐药菌株产生, 进一步增加 [] 了鱼病防治难度江艳华等研究发现养殖海虾中副溶血弧菌 (Vibrio parahaemolyticus) 存在较严重污染, 其中 6% 的菌株对氨苄西林和阿莫西林耐药, 部 [] 分菌株呈现多重 Onyuka 等从水和鱼体中分离得到大肠埃希菌沙门菌和霍乱弧菌 (Vibrio cholerae) 等, 发现分离菌对诺氟沙星和环丙沙星敏感, 对氨苄西林复方新诺明和四环素具强胡秀彩等从市售鲤鱼肠道中分离获得志贺菌, 证实其对头孢孟多高度敏感, 对复方新诺明磺胺异恶唑洁霉素和甲氧苄啶等耐药 Akoachere 等研究表明鱼类鳃皮肤和肠道中埃希菌沙雷菌和克雷伯菌等肠杆菌污染严重, 所有菌株对环丙沙星氧氟沙星和复方新诺明敏感, 其中 4.7% 的分离菌株对氨苄青霉 [] 素耐药颜秉秉等从团头鲂肠道中分离的弗氏志贺菌对洁霉素复方新诺明和头孢噻吩等 3 种抗生 [] 素 % 以上具有于清华对医院感染沙雷菌分析发现, 对氨苄西林头孢唑林哌拉西林耐药率在 8% 以上实验药敏结果分析发现志贺氏菌大肠埃希菌泉居沙雷菌等 4 株分离细菌对 β 内酰胺类 ( 氨苄西林阿莫西林哌拉西林 ) 磺胺类 ( 复方新诺明磺胺异恶唑 ) 以及洁霉素甲硝唑和甲氧苄啶等药物具强, 对所测种抗生素耐药率达 6% 以上, 推测这种现状不仅与临床过度使用药物有关, 而且耐药菌株可造成鱼类等水产品污染实验对草鱼鳃中细菌进行分离鉴定及分析, 结果表明阿奇霉素以及氨基糖苷类药物 ( 庆大霉素卡那霉素乙基西梭霉素 ) 能够有效抑制 4 株分离细菌, 这为水产健康养殖鱼病防治以及水产品安全检疫等提供科学参考参考文献 [1] 张红见, 韩志辉, 李小龙. 鲫鱼鳃中沙门氏菌的分离与鉴定 [J]. 青海畜牧兽医杂志,,():. [] 张红见, 韩志辉, 顾锡霞. 西宁市售鲤鱼鳃中志贺氏菌的检测及血清学分型 [J]. 甘肃畜牧兽医,1,4(3):. 胡秀彩, 胡宏晓, 吕爱军. 鲫鱼肠道中沙门氏菌志贺氏菌分离鉴定及药敏试验 [J]. 中国畜牧兽医,,38(4):. [4] Onyango MD, Wandili, Kakai, et al. solation of almonella and higella from fish harvested from the Winam Gulf of Lake Victoria, Kenya [J]. J nfect Developing Countries,,3():. DO: 1.38/jidc.6 [] Baya AM, Toranzo AE, Lupiani B, et al. erratia marcescens: A potential pathogen for fish [J]. Journal of Fish Diseases, (1): 6. DO: 1./j tb63.x Akoachere JF, Bughe N, Oben BO, et al. Phenotypic characterization of human pathogenic bacteria in fishes from the coastal waters of outh West Cameroon: Public health implications [J]. eviews of Environmental Health,, 4 (): 76. DO: 1./EVEH 王艺, 李槿年, 兰云, 等. 鲫鱼鳃中迟钝爱德华氏菌的分离与鉴定 [J]. 江苏农业科学,,41():1. [8] Toranzo AE, Magariños B, omalde JL. A review of the main

肠道细菌研究相比 [], 目前对鳃中细菌的分离鉴定研究报道较少近几 [] [4] [] 年, 相继从鲫鲤罗非鱼和鲈鱼等鱼类鳃肠道中检测到志贺菌沙门菌大肠杆菌和沙雷菌等致病菌, 揭示鱼类细菌污染情况严重试验从市售草鱼鳃中分离到

5 胡秀彩等 : 市售草鱼鳃中细菌的分离鉴定及分析 47 bacterial fish diseases in mariculture systems [J]. Aquaculture,, 46 (1): DO: 1.6/j.aquaculture..1. [] himotori, Kojima F, Harushima H, et al. Evaluation of recovery methods of higella species from fresh marine fish and shellfishes [J]. Kansenshogaku Zasshi,, 64 (1): [1] AlBahry N, Mahmoud Y, AlBelushi KA, et al. Coastal sewage discharge and its impact on fish with reference to antibiotic resistant enteric bacteria and enteric pathogens as bioindicators of pollution [J]. Chemosphere,, 77 (): DO: 1.6/j. chemosphere... [] 江艳华, 姚琳, 李风铃, 等. 青岛市售养殖海水虾中副溶血性弧菌的分离及分析 [J]. 中国人兽共患病学报,,():. [] Onyuka JHO, Kakai, Onyango MD, et al. Prevalence and antimicrobial susceptibility patterns of Enteric bacteria isolated from water and fish in Lake Victoria Basin of Western Kenya [J]. nternational Journal of Biological and Medical ciences,, 1 (1): 6. [] 颜秉秉, 吕爱军, 骆伟洁, 等. 团头鲂肠道细菌的分离鉴定与药敏试验 [J]. 中国畜牧兽医,1,37():47. [] 于清华. 沙雷氏菌医院感染特点及对常用抗菌药物的分析 [J]. 医学理论与实践,,():66.

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5期xin

5期xin 中国农学通报 2014,30(5):23-27 Chinese Agricultural Science Bulletin 大肠杆菌生物膜的筛选及生长曲线测定喻华英, 李启峰 ( 塔里木大学动物科学学院, 新疆阿拉尔 843300) 摘要 : 为探究犊牛腹泻病中大肠杆菌生物膜的形成