Microsoft Word 獸醫所顏郁姍論文

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1 國 立 中 興 大 學 獸 醫 學 系 碩 士 學 位 論 文 臺 灣 乳 牛 乳 汁 樣 本 分 離 出 鏈 球 菌 之 調 查 及 其 抗 藥 性 之 研 究 Prevalence of Streptococcus spp. isolated from bovine milk and study of their characteristics of antimicrobial resistance in Taiwan 指 導 教 授 : 莊 士 德 博 士 Dr. Shih-Te Chuang 研 究 生 : 顏 郁 姍 Yu-Shan Yen 中 華 民 國 一 百 零 三 年 七 月

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3 摘 要 乳 房 炎 一 直 以 來 為 乳 牛 重 要 的 疾 病 之 一, 此 外, 此 疾 病 也 造 成 全 世 界 的 乳 品 行 業 每 年 損 失 約 數 十 億 元 最 常 造 成 乳 房 炎 的 微 生 物 包 括 葡 萄 球 菌 屬, 鏈 球 菌 屬, 和 大 腸 菌 群 細 菌 所 導 致 的 乳 房 炎 疾 病 常 使 用 抗 生 素 藥 物 來 做 治 療, 但 是 細 菌 具 有 抗 藥 性 的 問 題 可 能 為 藥 物 治 療 失 敗 的 主 要 原 因 之 一 本 研 究 的 目 的 為 調 查 臺 灣 由 乳 牛 生 乳 中 分 離 出 之 鏈 球 菌 菌 種 的 盛 行 率 及 其 抗 藥 性 型 態 的 分 佈 在 本 實 驗 中, 共 有 157 株 鏈 球 菌 菌 株 被 分 離 鑑 定 出, 乳 房 鏈 球 菌 (Streptococcus uberis) 有 116 株, 異 乳 鏈 球 菌 (Streptococcus dysgalactiae) 有 16 株, 牛 鏈 球 菌 (Streptococcus bovis) 有 16 株, 無 乳 鏈 球 菌 (Streptococcus agalactiae) 有 6 株, 馬 鏈 球 菌 (Streptococcus equines) 有 2 株 及 1 株 的 緩 症 鏈 球 菌 (Streptococcus mistis) 被 收 集 於 157 株 鏈 球 菌 抗 生 素 藥 物 檢 測 中, 觀 察 到 對 於 amikacin (98.7%) kanamycin (98.7%) streptomycin (98.7%) 及 neomycin (98.0%) 具 有 最 顯 著 的 抗 藥 性, 其 次 為 oxytetracycline (85.4%) tetracycline (85.4%) 及 lincomycin (75.8%) 在 所 有 的 鏈 球 菌 觀 察 到 出 現 最 低 抗 藥 性 的 藥 物 為 amoxicillin (0.7%) cefuroxime (0.7%) cefazolin (1.9%) ceftiofur (1.9%) bacitracin (3.2%) 及 cloxacillin (4.5%) 於 檢 測 的 所 有 菌 株 中 觀 察 會 對 3 種 以 上 至 11 種 抗 生 素 藥 物 產 生 抗 藥 性 共 有 155 株 (155/157, 98.7% ) 選 擇 合 適 的 藥 物 來 治 療 乳 房 炎 可 以 確 保 抗 生 素 藥 物 治 療 的 效 力 和 避 免 藥 物 殘 留 的 問 題, 並 且 是 必 須 持 續 的 監 控 鏈 球 菌 對 於 抗 生 素 藥 物 敏 感 表 現 度 i

4 Abstract Bovine mastitis is one of the most important diseases in dairy cattle. The most commonly isolated mastitis microrganisms include Staphylococcus spp., Streptococcus spp., and coliforms. Antimicrobial therapy is considered as the most common way to treat mastitis in dairy cow, but the problem of antimicrobial resistance bacteria could be one of the reasons for treatment failures. The aim of this study was to investigate the prevalence of Streptococcus spp. isolated from bovine milk and to study their characteristics of antimicrobial resistance in Taiwan. A total of 157 Streptococcus species isolates including S. uberis (n=116), S. bovis (n=16), S. dysgalactiae (n=16), S. agalactiae (n=6), S. equines (n=2), and S. mitis (n=1) was isolated and identified in this study. Among the 157 Streptococcus isolates tested, manifest antimicrobial resistance was observed to amikacin (98.7%), kanamycin (98.7%), streptomycin (98.7%), and neomycin (98.0%) followed by oxytetracycline (85.4%), tetracycline (85.4%) and lincomycin (75.8%). All Streptococcus species isolates demonstrated low antimicrobial resistance to the amoxicillin (0.7%), cefuroxime (0.7%), cefazolin (1.9%), ceftiofur (1.9%), bacitracin (3.2%), and cloxacillin (4.5%). Resistance to 3 or more of 11 antimicrobial agents was observed in all species (98.7%, 155/157). Owing to therapy effect and antibiotic residues, it is essential to select appropriate antibiotics to treat bovine mastitis and to continuously survey of antimicrobial susceptibility of streptococci. ii

5 目 次 中 文 摘 要... i 英 文 摘 要... ii 目 次... iv 表 次... vi 圖 次... vii 第 一 章 前 言... 1 第 二 章 文 獻 探 討... 2 第 一 節 鏈 球 菌 (Streptococcus spp.) 簡 介... 2 一 鏈 球 菌 之 分 類 型 態 及 生 化 特 性... 2 二 鏈 球 菌 細 胞 壁 醣 類 抗 原 分 類... 2 三 鏈 球 菌 致 病 性... 3 第 二 節 抗 生 素 介 紹... 5 一 抗 生 素 的 作 用 機 制... 5 ( 一 ) 抑 制 細 胞 壁 的 合 成... 5 ( 二 ) 破 壞 細 胞 膜 通 透 性 或 完 整 性... 6 ( 三 ) 抑 制 核 酸 或 DAN 的 合 成... 6 ( 四 ) 抑 制 蛋 白 質 的 合 成... 6 二 抗 生 素 種 類 介 紹... 7 ( 一 ) 乙 內 醯 胺 類 (β-lactam) 抗 生 素... 7 ( 二 ) 胺 基 配 醣 體 類 (aminoglycosides) 抗 生 素... 9 ( 三 ) 四 環 素 類 (tetracyclines) 抗 生 素... 9 ( 四 ) 林 可 醯 胺 類 (lincosamides) 抗 生 素 ( 五 ) 多 肽 類 (polypeptides) 抗 生 素 iii

6 ( 六 ) 氯 黴 素 類 (chloramphenicols) 抗 生 素 三 抗 生 素 於 農 業 畜 牧 業 的 使 用 第 三 節 鏈 球 菌 盛 行 率 及 抗 藥 性 之 流 行 病 學 調 查 一 鏈 球 菌 盛 行 率 調 查 二 臺 灣 地 區 鏈 球 菌 抗 藥 性 調 查 三 其 他 國 家 之 鏈 球 菌 抗 藥 性 調 查 第 三 章 材 料 與 方 法 第 一 節 鏈 球 菌 菌 株 來 源 一 乳 汁 採 樣 及 培 養 二 微 生 物 培 養 第 二 節 菌 種 培 養 與 鑑 定 一 鏈 球 菌 之 分 離 與 判 定 二 CAMP (Christie-Atkins-Munch-Petersen) 試 驗 三 API 20 Strept 生 化 鑑 定 四 乳 膠 凝 集 試 驗 (Latex agglutination test) 五 菌 種 保 存 第 三 節 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 第 四 節 統 計 分 析 第 四 章 結 果 第 一 節 鏈 球 菌 分 離 結 果 一 乳 汁 培 養 結 果 二 菌 種 鑑 定 之 結 果 三 鏈 球 菌 之 乳 膠 凝 集 試 驗 結 果 四 鏈 球 菌 溶 血 型 型 態 五 CAMP 試 驗 結 果 第 二 節 鏈 球 菌 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 檢 測 結 果 iv

7 一 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 結 果 二 抗 藥 性 之 分 型 第 三 節 鏈 球 菌 於 各 類 抗 生 素 抗 藥 性 結 果 一 乙 內 醯 胺 類 (β-lactam) 抗 生 素 二 乙 內 醯 胺 類 (β-lactam) 抗 生 素 抗 藥 性 之 分 型 三 四 環 類 (tetracyclines) 及 胺 基 配 醣 體 (aminoglycosides) 抗 生 素 之 抗 藥 性 四 其 他 類 抗 生 素 五 牛 隻 乳 房 炎 軟 膏 抗 生 素 藥 物 之 比 較 第 四 節 地 理 位 置 之 菌 種 分 部 及 抗 藥 性 結 果 統 計 一 鏈 球 菌 菌 種 之 地 理 分 佈 二 鏈 球 菌 抗 藥 性 表 現 於 地 理 位 置 的 分 佈 三 鏈 球 菌 抗 藥 性 表 現 於 不 同 地 區 乳 牛 場 分 佈 第 五 章 討 論 一 鏈 球 菌 之 分 離 及 鑑 定 結 果 二 鏈 球 菌 抗 藥 性 結 果 探 討 三 鏈 球 菌 抗 藥 性 分 型 及 於 臺 灣 各 乳 牛 場 之 盛 行 率 探 討 第 六 章 總 結 參 考 文 獻 附 錄.. 67 Appendix 1. The classification of streptococcal group 67 Appendix 2. The chemical structure of penicillin G and ceftazidime.. 68 Appendix 3. The chemical structure of streptomycin Appendix 4. The chemical structure of lincomycin clindamycin and pirlimycin Appendix 5. The drugs used to treat bovine mastitis in Taiwan Appendix 6. Active ingredients and reactions enzyme table for API 20 Strept test v

8 Appendix 7. Reading table for API 20 Strept test.. 71 Appendix 8. Zone diameter interpretive standards of streptococci 72 vi

9 表 次 Table 1. Result of API 20 Strept and Oxoid Dryspot Streptococcal Grouping Kit to detect streptococcal species and group Table 2. Result of antimicrobial susceptibility test of streptococcal isolates from milk samples. 32 Table 3. Result of antimicrobial susceptibility of different species of streptococcal isolates identified by API 20 Strept in this study. 34 Table different antibiotic resistance patterns of streptococcal isolates.. 35 Table 5. Table 6. Table 7. Number of streptococci resistant to β-lactam antimicrobials patterns in this study.. 39 Distribution of dairy farms and numbers of streptococci isolated from milk samples. 44 Distribution of S. uberis of penicillin and ampicillin resistance in Taiwan (n=116). 48 vii

10 圖 次 Fig. 1 Identification and prevalence of 157 Streptococcus spp. isolated from bovine milk samples. 22 Fig. 2 Result of Oxoid Dryspot Streptococcal Grouping Kit to detect streptococcal group (A, B, C, D and E). 26 Fig. 3 The morphology (A, B and C) of streptococcal hemolysis types. 27 Fig. 4 Result of CAMP test (A, B and C) 28 Fig. 5 Antimicrobial susceptibility test of streptococcal isolates from milk samples by use dsk diffusion method Fig. 6 Proportion (%) of antimicrobial resistance in streptococci from bovine milk samples.. 33 Fig. 7 Proportion (%) of the penicillins resistance in streptococcal strains (n=157) Fig. 8 Proportion (%) of the cephalosporins resistance in streptococcal strains (n=157) Fig. 9 Proportion (%) of the tetracyclines and the aminoglycosides resistance in streptococcal strains (n=157) 41 Fig. 10 Proportion (%) of ampicillin, oxytetracycline, tetracycline and neomycin resistance in streptococcal strains (n=157) Fig. 11 Proportion (%) of ampicillin, cloxacillin, cefuroxime and bacitracin resistance in streptococcal strains (n=157) Fig. 12 Bovine milk samples collected from 30 dairy farms examined in this study Fig. 13 Proportion (%) of S. uberis of penicillin and ampicillin resistance in Taiwan (n=116). 48 Fig. 14 Resistant pattern of streptococci in this study (n=157). 48 viii

11 第 一 章 前 言, 乳 牛 乳 房 炎 (bovine mastitis) 一 直 為 全 世 界 各 國 乳 品 工 業 非 常 重 要 的 問 題, 因 其 乳 房 炎 會 造 成 乳 牛 的 產 乳 量 下 降, 乳 品 質 不 佳 進 而 影 響 生 乳 價 格, 同 時 加 添 獸 醫 診 療 費 及 抗 生 素 藥 物 的 使 用, 增 加 勞 動 人 力 成 本 或 使 牛 隻 過 早 的 被 撲 殺, 造 成 乳 業 經 濟 損 失 嚴 重 ( Bar et al., 2008;Runciman et al., 2010) 導 致 牛 隻 乳 房 炎 的 細 菌 可 依 流 行 病 學 歸 類 為 傳 染 性 病 原 菌 (contagious pathogens) 或 為 環 境 性 病 原 菌 (environmental pathogens)(sandholm et al., 1990; Bradley, 2002; Runciman et al., 2010), 其 菌 屬 種 類 包 含 葡 萄 球 菌 (Staphylococci), 鏈 球 菌 (Streptococci) 及 大 腸 桿 菌 群 (coliform) 為 常 被 從 乳 汁 分 離 出 來 的 病 原 菌 種 類 (Bal et al., 2010; Petrovski et al., 2011), 其 中 鏈 球 菌 已 被 大 多 的 文 獻 報 導 認 為 是 主 要 造 成 乳 房 炎 之 病 菌 之 一 (Guélat-Brechbuehl et al., 2010;Sanford et al., 2006), 然 而 近 年 來 都 以 環 境 性 的 鏈 球 菌 最 常 從 牛 隻 乳 房 炎 的 乳 汁 被 分 離 出 來 (Guérin-Faublée et al., 2002;Botrel et al., 2010) 鏈 球 菌 (Streptococcus spp.) 為 革 蘭 氏 陽 性 球 菌, 菌 落 小, 兼 性 厭 氧, 具 有 溶 血 或 不 溶 血 特 性, 可 依 細 菌 細 胞 壁 所 含 的 特 異 性 多 醣 類 的 不 同 來 分 型 分 族 (Facklam, 2002) 鏈 球 菌 普 遍 存 在 於 人 體 或 動 物 的 腸 道 泌 尿 道 及 生 殖 系 統 或 管 腔 中, 也 存 在 於 環 境 中 某 些 致 病 性 的 鏈 球 菌 除 了 會 感 染 牛 隻 並 造 成 乳 牛 臨 床 或 次 臨 床 乳 房 炎 (Guélat-Brechbuehl et al., 2010;Shum et al., 2009), 也 會 對 於 新 生 兒 孕 婦 老 人 及 免 疫 能 力 不 佳 的 人 造 成 感 染, 甚 至 導 致 死 亡 (Bisharat et al., 2004;Brochet et al., 2006), 抗 生 素 因 此 被 廣 泛 用 於 治 療 細 菌 所 造 成 的 感 染 (Pol et al., 2007) 由 於 抗 生 素 普 遍 的 使 用, 造 成 許 多 細 菌 具 有 抗 藥 性 的 產 生 細 菌 對 於 抗 生 素 之 抗 藥 性 在 人 類 醫 學 及 獸 醫 學 上 是 相 當 受 重 視 關 注 的 一 個 領 域, 而 監 測 細 菌 的 抗 藥 性 及 其 型 態 是 非 常 重 要, 可 藉 此 來 獲 得 細 菌 對 藥 物 的 敏 感 性 程 度 (Schwarz et al., 2001) 在 臺 灣 的 乳 牛 場 裡, 乳 房 炎 一 直 都 為 泌 奶 牛 重 要 且 嚴 重 之 疾 病 問 題, 由 鏈 球 菌 造 成 的 乳 房 炎 更 是 屢 見 不 顯 然 而 在 台 灣 關 於 鏈 球 菌 之 菌 種 調 查 及 其 對 抗 生 素 的 抗 藥 性 型 態 相 關 研 究 報 告 並 不 多 因 此, 本 研 究 的 目 的 為 調 查 造 成 牛 隻 臨 床 及 次 臨 床 乳 房 炎 的 乳 汁 樣 本 中, 分 離 及 鑑 定 鏈 球 菌 之 菌 種 並 以 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 來 檢 測 其 抗 藥 性 的 程 度 及 型 態 希 望 藉 由 此 研 究 以 來 暸 解 臺 灣 乳 牛 牧 場 裡 造 成 乳 房 炎 感 染 之 鏈 球 菌 菌 種, 以 助 乳 牛 擠 奶 衛 生 及 飼 養 管 理 參 考 ; 並 且 藉 抗 生 素 之 抗 藥 性 型 態 的 表 現 作 為 現 場 獸 醫 師 在 臨 床 乳 房 炎 防 治 上 及 治 療 用 藥 上 的 參 考 1

12 第 二 章 文 獻 探 討 第 一 節 鏈 球 菌 (Streptococcus spp.) 簡 介 一 鏈 球 菌 之 分 類 型 態 及 生 化 特 性 鏈 球 菌 (Streptococcus spp.) 廣 泛 的 存 在 於 人 類 和 動 物 的 腸 道 泌 尿 和 生 殖 系 統 及 自 然 環 境 中, 它 們 為 人 類 口 腔 皮 膚 腸 道 和 上 呼 吸 道 的 共 生 菌 群 (Rurangirwa et al., 2000) 鏈 球 菌 屬 於 兼 性 厭 氧 (facultative anaerobes) 的 革 蘭 氏 陽 性 菌 球 菌 (gram-positive cocci), 觸 酶 (catalase) 陰 性 (Schleifer, 1986; Devriese et al., 1999), 適 合 生 長 於 ph7.4, 溫 度 37 之 環 境 中, 無 法 生 長 於 溫 度 超 過 45 的 環 境 中 或 是 含 有 6.5% 的 鹽 水 中 鏈 球 菌 菌 體 不 具 鞭 毛, 在 顯 微 鏡 下 常 以 兩 兩 成 對 且 呈 現 出 短 鏈 或 長 鏈 狀 型 態 生 長 於 血 液 瓊 脂 培 養 基 上 其 菌 落 較 小 且 表 面 光 滑 具 反 光 性 根 據 其 菌 種 的 不 同, 可 在 血 液 瓊 脂 培 養 基 上 觀 察 到 菌 落 週 圍 有 不 完 全 溶 血 (α-hemolysis) 完 全 溶 血 (β-hemolysis) 或 不 溶 血 (γ -hemolysis) 的 特 性 (Facklam et al., 2002) 鏈 球 菌 的 生 化 特 性 為 能 發 酵 簡 單 的 醣 類, 依 據 不 同 菌 種 之 鏈 球 菌 對 於 核 醣 (ribose) 肝 醣 (glycogan) 乳 糖 (lactose) 海 藻 糖 (trehalose) 菊 糖 (inulin) 棉 籽 糖 (raffinose) 甘 露 醇 (mannitol) 山 梨 醇 (sorbitol) 之 反 應 也 不 同 如 乳 房 鏈 球 菌 (Streptococcus uberis) 菌 株, 其 菌 株 之 生 化 特 性 為 對 菊 糖 (inulin) 不 發 酵 或 β 葡 萄 糖 酸 酶 為 陰 性 之 菌 株 (Devriese et al., 1999) 鏈 球 菌 為 營 養 需 求 高 之 細 菌, 可 以 水 解 aesculin, 水 解 後 的 產 物 aesculetin 會 在 培 養 基 中 形 成 不 可 溶 的 黑 色 鹽 類 物 質, 故 在 菌 落 周 圍 會 呈 現 出 黑 色 或 深 褐 色 二 鏈 球 菌 細 胞 壁 醣 類 抗 原 分 類 Lancefield 於 1933 年 依 據 鏈 球 菌 細 胞 壁 所 含 的 特 異 性 多 醣 類 抗 原 與 β 溶 血 鏈 球 菌 之 相 關 聯, 提 出 鏈 球 菌 分 族 的 概 念 (Lancefield, 1933) Sherman(1937) 依 據 所 觀 察 到 的 鏈 球 菌 之 生 理 生 化 特 性 不 同 將 鏈 球 菌 分 為 四 類, 為 化 膿 型 的 (pyogenic), 草 綠 色 型 的 (viridians) 乳 酸 型 的 (lactic) 及 腸 球 菌 型 (enterococci), 並 將 菌 株 細 胞 壁 所 含 的 特 異 性 多 醣 類 抗 原 的 不 同 來 定 義 分 族 (A B C E F 及 G 族 )(Sherman, 1937) 隨 著 鏈 球 菌 菌 種 日 益 的 被 細 分 出,Sherman 提 出 的 這 2

13 種 劃 分 已 經 與 現 今 的 鑑 識 系 統 不 同 現 今 依 據 不 同 的 菌 種 的 鏈 球 菌 其 細 胞 壁 所 含 的 醣 類 抗 原 不 同 可 將 之 區 分 分 為 A 至 U 族 (Lancefield 氏 分 類 法 )( 附 錄 1) 三 鏈 球 菌 致 病 性 鏈 球 菌 在 人 類 上 可 以 引 起 許 多 的 感 染 症 狀, 而 對 人 類 具 有 致 病 力 的 鏈 球 菌 有 90% 以 上 屬 於 A 族 鏈 球 菌 (Bhakdi et al., 1985), 如 化 膿 性 鏈 球 菌 (Streptococcus pyogenes) 即 為 A 族 β 溶 血 型 鏈 球 菌, 其 A 族 鏈 球 菌 造 成 的 感 染 症 狀 包 括 : 咽 喉 炎 猩 紅 熱 丹 毒 中 耳 炎, 膿 疱 症 及 淋 巴 管 炎 對 於 嚴 重 燒 燙 傷 病 人 而 言,A 族 β 溶 血 型 鏈 球 菌 一 直 是 造 成 此 病 人 引 發 嚴 重 的 感 染 症, 如 : 蜂 窩 性 組 織 炎 和 敗 血 症 (Bang et al., 1999) 同 樣 為 β 溶 血 型 的 B 族 鏈 球 菌 如 : 無 乳 鏈 球 菌 (Streptococcus agalactiae), 會 同 時 對 人 類 及 動 物 造 成 感 染, 是 為 人 類 及 動 物 的 共 同 病 原 菌 於 人 類, 無 乳 鏈 球 菌 會 造 成 新 生 兒 敗 血 症 腦 膜 炎 嬰 幼 兒 全 身 性 感 染 或 是 導 致 細 菌 性 的 心 內 膜 炎, 而 此 菌 也 會 感 染 泌 乳 牛 造 成 乳 房 炎 疾 病 的 發 生 (De Francesco et al., 2012, Rato et al., 2013) 在 鏈 球 菌 細 胞 壁 之 特 異 性 抗 原 尚 未 分 族 的 肺 炎 鏈 球 菌 (Streptococcus pneumoniae) 為 悉 知 造 成 人 類 細 菌 型 肺 炎 腦 膜 炎 或 是 敗 血 症 的 病 原 菌 屬 於 C 族 E 族 及 G 族 的 有 些 鏈 球 菌 偶 爾 會 造 成 人 類 傷 口 的 感 染 菌 血 症, 心 內 膜 炎 及 腦 炎 等, 其 中 C 族 的 異 乳 鏈 球 菌 (Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae) 及 尚 未 分 族 乳 房 鏈 球 菌 (Streptococcus uberis) 為 常 造 成 牛 隻 乳 房 炎 的 病 原 菌 (Guérin-Faublée et al., 2002; Rato et al., 2013) 鏈 球 菌 的 致 病 可 以 分 為 四 個 過 程 :( 一 ) 黏 附 (adherence) 至 宿 主 細 胞,( 二 ) 侵 入 宿 主 細 胞,( 三 ) 抵 抗 宿 主 的 免 疫 反 應, 及 ( 四 ) 分 泌 產 物 造 成 宿 主 細 胞 被 破 壞 鏈 球 菌 細 胞 壁 主 要 是 由 胜 肽 聚 醣 (peptideglycan) 所 構 成, 為 具 有 特 異 性 多 醣 類 抗 原 莢 膜 是 由 異 質 多 糖 所 構 成, 具 抗 原 性, 可 以 增 加 細 菌 的 致 病 力 此 外, 莢 膜 具 有 逃 避 補 體 活 化 和 調 理 作 用 的 功 能, 可 避 免 被 白 血 球 吞 噬, 此 為 擺 脫 宿 主 的 免 疫 系 統 攻 擊 很 重 要 的 一 環 鏈 球 菌 的 細 胞 壁 上 含 有 許 多 M 蛋 白 及 脂 磷 壁 酸 (lipoteichoic acid, LTA),M 蛋 白 為 鏈 球 菌 重 要 的 致 毒 及 造 成 感 染 的 重 要 因 子 致 病 性 的 鏈 球 菌 能 分 泌 以 下 5 種 毒 力 因 子 產 物 來 造 成 宿 主 細 胞 的 破 壞 及 增 加 細 菌 在 宿 主 體 內 的 傳 染 散 播 :(1) 鏈 球 菌 溶 血 素 (streptolysin), 可 分 為 鏈 球 菌 溶 血 素 S 型 及 O 型 兩 種,S 型 溶 血 素 存 在 於 菌 體 內 且 對 氧 穩 定, 能 溶 解 紅 血 球 白 血 球 及 血 小 板 O 型 溶 血 素 對 氧 不 穩 定, 可 以 誘 導 病 人 產 生 鏈 球 菌 O 型 溶 血 素 的 抗 體 (Bhakdi et al., 1985) (2) 鏈 球 菌 激 酶 (streptokinase), 3

14 可 以 溶 解 纖 維 蛋 白 來 協 助 細 菌 的 散 播 (3) 玻 尿 酸 酶 (hyaluronidase) 可 以 分 解 結 締 組 織, 加 速 細 菌 的 滲 透 及 散 播 (4) 蛋 白 酶 (proteinase), 為 鏈 球 菌 分 解 宿 主 的 蛋 白 質 之 重 要 的 酵 素 (5) 核 酸 酶 (nuclease), 具 有 A B C 及 D 共 四 型 核 酸 酶 A 及 C 具 有 DNase 活 性, 核 酸 酶 B 及 D 具 有 RNase 的 活 性 ; 其 作 用 為 分 解 宿 主 發 炎 膿 腫 內 白 血 球 細 胞 的 DNA, 降 低 傷 口 膿 瘍 的 黏 度 來 助 長 細 菌 之 向 外 散 播 (Baltimore, 1982; Schlievert et al., 1996; Cunningham, 2000; 蔡, 2002) 4

15 第 二 節 抗 生 素 介 紹 抗 微 生 物 製 劑 (antimicrobial agent) 包 含 許 多 種 類, 如 : 抗 生 素 (antibiotics) 抗 黴 菌 劑 (antifungals) 或 是 化 學 治 療 藥 劑 (chemotherapeutic abents) 然 而 抗 生 物 質 為 細 菌 黴 菌 或 放 射 線 菌 代 謝 產 生 的 物 質, 此 物 質 能 殺 死 或 抑 制 其 它 的 微 生 物 的 生 長 或 繁 殖 (Waksman, 1942), 固 抗 生 素 被 廣 泛 的 運 用 於 來 治 療 細 菌 所 造 成 的 感 染 抗 生 素 的 起 源 於 1928 年,Alexander Fleming 觀 察 發 現 被 青 黴 菌 所 污 染 的 金 黃 色 葡 萄 球 培 養 皿 中, 生 長 於 青 黴 菌 周 圍 的 金 黃 色 葡 萄 球 菌 皆 被 抑 制, 隨 後 將 此 物 質 純 化 分 離 出 來, 並 命 名 為 青 黴 素 (pencillin), 青 黴 素 為 人 類 醫 學 上 第 一 個 被 發 現 且 廣 泛 使 用 的 抗 生 素, 因 為 它 的 發 現 對 於 疾 病 的 治 療 有 了 重 大 的 突 破, 解 決 了 很 多 由 細 菌 感 染 所 造 成 的 疾 病 於 現 今 臨 床 使 用 的 抗 生 素 種 類 約 莫 有 一 百 五 十 種 類 (Pommerville, 2004) 一 抗 生 素 的 作 用 機 制 不 同 種 類 的 抗 生 素 其 作 用 機 制 也 不 相 同, 按 照 性 質 的 不 同, 可 將 抗 生 素 分 為 殺 菌 性 (bactericidal) 或 是 抑 菌 性 (bacteriostatic) 的 抗 生 素 (Waksman,1942), 其 對 於 細 菌 的 作 用 機 制 可 分 為 四 類 : ( 一 ) 抑 制 細 胞 壁 的 合 成 細 菌 的 細 胞 壁 是 維 持 細 菌 體 很 重 要 的 支 撐 結 構, 因 細 菌 細 胞 質 濃 度 常 大 於 其 生 存 環 境 中 的 濃 度, 由 滲 透 壓 原 理, 水 分 會 由 低 濃 度 地 方 往 濃 度 高 的 地 方 移 動, 因 此 會 造 成 細 胞 外 水 分 不 斷 擴 散 進 入 細 胞 內, 而 細 胞 壁 的 存 在 可 防 止 細 胞 因 不 斷 膨 脹 而 使 得 細 胞 膜 破 裂 導 致 細 菌 死 亡 構 成 細 菌 細 胞 壁 的 主 要 成 份 為 肽 聚 糖 (peptidoglycan), 由 N-acetylglucosamine 及 N-acetylmuramic 相 互 交 織 形 成 的 網 狀 結 構 青 黴 素 結 合 蛋 白 (penicillin-binding proteins,pbs) 為 催 化 細 菌 細 胞 壁 合 成 起 始 步 驟 之 酵 素, 而 青 黴 素 (penicillins) 結 構 上 的 β-lactam 環 會 和 肽 聚 糖 鏈 (peptidoglycan chain) 產 生 交 聯 (cross-link) 後, 再 與 青 黴 素 結 合 蛋 白 結 合 後, 使 得 細 菌 的 細 胞 壁 因 殘 缺 不 完 整 之 肽 聚 糖 組 成 的 細 胞 壁 而 變 得 薄 弱 結 構 不 完 整 而 造 成 菌 體 滲 透 壓 不 穩 定 導 致 細 菌 破 裂 分 解 而 死 亡 (Sauvage, 2008) 5

16 ( 二 ) 破 壞 細 胞 膜 通 透 性 或 完 整 性 細 菌 的 細 胞 膜 為 調 控 物 質 進 出 重 要 的 通 道, 一 旦 細 胞 膜 受 到 損 壞, 細 胞 內 的 蛋 白 質 離 子 及 遺 傳 物 質 便 會 向 外 流 失 而 造 成 細 菌 死 亡, 其 抗 生 素 如 polymyxins amphotericin 及 nystatin 的 作 用 機 制 皆 屬 於 此, 進 而 導 致 細 菌 細 胞 內 的 重 要 物 質 流 失 如 polymyxins 為 主 要 抗 革 蘭 氏 陰 性 菌 之 藥 劑, 其 作 用 為 會 和 陰 性 菌 細 胞 膜 上 的 磷 脂 質 結 合 後, 並 且 嵌 入 細 胞 膜 形 成 通 道, 增 加 細 胞 膜 的 通 透 性 來 造 成 細 菌 死 亡 (Hancock et al., 1999; Clausell et al., 2003) ( 三 ) 抑 制 核 酸 或 DNA 的 合 成 抑 制 DNA 合 成 的 藥 物 有 fluoroquinolones 及 nitroimidazole 等 藥 物, 抑 制 DNA-dependent RNA polymerase 或 抑 制 mrna 的 藥 物 為 rifampin, 抑 制 核 酸 合 成 藥 物 有 actiomycin 及 idoxuridine, 這 些 藥 物 會 干 擾 微 生 物 之 DNA 複 製 或 轉 錄 (transcription) fluoroquinolones 藥 物 為 直 接 抑 制 DNA 的 合 成, 依 據 細 菌 的 不 同, 其 藥 物 的 機 制 可 分 為 作 用 在 DNA gyrase 或 是 作 用 在 拓 樸 異 構 酶 (topoisomerase IV) 上 (Hooper, 2001) 抑 制 葉 酸 (folate) 的 藥 物 有 sulfonamides 及 trimethoprim, 以 sulfonamides 為 例, 其 作 用 機 制 為 利 用 競 爭 型 抑 制 (competitive inhibition) 來 達 到 抑 制 的 效 果 因 葉 酸 在 核 酸 及 許 多 胺 基 酸 的 生 合 成 上 扮 演 很 重 要 的 角 色, 而 para-aminobenzoic acid (PABA) 是 合 成 葉 酸 所 需 之 受 質,sulfanilamide 的 結 構 類 似 PABA, 當 sulfanilamide 存 在 時, 會 使 得 原 本 與 PABA 結 合 的 酵 素 轉 而 與 sulfanilamide 結 合, 故 細 菌 無 法 合 成 葉 酸 而 進 一 步 的 造 成 微 生 物 停 止 生 長 (Sköld, 2000) ( 四 ) 抑 制 蛋 白 質 的 合 成 原 核 生 物 及 真 核 生 物 其 細 胞 的 蛋 白 質 合 成 具 備 非 常 重 要 的 功 能, 因 此 許 多 抗 微 生 物 劑 的 作 用 機 制 以 結 合 至 目 標 物 的 核 醣 體 阻 斷 其 蛋 白 質 的 製 造 來 達 到 抑 制 微 生 物 複 製 繁 衍 根 據 其 抗 微 生 物 劑 結 合 細 菌 核 醣 體 次 單 位 的 不 同 可 以 分 為 兩 類, 作 用 於 30S 核 醣 體 次 單 位 有 胺 基 配 醣 體 類 藥 物 及 四 環 素 類 藥 物, 作 用 於 50S 核 醣 體 次 單 位 有 巨 環 類 及 氯 黴 素 (Hirsh and Zee, 1999) 6

17 二 抗 生 素 種 類 介 紹 ( 一 ) 乙 內 醯 胺 類 (β-lactam) 抗 生 素 乙 內 醯 胺 類 (β-lactam) 抗 生 素 為 殺 菌 性 的 抗 生 素, 其 藥 物 作 用 原 理 為 抑 制 細 菌 細 胞 壁 的 合 成 和 破 壞 細 菌 細 胞 壁 的 結 構 來 達 到 殺 菌 的 作 用 其 殺 菌 之 機 制 為 結 構 上 的 乙 內 醯 胺 酶 環 (β-lactam ring) 會 和 細 菌 合 成 細 胞 壁 起 始 的 酵 素 青 黴 素 結 合 蛋 白 (penicillin-binding proteins) 做 結 合, 而 隨 著 細 菌 的 不 同 其 青 黴 素 結 合 蛋 白 之 催 化 功 能 也 不 同 青 黴 素 類 (penicillins) 抗 生 素 及 頭 孢 子 素 類 (cephalosporins) 抗 生 素 皆 屬 於 乙 內 醯 胺 類 (β-lactam) 抗 生 素 (Fisher et al., 2005), 其 兩 類 抗 生 素 在 結 構 上 均 有 β-lactam 環, 此 外, 青 黴 素 類 的 抗 生 素 結 構 上 具 有 的 五 角 型 硫 環 (Thiazolidine ring), 頭 孢 子 素 類 抗 生 素 有 六 原 環 (Dihydrothiazine ring) 結 構 (Mims et al., 2006), 其 化 學 結 構 詳 見 附 錄 2 青 黴 素 類 的 抗 生 素 可 依 結 構 及 抗 菌 範 圍 分 為 四 大 類 :(1)natural penicillin: 藉 由 青 黴 菌 培 養 後 萃 取 純 化 其 代 謝 產 物 而 得, 如 pencillin G 及 pencillin V (2) aminopencillins: 半 合 成 的 青 黴 素 衍 生 物, 在 烷 基 的 α 位 置 上 有 一 個 游 離 的 胺 基 團 (amino group), 如 amoxicillin ampicillin 及 hetacillin (3) penicillinase-resistant penicillin: 在 胺 基 側 鏈 的 CO 基 上 接 上 一 個 環 狀 的 結 構, 此 環 狀 結 構 上 的 取 代 基 可 以 保 護 β-lactam ring, 避 免 被 細 菌 的 乙 內 醯 胺 酶 (β-lactamase) 水 解, 如 :cloxacillin dicloxacillin methicillin nafcillin 及 oxacillin (4) extended-spectrum penicillins: 在 烷 基 的 α 位 上 具 有 一 個 酸 基 團 (carboxylic acid group) 或 鹼 基 團 (basic group), 此 結 構 使 此 類 別 的 青 黴 素 衍 生 物 比 起 前 三 項 更 具 廣 效 性 (Adams, 2001; Fisher et al., 2005) 頭 孢 子 素 類 (cephalosporins) 抗 生 素 為 一 群 半 合 成 的 廣 效 型 抗 生 素, 其 對 大 部 分 的 革 蘭 氏 陽 性 菌 及 某 些 革 蘭 氏 陰 性 菌 有 殺 菌 或 是 抑 菌 的 效 果 頭 孢 子 素 類 抗 生 素 依 其 抗 菌 性 質 及 發 展 的 時 間 順 序 來 將 之 分 為 第 一 代 第 二 代 第 三 代 及 第 四 代 第 一 代 頭 孢 子 素 類 (first-generation cephalosporins) 其 藥 理 作 用 為 抑 制 細 菌 細 胞 壁 中 mucopeptide 的 合 成, 導 致 細 菌 細 胞 壁 薄 弱 因 滲 透 壓 不 穩 而 造 成 細 菌 的 死 亡 第 一 代 的 頭 孢 子 素 抗 菌 的 活 性 強, 但 是 抗 菌 範 圍 較 窄 7

18 , 對 於 革 蘭 氏 陽 性 菌 如 葡 萄 球 菌 屬 (Staphylococcus spp.) 具 有 較 強 的 藥 物 作 用 活 性 (Sabath, 1989) 屬 於 第 一 代 頭 孢 子 素 類 抗 生 素 有 cefadroxil cephalexin cefazoline cephalothin cephapirin 及 cephradine 第 二 代 頭 孢 子 素 類 (second-generation cephalosporins) 抗 生 素 於 1960 至 1970 年 代 發 展 出 來, 其 性 質 較 第 一 代 頭 孢 子 素 的 抗 菌 範 圍 更 廣, 且 對 於 抗 革 蘭 氏 陰 性 的 腸 道 菌 有 較 強 的 活 性, 因 其 對 抗 於 細 菌 所 產 生 的 乙 內 醯 安 酶 具 有 更 穩 定 的 結 構 (Joan C, 1997) 藥 物 有 cefoxitin cefprozil ceforanide 及 cefuroxime 第 三 代 頭 孢 子 素 (third-generation cephalosporins) 為 廣 效 型 的 抗 生 素, 對 於 對 第 一 代 及 第 二 代 頭 孢 子 素 具 有 抗 藥 性 之 細 菌 更 有 效 藥 物 有 ceftiofur ceftriaxone cefoperazone cefpodoxime cefotaxime 及 ceftizoxime, 其 中 以 cefotaxime 及 ceftizoxime 對 於 革 蘭 氏 陽 性 菌 之 作 用 效 力 較 強 cefotaxime ceftazidime ceftriaxone 及 cefoperazone 對 於 革 蘭 氏 陰 性 菌 具 有 較 良 好 的 藥 物 活 性, 但 對 於 綠 膿 桿 菌 (Pseudomonas aeruginosa) 其 對 抗 能 力 弱 (Joan C, 1997) 第 四 代 頭 孢 子 素 (fourth-generation cephalosporins) 為 廣 效 型 抗 生 素, 其 抗 菌 譜 對 於 革 蘭 氏 陽 性 菌 革 蘭 氏 陰 性 菌 和 綠 膿 桿 菌 (Pseudomonas aeruginosa) 均 具 有 良 好 的 藥 物 效 力, 第 四 代 頭 孢 子 素 包 含 cefepime cefepime cefoselis cefclidine cefozopran 和 cefquinome 根 據 文 獻 指 出 於 某 些 國 家 運 用 cefepime 和 cefpirome 來 治 療 幾 種 中 度 至 重 度 的 細 菌 感 染 症 (Joan C, 1997) cefpirome 對 於 臨 床 上 產 生 乙 內 醯 胺 酶 的 菌 株 具 有 良 好 的 抵 抗 性, 且 為 悉 知 用 於 治 療 牛 或 豬 疾 病 的 抗 生 素 (Shpigel et al., 1997; Thomas et al., 2006) 細 菌 對 於 β-lactam 類 抗 生 素 產 生 抗 藥 性 有 三 個 主 要 因 素, 為 (1) 細 菌 自 身 產 生 乙 內 醯 胺 酶 (β-lactamase) 造 成 乙 內 醯 胺 (β-lactam) 類 藥 物 被 水 解 而 失 去 活 性,(2) 細 菌 細 胞 壁 的 通 透 性, 和 (3) 青 黴 素 結 合 蛋 白 (penicillin-binding proteins,pbs) 的 敏 感 度 細 菌 自 身 產 生 乙 內 醯 胺 酶 (β-lactamase) 來 水 解 乙 內 醯 胺 (β-lactam) 環 為 細 菌 主 要 的 抗 藥 性 表 現 的 機 制, 而 不 同 的 β-lactamase 可 能 對 於 青 黴 素 類 抗 生 素 有 專 一 性 (penicillinases) 或 是 對 頭 孢 子 素 類 抗 生 素 具 有 專 一 性 (cephalosporinases)(adams, 2001; Fisher et al., 2005; Li et al., 2007) 8

19 ( 二 ) 胺 基 配 醣 體 類 (aminoglycosides) 抗 生 素 胺 基 配 醣 體 類 (aminoglycosides) 藥 物 為 廣 效 型 的 殺 菌 性 抗 生 素, 其 作 用 機 制 為 與 細 菌 的 30S 核 醣 體 次 單 位 結 合 而 抑 制 蛋 白 質 的 合 成, 主 要 作 為 治 療 由 革 蘭 氏 陰 性 菌, 需 氧 菌 所 造 成 的 感 染 (Magnet et al., 2005) 此 藥 物 與 乙 內 醯 胺 (β-lactam) 類 藥 物 合 併 使 用 具 有 協 同 性 而 胺 基 配 醣 體 類 (aminoglycosides) 藥 物 於 許 多 醫 療 院 為 最 常 使 用 的 抗 生 素, 其 副 作 用 具 有 腎 毒 性 及 耳 毒 性 ( 嗅 覺 及 前 庭 ), 且 其 毒 性 相 較 於 其 它 類 的 抗 生 素 大, 細 菌 對 此 藥 物 易 有 抗 藥 性 (Kotra et al., 2000) 胺 基 配 醣 體 類 (aminoglycosides) 藥 物 結 構 主 要 由 兩 個 胺 基 醣 以 醣 鍵 與 六 碳 醣 核 心 鍵 結, 為 親 水 性 的 抗 生 素, 故 對 於 革 蘭 氏 陽 性 菌 所 造 成 的 感 染 治 療 效 果 不 佳 (Adams, 2001) 屬 於 胺 基 配 醣 體 類 (aminoglycosides) 藥 物 有 streptomycin kanamycin gentamicin tobramycin 及 neomycin, 其 結 構 詳 見 附 錄 3 ( 三 ) 四 環 素 類 (tetracyclines) 抗 生 素 四 環 素 類 (tetracyclines) 被 發 現 於 20 世 紀 40 年 代, 為 廣 效 型 的 制 菌 性 抗 生 素, 其 作 用 機 制 為 結 合 在 細 菌 的 30S 核 醣 體 次 單 位 來 達 到 抑 制 蛋 白 質 的 合 成 其 主 要 作 為 革 蘭 氏 陽 性 菌 及 革 蘭 氏 陰 性 菌 造 成 感 染 之 代 替 治 療 藥 劑 此 外, 四 環 素 類 抗 生 素 被 認 為 是 霍 亂 衣 原 體 立 克 次 氏 體 感 染 復 發 熱 及 對 於 青 黴 素 藥 物 過 敏 之 淋 病 病 患 之 較 佳 選 擇 的 藥 物 四 環 素 類 抗 生 物 藥 物 抗 菌 活 性 相 似, 但 其 藥 物 動 力 學 具 有 差 異 四 環 素 (tetracycline) 及 土 黴 素 (oxytetracycline) 為 短 作 用 型 的 藥 物, 半 衰 期 6-10 小 時 其 餘 的 四 環 素 類 衍 生 物 其 半 衰 期 為 小 時, 為 長 效 型 藥 物 四 環 素 類 (tetracyclines) 抗 生 素 為 價 錢 較 低 的 抗 生 素, 故 其 被 廣 泛 的 用 於 人 類 和 動 物 感 染 的 預 防 和 治 療 ; 另 外 也 常 將 四 環 素 添 加 在 動 物 飼 料 中 作 為 生 長 促 進 劑 因 此 大 量 的 使 用 四 環 素 類 藥 物 造 成 許 多 細 菌 對 於 此 種 藥 物 產 生 了 抗 藥 性, 而 細 菌 大 部 分 對 抗 四 環 素 類 藥 物 會 經 由 三 種 機 制 來 呈 現, 為 (1) 將 藥 物 排 出 (efflux mechanism) 於 細 菌 體 外 來 達 到 降 低 藥 物 的 吸 收 量,(2) 細 菌 藉 由 核 醣 體 的 保 護 蛋 白 (ribosomal protection proteins, RPPs) 來 使 四 環 素 類 藥 物 無 法 結 合 於 細 菌 的 30S 核 醣 體 次 單 位 上 而 被 釋 放 出, 和 (3) 細 菌 的 酵 素 性 修 飾 四 環 素 作 用 (Aminov 2001; Chopra et al., 2001; Roberts, 2005) 9

20 ( 四 ) 林 可 醯 胺 類 (lincosamides) 抗 生 素 林 可 醯 胺 類 (Lincosamides) 藥 物 於 1960 年 代 被 發 現, 結 構 為 一 群 具 有 胺 基 酸 側 鏈 之 單 醣 類 的 抗 生 素, 為 廣 效 性 的 抗 生 素, 包 括 lincomycin clindamycin 及 pirlimycin, 其 中 lincomycin 與 clindamycin 此 兩 種 抗 生 素 的 結 構 相 似 ( 附 錄 4), 作 用 機 制 為 與 細 菌 的 50S 核 醣 體 次 單 位 結 合 至 23S rrna 進 而 抑 制 蛋 白 質 的 合 成, 抗 菌 範 圍 與 作 用 機 制 類 似 於 巨 環 類 (macrolides) 的 抗 生 素 (Petinaki et ajl., 2008) 林 可 醯 胺 類 (lincosamides) 藥 物 用 於 治 療 如 : 葡 萄 球 菌 屬 (Staphylococcus spp.) 鏈 球 菌 屬 (Streptococcus spp.) 棒 狀 桿 菌 屬 (Corynebacterium spp.) 及 methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) 等 於 獸 醫 的 用 藥 中,lincomycin 及 pirlimycin 常 用 於 治 療 泌 乳 牛 乳 房 炎 的 疾 病 (Petinaki et ajl., 2008) 由 於 廣 泛 的 使 用, 許 多 細 菌 對 於 林 可 醯 胺 類 (lincosamides) 藥 物 已 出 現 抗 藥 性, 其 抗 藥 性 機 制 普 遍 可 分 為 兩 的 途 徑, 為 (1) 抗 生 素 的 修 飾 作 用 (antibiotic modification), 此 機 制 常 被 發 現 表 現 於 革 蘭 氏 陽 性 球 菌 上 (Dutta and Devriese, 1982), 或 是 (2) 藉 由 Erm 甲 基 轉 移 酶 (Erm methyltransferases) 甲 基 化 (methylation) 核 醣 體 的 23S rrna, 而 此 機 制 在 巨 環 類 (macrolides) 及 B 型 鏈 陽 菌 素 (B streptogramin) 抗 生 素 常 被 觀 察 到 (Courvalin et al., 1985; Morar et al., 2009) ( 五 ) 多 肽 類 (polypeptides) 抗 生 素 多 肽 類 (polypeptides) 藥 物 屬 於 殺 菌 性 的 抗 生 素, 包 含 gramicidins polymyxins bacitracins 和 glycopeptides(hancock and Chapple, 1999) polymyxins 主 要 用 來 治 療 由 革 蘭 氏 陰 菌 所 造 成 的 感 染 症 狀, 如 綠 膿 桿 菌 (Pseudomonas aeruginosa) 鮑 氏 不 動 桿 菌 (Acinetobacter baumanni) 及 carbapenemase-producing Enterobacteriaceae, 作 用 機 制 因 其 為 是 藥 物 具 有 陽 離 子 帶 有 陽 性 電 荷, 而 細 菌 的 外 膜 帶 負 電 荷, 因 此 polymyxins 可 以 與 細 菌 的 外 膜 結 合 而 干 擾 細 菌 外 膜 的 完 整 性 而 此 藥 物 的 副 作 用 為 神 經 毒 性 和 腎 毒 性, 此 藥 物 的 副 作 用 較 危 險, 因 而 大 大 的 限 制 了 全 身 性 使 用 (Landman et al., 2008) bacitracin 為 含 有 金 屬 的 抗 菌 劑, 被 廣 泛 用 作 醫 藥 和 飼 料 添 加 劑 其 機 制 為 結 合 細 菌 細 胞 壁 脂 質 載 體 幾 種 重 要 的 中 間 產 物 undecaprenyl-pyrophosphate 來 達 到 干 擾 細 菌 細 胞 壁 的 生 合 成 多 肽 類 的 化 合 藥 物, 對 於 由 革 蘭 氏 陽 性 菌 及 某 些 革 蘭 氏 陰 性 菌 所 造 成 的 感 染 具 有 良 10

21 好 的 治 療 效 果 (Economou et al., 2013) ( 六 ) 氯 黴 素 類 (chloramphenicols) 抗 生 素 氯 黴 素 (chloramphenicol) 於 1940 年 代 被 發 現, 為 廣 效 型 的 抑 菌 性 抗 生 素 氯 黴 素 的 作 用 機 制 為 藉 由 作 用 在 50S 次 單 位 上 核 醣 體 RNA 阻 斷 蛋 白 質 合 成 所 需 酵 素 胜 肽 轉 移 酶 (peptidyl transferase) 之 功 能 而 來 達 到 抑 制 蛋 白 質 合 成 的 功 能 (Jardetzky, 1962) 氯 黴 素 使 用 時 最 嚴 重 的 副 作 用 為 具 有 骨 髓 毒 性, 會 造 成 骨 髓 抑 制 或 再 生 不 良 性 貧 血 (Smilack, 1991), 目 前 美 國 法 國 (Guérin-Faublée et al., 2002) 與 我 國 已 經 禁 止 將 氯 黴 素 使 用 於 經 濟 動 物 中 氯 黴 素 對 於 各 種 革 蘭 氏 陽 性 菌 陰 性 菌 及 包 括 大 部 分 厭 氧 性 的 微 生 物 皆 具 有 藥 物 效 力, 因 其 製 造 容 易 且 價 格 相 對 低 廉 而 使 氯 黴 素 被 廣 泛 的 使 用, 但 也 因 為 被 廣 泛 的 使 用 造 成 細 菌 產 生 抗 藥 性 的 問 題, 目 前 已 知 細 菌 會 透 過 下 列 的 機 制 來 對 氯 黴 素 產 生 抗 性 (1) 藉 由 乙 醯 轉 移 酶 (acetyltransferases) 或 氯 黴 素 磷 酸 轉 移 酶 (chloramphenicol phosphotrans ferases) 來 使 酵 素 失 去 活 性,(2) 經 由 突 變 或 修 飾 來 改 變 標 靶 位 置 (target site), (3) 降 低 細 菌 外 膜 的 通 透 性, 及 (4) 利 用 藥 物 輸 出 幫 浦 (efflux pumps) 的 multidrug extrusion transporters 將 藥 物 排 出 而 來 降 低 細 菌 體 內 藥 物 的 濃 度 (Fernández et al., 2012) 三 抗 生 素 於 農 業 畜 牧 業 的 使 用 抗 生 素 於 1950 年 代 普 遍 使 用 在 農 業 的 家 禽 家 畜 及 畜 牧 業 上, 因 為 適 當 的 使 用 抗 生 素 可 以 改 善 動 物 健 康 及 增 加 動 物 的 生 產 力, 並 且 可 以 減 少 造 成 食 物 中 毒 的 病 原 菌 此 外, 抗 生 素 使 用 於 食 用 動 物 或 經 濟 動 物 上 的 目 的 除 了 治 療 由 細 菌 感 染 所 造 成 的 疾 病 外, 短 期 的 預 防 性 投 予 用 藥 來 防 止 遭 受 細 菌 的 感 染 或 是 添 加 於 飼 料 中 來 促 進 動 物 的 生 長 及 增 加 動 物 的 飼 料 換 肉 率 然 而 將 抗 生 素 添 加 在 飼 料 裡 來 增 加 經 濟 動 物 的 生 長 受 到 很 多 的 爭 議, 因 為 已 有 文 獻 指 出 如 此 會 導 致 細 菌 產 生 抗 藥 性 的 情 況 發 生 為 了 維 持 抗 生 素 藥 物 的 治 療 效 力 及 避 免 細 菌 出 現 抗 藥 性, 謹 慎 的 選 擇 抗 生 素 藥 劑 是 非 常 重 要 的 (Mathew et al., 2007;Redding et al., 2014 ) 在 現 代 的 飼 養 乳 牛 的 牧 場 裡, 抗 生 素 藥 物 常 被 用 於 治 療 細 菌 感 染 造 成 疾 病 和 預 防 性 的 投 與 用 藥, 然 而 大 多 數 的 抗 生 素 被 使 用 在 治 療 細 菌 感 染 上 在 乳 牛 場, 抗 生 素 被 廣 泛 使 用 在 治 療 乳 牛 乳 房 炎 疾 病 及 牛 隻 的 傳 染 性 疾 病 上 11

22 於 美 國, 合 法 被 允 許 用 來 治 療 乳 牛 乳 房 炎 抗 生 素 藥 物 有 penicillin cephapirin ceftiofur amoxicillin hetacillin cloxacillin erythromycin novobiocin 和 pirlimycin 而 β-lactams sulfonamides tetracyclines lincomycin 為 對 於 治 療 牛 隻 的 呼 吸 道 疾 病 子 宮 感 染 和 傳 染 性 足 病 (infectious foot disease) 為 常 使 用 的 抗 菌 藥 劑 於 乳 牛 場 裡, 將 抗 生 素 用 於 治 療 乳 牛 乳 房 炎 疾 病 的 頻 度 相 較 於 抗 生 素 用 於 治 療 其 他 疾 病 是 為 最 高 的 (Pol and Ruegg, 2007) 在 德 國 (Tenhagen et al., 2006) 阿 根 廷 (Denamiel et al., 2005) 及 愛 沙 尼 亞 (Kalmus et al., 2011), 以 乙 內 醯 胺 酶 類 抗 生 素 及 巨 環 類 抗 生 素 為 常 用 於 治 療 乳 牛 乳 房 炎 疾 病 的 藥 物 種 類 於 附 錄 5 列 出 臺 灣 目 前 核 可 且 乳 牛 場 使 用 於 治 療 乳 牛 乳 房 炎 之 乳 房 炎 軟 膏 及 其 成 份 12

23 第 三 節 鏈 球 菌 盛 行 率 及 抗 藥 性 之 流 行 病 學 調 查 一 鏈 球 菌 盛 行 率 調 查 許 多 微 生 物 皆 可 能 是 引 起 乳 牛 乳 房 炎 症 狀 之 因 素, 包 括 革 蘭 氏 陰 性 菌 革 蘭 氏 陽 性 菌, 類 質 菌 體 和 藻 類, 其 中 由 細 菌 所 引 起 乳 房 炎 的 情 況 為 最 常 見 (Zadoks et al., 2011) 導 致 牛 隻 乳 房 炎 的 細 菌 可 依 流 行 病 學 歸 類 為 傳 染 性 病 原 菌 或 為 環 境 性 病 原 菌 (Sandholm et al., 1990), 傳 染 性 病 原 菌 傳 染 方 式 為 藉 由 消 毒 未 完 全 的 榨 乳 杯 受 汙 染 的 抹 布 或 是 經 由 擠 乳 人 員 的 手 來 將 病 原 體 從 原 本 已 患 病 的 乳 牛 傳 遞 給 其 它 健 康 牛 隻, 其 中 以 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus), 無 乳 鏈 球 菌 (Streptococcus agalactiae), 棒 狀 桿 菌 (Corynebacterium spp.) 和 黴 漿 菌 (Mycoplasma spp.) 最 為 重 要 環 境 性 的 病 原 體 主 要 源 自 於 環 境 中, 如 ; 牛 床, 在 乳 牛 榨 乳 時 伺 機 感 染, 其 致 病 菌 如 大 腸 桿 菌 (Escherichia coli) 克 雷 伯 氏 菌 屬 (Klebsiella spp) 乳 房 鏈 球 菌 (Streptococcus uberis) 及 腸 球 菌 屬 ( Enterococcus spp.)(rossitto et al., 2002), 其 中 鏈 球 菌 已 被 報 導 是 成 為 主 要 造 成 乳 房 炎 之 病 菌 之 一 (Sanford et al., 2006;Guélat-Brechbuehl et al., 2010), 而 近 年 來 的 研 究 發 現 以 環 境 性 的 鏈 球 菌 ; 如 乳 房 鏈 球 菌 (Streptococcus uberis) 為 最 常 從 牛 隻 乳 房 炎 的 乳 汁 被 分 離 出 來 (Todhunter et al., 1995; Rossitto et al., 2002; Guérin-Faublée et al., 2002; Botrel et al., 2010) 在 紐 西 蘭,Petrovski 等 人 (2011) 發 現 從 乳 汁 微 生 物 培 養 出 來 的 結 果 以 乳 房 鏈 球 菌 佔 23.6% 的 比 例 為 最 高, 其 次 為 金 黃 色 葡 萄 球 菌 佔 23.5%, 凝 固 酶 陰 性 葡 萄 球 菌 佔 7.2% Shum 等 人 (2009) 於 澳 洲 的 New South Wales 調 查 乳 房 炎 乳 牛 生 乳 培 養 結 果 發 現, 環 境 性 的 病 原 菌 佔 91%, 大 腸 桿 菌 佔 33.6%, 環 境 性 的 鏈 球 菌 佔 41.6% 及 葡 萄 球 菌 屬 佔 15.7 % 二 臺 灣 地 區 鏈 球 菌 抗 藥 性 調 查 於 臺 灣, 有 關 於 牧 場 鏈 球 菌 調 查 資 料 不 多, 而 大 多 數 是 以 人 醫 醫 院 裡 分 離 出 的 鏈 球 菌 做 為 研 究 目 前 發 現 臺 灣 來 自 動 物 分 離 出 之 鏈 球 菌 其 抗 藥 性 的 調 查 研 究 有 兩 篇 其 一 為 Ma 等 人 (2006) 於 臺 灣 北 部 及 東 部 兩 個 地 理 共 16 個 乳 牛 牧 場, 從 生 乳 及 牧 場 的 環 境 進 行 細 菌 菌 種 的 調 查 其 細 菌 培 養 後 鑑 定 結 果 共 有 1346 株 細 菌 被 分 離, 其 中 包 括 226 株 的 大 腸 桿 菌,30 株 的 假 單 孢 菌 及 259 株 革 蘭 氏 陰 性 菌,271 株 腸 球 菌,314 株 的 葡 萄 球 菌 及 195 株 的 鏈 球 菌 及 51 株 革 13

24 蘭 氏 陽 性 菌, 並 對 分 離 出 的 細 菌 做 藥 物 敏 感 性 測 試, 其 陽 性 菌 測 試 的 藥 物 為 有 amoxicillin/clavulanic acid cephalothin chloramphenicol doxycycline enrofloxacin erythromycin oxacillin oxytetracycline penicillin G sulfadimethoxine 及 vancomycin 實 驗 結 果 以 sulfadimethoxine 呈 現 最 高 的 抗 藥 性 表 現, 且 不 同 地 區 來 源 的 細 菌 其 抗 藥 性 型 態 也 不 相 同, 作 者 認 為 可 能 是 因 各 個 牧 場 的 用 藥 習 慣 不 同 所 造 成 此 現 象 (Ma et al., 2006) 第 二 篇 文 獻 由 Hung 等 人 (2008) 於 臺 灣 調 查 從 動 物 及 人 類 身 上 分 離 出 的 鏈 球 菌 對 於 藥 物 敏 感 性 及 其 紅 黴 素 抗 藥 性 基 因 的 關 聯 從 15 種 動 物 及 人 類 一 共 蒐 集 了 248 株 鏈 球 菌, 並 使 用 azithromycin clarithromycin erythromycin spiramycin amoxicillin 及 enrofloxacin 一 共 7 種 抗 生 素 對 收 集 到 的 鏈 球 菌 菌 株 檢 測 其 對 藥 物 的 敏 感 性 程 度, 並 利 用 聚 合 酶 鏈 鎖 反 應 (PCR) 的 方 法 檢 測 其 紅 黴 素 抗 藥 性 基 因 結 果 不 同 來 源 的 248 株 鏈 球 菌 對 spiramycin 呈 現 最 高 的 抗 藥 性 表 現, 而 對 於 amoxicillin 藥 物 的 感 受 性 最 好, 以 PCR 偵 測 紅 黴 素 抗 藥 性 基 因 在 本 篇 研 究 以 erm(b) 所 佔 的 比 例 最 高 雖 然 在 臺 灣 也 有 其 它 的 文 獻 報 導 由 人 類 身 上 分 離 出 的 鏈 球 菌 是 以 mef(a) 為 主 要 的 紅 黴 素 抗 藥 性 基 因, 但 由 於 來 源 物 種 的 不 同, 作 者 認 為 在 臺 灣 由 動 物 身 上 所 分 離 出 帶 有 erm(b) 基 因 是 鏈 球 菌 主 要 對 於 紅 黴 素 類 藥 物 產 生 抗 藥 性 的 主 要 基 因 (Hung et al., 2008) 在 臺 灣, 由 程 (1993) 的 針 對 臺 灣 中 部 地 區 無 乳 鏈 球 菌 的 抗 藥 型 態 研 究, 其 將 分 離 出 來 的 178 株 無 乳 鏈 球 菌 以 penicillin methicillin bacitracin cephalothin cephaloridine nalidixic acid polymyxin B kanamycin streptomycin neomycin tetracycline gentamicin amikacin novobiocin ampicillin clindamycin chloramphenicol oxicillin erythromycin 及 vancomycin 共 20 種 藥 物 檢 測 其 抗 藥 性, 結 果 顯 示 無 乳 鏈 球 菌 的 抗 藥 性 比 例 最 高 為 nalidixic acid (100%), 其 次 為 polymyxin B (74.72%) kanamycin (70.2%) streptomycin (70.22%) neomycin (39.89%) tetracycline (34.83%) gentamicin (29.21%) amikacin (23.6%) 及 novobiocin (14.61%), 而 其 餘 的 抗 生 素 藥 物 在 此 篇 研 究 裡 少 有 抗 藥 性 或 無 抗 藥 性 由 趙 (1994) 對 於 分 離 出 的 76 株 乳 房 鏈 球 菌 以 17 種 抗 生 素 藥 物 檢 測 其 抗 藥 性 的 表 現, 藥 物 包 含 streptomycin colistin tetracycline penicillin methicillin bacitracin cephalothin polymyxin B kanamycin neomycin gentamicin novobiocin ampicillin clindamycin chloramphenicol erythromycin 及 vancomycin 結 果 顯 示 乳 房 鏈 球 菌 的 抗 藥 性 程 度 最 高 的 藥 物 依 序 為 14

25 streptomycin (97.3%) colistin (88.0%) tetracycline (78.7%) neomycin (66.7%) clindamycin (58.7%) kanamycin (49.3%) erythromycin (45.3%) polymyxin B (36.0%) 及 gentamicin (25.3%), 而 其 他 藥 物 的 抗 藥 性 比 例 低 或 無 抗 藥 性 根 據 程 (1993) 及 趙 (1994) 對 於 鏈 球 菌 在 台 灣 乳 牛 場 的 抗 藥 性 研 究 結 果, 可 與 本 次 實 驗 之 鏈 球 菌 抗 藥 性 程 度 的 表 現 來 相 互 比 較 三 其 他 國 家 之 鏈 球 菌 抗 藥 性 調 查 在 丹 麥,Rato 等 人 (2013) 在 2002 年 1 月 至 2003 年 5 月 於 11 個 牧 場 從 365 隻 次 臨 床 乳 房 炎 乳 牛 收 集 到 444 個 生 乳 樣 本 ; 培 養 後 分 離 出 60 株 具 有 完 全 溶 血 (β-hemolysis) 的 B 族 無 乳 鏈 球 菌 18 株 不 完 全 溶 血 (α-hemolysis) 的 C 族 異 乳 鏈 球 菌 及 30 株 不 溶 血 (γ-hemolysis) 的 乳 房 鏈 球 菌, 並 利 用 紙 碇 擴 散 法 (disk diffusion method) 來 對 這 些 菌 株 做 藥 物 敏 感 性 試 驗, 測 試 的 藥 物 有 penicillin cefazolin cefoperazone pirlimycin gentamicin streptomycin amoxicillin-clavulanic acid chloramphenicol erythromycin vancomycin tetracycline 及 rifaximin 其 抗 藥 性 結 果 以 streptomycin (97.2%) 及 gentamicin (80.6%) 為 最 高, 其 次 為 屬 tetracycline (64.8%) 作 者 認 為 其 結 果 鏈 球 菌 會 對 tetracycline 產 生 高 的 抗 藥 性 的 原 因 為 此 藥 物 已 長 時 間 的 被 廣 泛 使 用 於 治 療 牛 隻 疾 病 上, 所 以 造 成 細 菌 對 tetracycline 已 經 有 產 生 抗 藥 性 Nam 等 人 (2009) 於 韓 國 從 乳 牛 乳 汁 樣 本 分 離 出 的 鏈 球 菌 研 究 其 抗 藥 性 生 乳 汁 劃 於 血 液 瓊 脂 基, 經 35-37,18-24 小 時 培 養 後, 利 用 VITEK 系 統 來 鑑 定 菌 種, 抗 藥 性 的 檢 測 方 式 為 利 用 抗 生 素 紙 碇 擴 散 法 (disk diffusion method) 一 共 蒐 集 178 株 鏈 球 菌, 其 菌 種 分 布 為 有 99 株 的 Streptococcus uberis,30 株 的 Streptococcus bovis,24 株 的 Streptococcus oralis,13 株 的 Streptococcus salivarius, 7 株 的 Strepto coccus intermedius 及 5 株 的 Streptococcus agalactiae, 對 其 檢 測 7 種 藥 物 為 gentamicin lincomycin oxacillin penicillin cephalothin erythromycin 及 tetracycline 檢 測 的 178 株 鏈 球 菌 對 於 tetracycline(61.2%) 呈 現 最 高 的 抗 藥 性 結 果, 其 次 為 lincomycin(43.2%) 和 gentamicin(35.3%) 而 鏈 球 菌 對 於 penicillin 及 cephalothin 為 最 具 有 藥 物 的 敏 感 性 作 者 認 為 鏈 球 會 對 tetracycline 產 生 相 較 於 其 他 藥 物 較 高 的 抗 藥 性 原 因 和 韓 國 在 動 物 上 的 用 藥 習 慣 有 關, 作 者 提 到 tetracycline 在 韓 國 佔 50% 以 上 的 動 物 用 藥 (Nam et al., 2009) 15

26 Petrovski 等 人 (2011) 於 2003 年 到 2006 年 為 期 40 個 月 對 從 乳 牛 生 乳 樣 本 培 養 出 的 細 菌 調 查 其 抗 生 素 敏 感 性 的 研 究 利 用 實 驗 室 常 規 的 檢 測 來 鑑 定 細 菌, 根 據 培 養 後 細 菌 菌 落 的 外 觀 型 態 革 蘭 氏 染 色 觸 酶 的 測 試 凝 固 酶 測 試 CAMP 測 試 及 發 酵 反 應 將 細 菌 做 區 分, 菌 種 包 含 鏈 球 菌 屬 腸 球 菌 屬 金 黃 色 葡 萄 球 菌 凝 固 酶 陰 性 的 葡 萄 球 菌 及 大 腸 桿 菌 而 於 分 離 出 的 鏈 球 菌 菌 種 中, 以 屬 於 環 境 性 菌 的 乳 房 鏈 球 菌 所 佔 的 比 例 為 最 高 以 11 種 抗 生 素 藥 物 對 細 菌 做 檢 測, 藥 物 種 類 為 amoxicillin-clavulanic acid ampicillin oxacillin penicillin trimethoprim/sulphonamide cephalothin erythromycin neomycin streptomycin tetracycline 及 lincomycin 其 鏈 球 菌 藥 物 敏 感 性 結 果 顯 示 乳 房 鏈 球 菌 對 於 neomycin 及 streptomycin 的 藥 物 敏 感 度 最 低, 於 所 有 鏈 球 菌 種 中 對 於 amoxicillin-clavulanic acid 及 cephalothin 具 有 良 好 的 藥 物 感 受 性 然 而 乳 房 鏈 球 菌 對 於 相 同 屬 於 乙 內 醯 胺 類 藥 物 的 penicillin 及 oxacillin 呈 現 出 不 相 同 的 藥 物 敏 感 性 然 而 在 先 前 的 文 獻 中 報 導 由 人 類 分 離 出 的 鏈 球 菌 菌 株 也 具 有 與 Petrovski 等 人 (2011) 研 究 相 似 的 對 penicillin 及 oxacillin 具 有 不 同 的 敏 感 度 結 果, 作 者 認 為 這 可 能 是 與 細 菌 本 身 的 青 黴 素 結 合 蛋 白 不 同 有 關 (Petrovski et al., 2011) 在 法 國,Guérin-Faublée 等 人 (2002) 從 乳 房 炎 的 生 乳 中 分 離 出 50 株 的 乳 房 鏈 球 菌,42 株 的 異 乳 鏈 球 菌 及 8 株 的 無 乳 鏈 球 菌, 並 利 用 penicillin G amoxycillin cloxacillin cephalexin cefazolin cephapirin cefquinome erythromycin lincomycin minocycline rifaximin tetracycline streptomycin kanamycin gentamicin trimethoprim, chloramphenicol 和 rifampicin 的 藥 物 來 做 敏 感 性 測 試 結 果 鏈 球 菌 對 四 環 素 類 藥 呈 現 出 最 高 的 抗 藥 性 程 度, 抗 藥 性 次 高 的 為 巨 環 類 藥 及 林 可 醯 胺 類 藥 物 作 者 認 為 鏈 球 菌 會 對 某 些 藥 物 呈 現 出 高 的 抗 藥 性 表 現 其 原 因 為 廣 泛 及 長 時 間 使 用 某 類 抗 生 素 來 導 致 細 菌 出 現 抗 藥 性 的 結 果 (Guérin-Faublée et al., 2002) 16

27 第 三 章 材 料 與 方 法 第 一 節 鏈 球 菌 株 來 源 本 實 驗 所 使 用 之 鏈 球 菌 株 為 自 2012 年 8 月 至 2013 年 8 月 間 蒐 集 於 台 灣 各 地 區 乳 牛 牧 場 之 生 乳 樣 本 並 進 行 培 養 分 離, 共 計 有 157 株 經 鑑 定 為 鏈 球 菌 及 進 行 各 項 試 驗 一 乳 汁 採 樣 及 培 養 乳 汁 樣 本 蒐 集 於 2012 年 8 月 至 2013 年 8 月 間, 採 樣 及 培 養 過 程 參 照 美 國 國 家 乳 房 炎 評 議 會 (National Mastitis Council, NMC) 之 無 菌 操 作 程 序 (NHC, 1999) 乳 汁 採 樣 前, 使 用 清 水 沖 洗 牛 隻 乳 頭 後, 使 用 乾 淨 之 毛 巾 或 紙 巾 將 殘 留 在 乳 頭 上 的 水 滴 徹 底 擦 乾, 並 依 各 牧 場 習 慣 進 行 前 藥 浴 的 消 毒 使 用 含 有 70 % 乙 醇 棉 花 徹 底 將 牛 隻 乳 頭 開 口 擦 拭 消 毒, 消 毒 順 序 由 離 採 樣 人 員 最 遠 的 乳 頭 開 始 至 離 採 樣 人 員 最 近 的 乳 頭, 進 行 乳 汁 採 樣 時 則 由 離 採 樣 人 員 最 近 的 乳 頭 至 遠 乳 汁 收 集 時 須 先 榨 去 各 分 房 之 乳 頭 前 端 的 生 乳 二 至 三 次 後, 再 以 15 ml 無 菌 離 心 管 收 集 乳 汁 樣 本 採 集 時, 無 菌 離 心 管 應 與 地 面 呈 45 度, 並 且 離 心 管 之 開 口 不 能 觸 碰 到 雙 手 及 乳 頭 開 口, 採 樣 過 程 必 需 是 維 持 無 污 染 採 集 的 乳 汁 樣 本 可 分 為 分 房 乳 (quarter milk) 和 混 合 乳 (composed milk), 分 房 乳 為 採 集 各 個 獨 立 分 房 至 少 3 ml 之 乳 汁 樣 本 於 無 菌 的 15 ml 離 心 管, 混 合 乳 為 採 集 每 個 分 房 乳 汁 樣 本 2-3mL 於 同 一 管 無 菌 的 15mL 離 心 管, 每 管 試 管 均 分 別 標 記 記 號 採 樣 完 成 後 將 試 管 放 置 於 含 有 冰 塊 的 攜 帶 式 冰 箱 暫 時 保 存 並 帶 回 實 驗 室 進 行 微 生 物 培 養 二 微 生 物 培 養 乳 汁 樣 本 試 管 外 表 經 70% 乙 醇 噴 霧 消 毒 後 置 於 無 菌 操 作 檯 內, 並 將 試 管 上 下 輕 微 搖 晃 數 次 使 乳 汁 混 合 均 勻 後, 每 一 管 樣 本 以 接 種 環 沾 取 約 5-10 μl 乳 汁 接 種 於 血 液 瓊 脂 培 養 基 (Blood agar plate, Creative Microbioloicals, Taiwan) 上, 於 37 好 氧 培 養 小 時 後 判 讀 17

28 第 二 節 菌 種 培 養 與 鑑 定 一 鏈 球 菌 之 分 離 與 判 定 所 採 集 之 生 乳 樣 本 直 接 接 種 於 血 液 瓊 脂 培 養 基, 以 37 好 氧 培 養 小 時 後, 觀 察 生 長 之 細 菌 菌 落 型 態, 若 為 圓 型, 表 面 光 滑, 顏 色 不 透 明, 菌 落 大 小 約 為 mm, 及 伴 隨 著 具 有 完 全 溶 血 (β-hemolysis) 不 完 全 溶 血 (α-hemolysis) 或 不 溶 血 (γ-hemolysis) 的 特 性 ; 經 革 蘭 氏 染 色 法 檢 驗 結 果 若 為 陽 性 球 菌, 則 以 接 種 環 刮 取 單 一 個 菌 落 接 種 於 Edwards agar plate (Oxoid TM Modified Edwards Medium with 5% bovine washed erythrocyte), 於 37 好 氧 培 養 24 小 時 若 可 於 Edwards agar plate 上 生 長 出 之 細 菌 並 且 菌 落 外 有 黑 色 色 素 產 生 則 初 步 判 定 為 鏈 球 菌, 之 後 挑 出 獨 立 菌 落 保 存 並 待 進 一 步 鑑 定 二 CAMP (Christie-Atkins-Munch-Petersen) 試 驗 無 乳 鏈 球 菌 (Streptococcus agalactiae) 會 與 只 具 有 β 溶 血 的 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus) 在 血 液 瓊 脂 培 養 基 上 產 生 共 同 溶 血 反 應 (cohemolytic reaction), 於 血 液 瓊 脂 培 養 基 上 產 生 類 似 半 月 型 或 三 角 型 的 完 全 溶 血 區, 而 只 有 無 乳 鏈 球 菌 是 唯 一 可 以 利 用 實 驗 室 常 規 的 好 氣 檢 驗 方 法 CAMP 來 確 定 (Guélat-Brechbuehl et al., 2010) 將 經 Edward agar plate 篩 選 後 且 在 血 液 瓊 脂 培 養 基 上 具 有 完 全 溶 血 圈 之 鏈 球 菌 與 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (BCRC 12654) 共 同 培 養, 過 操 作 方 法 下 如 下 : ( 一 ) 先 以 接 種 環 沾 取 只 具 有 β 溶 血 的 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (BCRC 12654) 在 血 液 瓊 脂 培 養 基 中 央 劃 一 直 線 ( 二 ) 將 懷 疑 是 無 乳 鏈 球 菌 的 菌 株 以 接 種 環 沾 取 其 菌 落 並 劃 於 血 液 瓊 脂 培 養 基 上 與 金 黃 色 葡 萄 球 菌 的 直 線 成 垂 直, 兩 線 之 間 需 有 3mm 的 距 離 ( 三 ) 以 37 培 養 小 時 後 判 讀 三 API 20 Strept 生 化 鑑 定 經 Edwards agar plate 篩 選 之 鏈 球 菌 菌 株 繼 代 培 養 在 血 液 瓊 脂 培 養 基,37 好 氧 培 養 24 小 時 後, 以 接 種 環 刮 取 單 一 個 獨 立 菌 落 接 種 在 哥 倫 比 亞 血 液 瓊 脂 培 養 基 (Columbia CAN agar with 5% sheep blood, Creative Microbioloicals, 18

29 Taiwan) 上,37 厭 氧 培 養 24 小 時 後, 再 以 API 20 Strept 生 化 鑑 定 套 組 (biomérieux, Marcy-l Etoile, France) 進 行 細 菌 鑑 定 其 操 作 步 驟 如 下 : ( 一 ) 以 接 種 環 挑 取 哥 倫 比 亞 血 液 瓊 脂 培 養 基 上 的 菌 落 至 3mL 已 滅 菌 的 蒸 餾 水 中 混 合 均 勻, 並 以 比 色 計 調 整 細 菌 混 合 液 濃 度 至 大 於 等 於 4 McFarland ( 二 ) 以 微 量 吸 管 將 細 菌 混 合 液 依 序 加 入 至 試 驗 條 上 的 小 孔 內 ( 三 ) 於 試 驗 條 上 的 試 驗 小 孔 VP HIP ESC PYRA αgal βgur βgal PAL LAP 及 ADH 加 入 約 100 μl 的 細 菌 混 合 液 ( 四 ) 取 500 μl 的 細 菌 混 合 液 加 入 API GP Medium 中 混 合 均 勻, 再 以 微 量 吸 管 將 混 有 菌 液 的 GP Medium 之 混 合 液 加 滿 至 試 驗 小 孔 RIB ARA MAN SOR LAC TRE INU RAF AMD 及 GLYG ( 五 ) 加 完 菌 液 的 試 驗 小 孔 ADH RIB ARA MAN SOR LAC TRE INU RAF AMD 及 GLYG 需 以 無 菌 礦 物 油 填 滿 以 維 持 厭 氧 的 狀 態, 恆 溫 37 好 氧 培 養 4 個 小 時 ( 六 ) 培 養 4 小 時 後, 試 驗 小 孔 VP 加 入 試 劑 VP1 及 VP2 各 一 滴 試 驗 小 孔 HIP 加 入 試 劑 NIN 兩 滴 試 驗 小 孔 PYRA αgal βgur β GAL PAL 及 LAP 加 入 試 劑 ZYM A 及 ZYM B 各 一 滴, 靜 待 十 分 鐘 後 判 讀 其 餘 項 目 需 立 即 判 讀 試 驗 小 孔 內 所 含 的 物 質 及 判 讀 結 果 如 附 錄 6 及 附 錄 7 ( 七 ) 判 讀 完 畢 記 錄 後 再 將 試 驗 條 以 恆 溫 37 好 氧 培 養 小 時 ( 八 ) 培 養 完 成 後 將 判 讀 結 果 輸 入 apiwebtm (biomérieux, Marcy-l Etoile, France), 即 可 得 知 試 驗 之 菌 種 及 鑑 定 率 四 乳 膠 凝 集 試 驗 (Latex agglutination test) Lancefield 認 為 不 同 鏈 球 菌 種 其 細 胞 壁 所 含 的 胜 肽 多 醣 (Peptidoglycan) 也 不 相 同, 可 以 依 照 其 所 含 抗 原 特 性 將 鏈 球 菌 分 為 A 至 T 族 群 此 試 驗 為 使 用 Oxoid Dryspot Streptococcal Grouping Kit (Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, United Kingdom) 鑑 定 鏈 球 菌 細 胞 壁 所 含 特 異 性 多 醣 類 抗 原 A B C D F 和 G 之 乳 膠 凝 集 試 驗, 其 操 作 步 驟 如 下 : ( 一 ) 血 清 型 A B C D F 和 G 乳 膠 試 劑 在 使 用 前 需 先 置 室 溫 回 溫, 並 確 實 將 乳 膠 懸 浮 液 搖 晃 混 合 均 勻 ( 二 ) 將 萃 取 酵 素 依 據 包 裝 標 示, 加 入 無 菌 去 離 子 水 回 溶 Oxoid 19

30 Streptococcus extraction enzyme (DR0593), 取 大 約 0.4 ml 酵 素 試 劑 於 每 個 試 驗 反 應 玻 璃 管 ( 三 ) 於 培 養 基 上 挑 選 2-3 個 菌 落 數 至 反 應 玻 璃 管 中 與 酵 素 乳 化 後, 置 於 水 浴 槽 37 培 養 10 分 鐘 ( 培 養 5 分 鐘 時 將 試 管 拿 起 來 搖 晃 混 合 2-3 秒, 再 繼 續 培 養 ) 培 養 後, 降 溫 至 室 溫 此 萃 取 液 可 以 檢 測 備 用 ( 四 ) 取 一 滴 乳 膠 試 劑 置 於 試 驗 卡 的 反 應 圈 上 ( 五 ) 取 一 滴 細 菌 之 萃 取 液 滴 於 反 應 圈 上 ( 六 ) 利 用 塑 膠 棒 將 乳 膠 試 劑 與 細 菌 萃 取 液 混 合 並 均 勻 擴 散 到 整 個 反 應 圈, 並 輕 輕 的 旋 轉 反 應 卡,30 秒 內 會 開 始 凝 集, 判 讀 勿 超 過 1 分 鐘 ( 八 ) 當 凝 集 發 生, 則 將 結 果 判 定 為 陽 性 ; 若 無 凝 集 發 生, 結 果 則 判 定 為 陰 性 微 弱 凝 集, 則 將 結 果 視 為 陰 性 五 菌 種 保 存 挑 選 於 哥 倫 比 亞 血 液 瓊 脂 培 養 基 上,37 厭 氧 培 養 24 小 時 之 獨 立 菌 落 經 API 20 Strept 鑑 定 為 鏈 球 菌 者, 接 種 於 含 有 1 ml Tryptic Soy Broth (TSB, Difco Laboratories, Sparks, Maryland, USA) 冷 凍 小 管 中,37 好 氧 培 養 24 小 時 後, 使 用 微 量 吸 管 注 入 200 μl 之 無 菌 甘 油 (glycerol), 使 得 於 Tryptic Soy Broth 好 氧 培 養 24 小 時 後 之 細 菌 與 甘 油 充 分 混 合 均 勻, 保 存 於 -70 冰 箱 20

31 第 三 節 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 所 選 用 的 抗 生 素 藥 物 為 Ampicillin (AMP-10) Amoxicillin (AML-25) Penicillin (P-10) Cefazolin (KZ-30) Cefuroxime (CXM-30) Ceftiofur (EFT-30) Cloxacillin (OB-5) Bacitracin (B-10) Neomycin (N-30) Oxytetracycline (OT-30) Tetracycline (TE-30) Amikacin (AK-30) Chloramphenicol (C-30) Lincomycin (MY-15) Streptomycin (S-10) Kanamycin (K-30) (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, England) 等 16 種 藥 物 進 行 測 試 實 驗 方 法 參 照 美 國 國 家 臨 床 實 驗 室 標 準 委 員 會 (Clinical and Laboratroy Standard Institute, CLSI) 之 紙 碇 擴 散 法 (Disk diffusion method) (CLSI, 2008) 以 接 種 環 挑 選 血 液 瓊 脂 培 養 基 經 37 好 氧 培 養 之 鏈 球 菌 落 至 滅 菌 的 蒸 餾 水 中, 混 合 均 勻 之 菌 液 濃 度 需 調 整 至 0.5 McFarland 以 spectrophotometer (Biochrom, C08000) 調 整 菌 液 濃 度 至 與 0.5 McFarland ( 約 莫 CFU/mL) 相 同 濁 度 之 0.13 吸 光 值, 以 滅 菌 棉 棒 沾 取 菌 液, 將 吸 滿 菌 液 的 棉 棒 以 三 個 方 向 (120 度 ) 平 均 塗 勻 在 血 液 瓊 脂 培 養 基 上, 將 抗 生 素 藥 片 放 置 器 (Disk dispenser, Oxoid, Basingstoke, Hampshire, England) 放 入 欲 測 試 的 抗 生 素 藥 片 並 貼 於 均 勻 塗 滿 菌 液 的 血 液 瓊 脂 培 養 基 上,37 好 氧 培 養 小 時, 依 據 CLSI 之 抑 菌 圈 說 明 表 ( 附 錄 8) 來 判 定 是 否 具 有 抗 藥 性 (R, resistant) 中 間 性 (I, intermediate) 或 為 敏 感 性 (S, susceptible) 第 四 節 統 計 分 析 本 實 驗 結 果 使 用 Chi-square test 進 行 統 計 學 分 析, 實 驗 數 據 以 SPSS (16.0 版 ) 統 計 軟 體 處 理 分 析, 分 析 分 離 來 自 乳 汁 樣 本 之 鏈 球 菌 對 於 各 類 抗 生 素 之 敏 感 性 及 抗 藥 性 的 相 關 性, 統 計 結 果 以 費 雪 檢 定 (Fisher s exact test) 來 檢 測 是 否 具 有 顯 著 的 差 異, 當 P 值 小 於 0.05 時 判 定 具 有 顯 著 差 異 21

32 第 四 章 結 果 第 一 節 鏈 球 菌 分 離 結 果 一 乳 汁 培 養 結 果 本 實 驗 於 2012 年 8 月 至 2013 年 8 月 間 自 台 灣 各 地 區 共 計 30 個 乳 牛 牧 場 共 採 集 2971 個 乳 汁 樣 本, 進 行 一 般 微 生 物 培 養 及 鏈 球 菌 菌 株 挑 選, 初 步 挑 選 353 個 疑 似 鏈 球 菌 株, 之 後 以 Edwards agar plate 進 行 細 菌 篩 選 分 離, 初 步 結 果 共 分 離 185 株 菌 進 行 生 化 鑑 定 二 菌 種 鑑 定 之 結 果 本 實 驗 利 用 API 20 Strept 生 化 鑑 定 套 組 鑑 定 結 果, 除 了 27 株 為 Aerococcus spp. Enterococcus spp. 及 Lactococcus lactis spp. 外, 共 鑑 定 鏈 球 菌 157 株, 其 中 包 括 乳 房 鏈 球 菌 (Streptococcus uberis) 116 株 (73.9%), 牛 鏈 球 菌 (Streptococcus bovis) 16 株 (10.2%), 異 乳 鏈 球 菌 (Streptococcus dysgalactiae) 16 株 (10.2%), 無 乳 鏈 球 菌 (Streptococcus agalactiae) 有 6 株 (3.8%), 馬 鏈 球 菌 (Streptococcus equines) 2 株 (1.3%) 及 1 株 (0.6%) 緩 症 鏈 球 菌 (Streptococcus mistis)(fig. 4), 鑑 定 結 果 以 乳 房 鏈 球 所 佔 的 比 例 73.9% 最 高 S. dysgalactiae n=16 S. agalactiae n=6 S. equinus n=2 S. mitis n=1 S. bovis n=16 S. uberis n=116 Fig. 1 Identification and prevalence of 157 Streptococcus spp. isolated from bovine milk samples. 22

33 三 鏈 球 菌 之 乳 膠 凝 集 試 驗 結 果 以 Oxoid Dryspot Streptococcal Grouping Kit 檢 測 由 API 20 Strept 生 化 鑑 定 套 組 鑑 定 為 鏈 球 菌 之 157 株 菌 的 細 胞 壁 特 異 性 多 醣 類 之 抗 原 特 性 分 族, 其 結 果 ;A 族 鏈 球 菌 0 株,B 族 鏈 球 菌 6 株,C 族 鏈 球 菌 16 株,D 族 鏈 菌 15 株, F 族 鏈 球 菌 0 株,G 族 鏈 球 菌 1 株 以 及 無 凝 集 反 應 為 119 株 與 API 20 Strept 鑑 定 菌 種 的 結 果 相 互 比 較, 其 鏈 球 菌 特 異 性 醣 類 抗 原 抗 體 凝 集 反 應 試 驗 結 果 未 有 A 族 鏈 球 菌 而 API 20 Strept 未 鑑 定 出 相 關 之 菌 種 B 族 鏈 球 菌 共 有 6 株 菌 具 有 凝 集 反 應 為 API 20 Strept 鑑 定 出 菌 種 全 為 S. agalactiae C 族 鏈 球 菌 有 16 株,API 20 Strept 鑑 定 出 菌 種 全 為 S. dysgalactiae 於 D 族 的 抗 原 抗 體 呈 現 凝 集 反 應 共 有 15 株 鏈 球 菌, 包 含 2 株 API 20 Strept 鑑 定 為 S. equines 及 13 株 的 S. bovis F 族 未 有 鏈 球 菌 有 抗 原 抗 體 凝 集 反 應, 其 API 20 Strept 未 鑑 定 出 相 關 菌 種 G 族 鏈 球 菌 有 1 株 菌 具 有 凝 集 反 應, 其 此 菌 在 API 20 Strept 鑑 定 結 果 為 S. bovis 而 抗 原 抗 體 無 凝 集 反 應 共 有 119 株 菌,API 20 Strept 鑑 定 結 果 為 S. uberis 共 有 116 株 2 株 的 S. bovis 和 1 株 的 S. mitis, 在 血 清 抗 原 抗 體 反 應 中 皆 無 凝 集 實 驗 檢 測 圖 列 於 Fig. 2, 與 API 20 Strept 鑑 定 結 果 相 互 比 較 列 於 Table 1 四 鏈 球 菌 溶 血 型 型 態 本 實 驗 之 鏈 球 菌 於 培 養 過 程 中 觀 察 到 三 種 不 同 的 溶 血 型 態, 分 別 為 ; 不 完 全 溶 血 (α-hemolysis) 完 全 溶 血 (β-hemolysis) 及 不 溶 血 (γ-hemolysis) 的 特 性 將 蒐 集 到 的 菌 株 分 別 培 養 在 血 液 瓊 脂 培 養 基, 恆 溫 小 時 培 養 後 拍 攝 圖 A 為 編 號 16 經 由 API 20 Strept 鑑 定 為 異 乳 鏈 球 菌,24 小 時 37 培 養 後, 於 血 液 瓊 脂 培 養 基 上 觀 察 到 菌 落 周 圍 具 有 綠 色 的 不 完 全 溶 血 圈 圖 B 為 編 號 162 經 由 API 20 Strept 鑑 定 後 為 無 乳 鏈 球 菌,24 小 時 37 培 養 後, 於 血 液 瓊 脂 培 養 基 上 觀 察 到 菌 落 周 圍 具 有 乾 淨 的 完 全 溶 血 圈 圖 C 為 編 號 20 經 API 20 Strept 鑑 定 後 為 乳 房 鏈 球 菌,24 小 時 37 培 養 後, 於 血 液 瓊 脂 培 養 基 上 觀 察 到 菌 落 周 圍 無 溶 血 圈 Fig. 3 之 圖 A B 及 C 為 生 長 於 血 液 瓊 脂 培 養 基 上 鏈 球 菌 菌 落 之 溶 血 型 態 五 CAMP 試 驗 結 果 6 株 ( 菌 株 號 碼 為 及 166) 具 有 完 全 溶 血 鏈 球 菌 於 API 20 Strept 鑑 定 為 無 乳 鏈 球 菌 之 CAMP 試 驗 結 果 皆 與 金 黃 色 葡 萄 球 菌 23

34 (Staphylococcus aureus,bcrc 12654) 產 生 共 同 溶 血 反 應 (cohemolytic reaction), CAMP 試 驗 結 果 圖 列 於 Fig. 4 之 圖 A 及 圖 B API 20 Strept 鑑 定 結 果 為 牛 鏈 球 菌 ( 菌 株 編 號 1), 異 乳 鏈 球 菌 ( 菌 株 編 號 6), 馬 鏈 球 菌 ( 菌 株 編 號 12) 及 乳 房 鏈 球 菌 ( 菌 株 編 號 20) 之 CAMP 試 驗 結 果 皆 不 與 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus,bcrc 12654) 產 生 共 同 溶 血 反 應 詳 見 Fig. 4 之 圖 C 24

35 Table 1. Result of API 20 Strept and Oxoid dryspot streptococcal grouping kit to detect streptococcal species and group. Number of streptococcal strains API 20 Strept Streptococcal grouping kit A * B C D F G NA S. uberis S. bovis S. dysgalactiae S. agalactiae S. equinus S. mitis Total * : A, Group A streptococci; B, Group B streptococci; C, Group C streptococci; D, Group D streptococci; F, Group F streptococci; G, Group G streptococci; NA, no agglutination. 25

36 A. B. * * C. D. * * E. F. * Fig. 2 Result of Oxoid dryspot streptococcal grouping kit to detect streptococcal group. (A. and B. are both S. dysgalactiae, group c is positive with agglutination. C. and D. are both S. agalactiae, group B is positive with agglutination. E. is S. bovis, group D is positive with agglutination. F is S. uberis, no group agglutinated in this reaction.) 26

37 A. B. C. Fig. 3 The morphology (A, B, and C) of streptococcal hemolysis types (A is α-hemolysis, B is β-hemolysis and C is γ-hemolysis), after 24 hours incubation at 37, the strain of A is S. dysgalactiae, B is S. agalactiae, and C is S. uberis. 27

38 A. B. Staphylococcus aureus BCRC Staphylococcus aureus BCRC NO. 163 S. agalactiae NO. 159 S. agalactiae NO. 162 S. agalactiae NO. 154 S. agalactiae NO. 166 S. agalactiae NO. 155 S. agalactiae C. Staphylococcus aureus BCRC NO. 20 S. uberis NO. 12 S. equinus NO. 162 S. agalactiae NO. 1 S. bovis NO. 6 S. dysgalactiae Fig. 4 Result of CAMP test (A, B, and C) of Streptococcus spp. and Staphylococcus aureus BCRC on blood agar plates after 24 hours incubation at

39 第 二 節 鏈 球 菌 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 檢 測 結 果 一 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 結 果 本 實 驗 所 分 離 及 鑑 定 後 的 鏈 球 菌 菌 株 (n=157) 之 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 ( 如 Fig. 5), 其 結 果 列 於 Table 2 及 Fig. 6 中, 抗 藥 性 比 例 最 高 者 為 amikacin (98.7%, 155/157) kanamycin (98.7%,155/157) streptomycin (98.7%,155/157) neomycin (98.0%,157/154),oxytetracycline (85.4%,134/157) tetracycline (85.4%,134/157) 及 lincomycin (75.8%,119/157); 而 抗 藥 性 出 現 率 最 低 的 抗 生 素 有 amoxicillin (0.7%,1/157) cefuroxime (0.7%,1/157) cefazolin (1.9%,3/157) ceftiofur (1.9%,3/157) chloramphenicol (2.5%,4/157) bacitracin (3.2%,5/157) 及 cloxacillin (4.5%,7/157), 其 次 為 penicillin (17.2%,27/157) 和 ampicillin (22.9%,36/157) 實 驗 使 用 16 種 抗 生 素 來 對 從 乳 汁 樣 本 分 離 出 的 鏈 球 菌 做 藥 物 敏 感 性 試 驗, 將 16 種 抗 生 素 依 照 種 類 區 分 為 7 大 類 青 黴 素 類 (penicillins) 的 penicillin amoxicillin ampicillin 及 cloxacillin, 頭 孢 子 素 類 (cephalosporins) 的 cefazolin cefuroxime 及 ceftiofur, 胺 基 配 醣 體 類 (aminoglycosides) 的 amikacin kanamycin neomycin 及 streptomycin, 四 環 素 類 (tetracyclines) 的 oxytetracycline 和 tetracycline, 林 可 醯 胺 類 (lincosamides) 的 lincomycin, 多 肽 類 (polypeptides) 的 bacitracin 和 屬 氯 黴 素 類 (chloramphenicols) 的 chloramphenicol 將 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 結 果 與 API 20 Strept 鑑 定 鏈 球 菌 菌 種 結 果 做 關 聯 性 比 較, 鏈 球 菌 各 不 同 菌 種 之 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 結 果 詳 見 於 Table 株 鏈 球 菌 於 API 20 Strept 鑑 定 結 果, 除 了 2 株 的 S. agalactiae 外, 其 155 株 鏈 球 菌 皆 呈 現 對 胺 基 配 醣 體 類 (aminoglycosides) 藥 物 amikacin kanamycin streptomycin 及 neomycin 具 有 抗 藥 性, 其 抗 藥 性 的 比 例 為 最 高 (S. uberis:100% (116/116),S. bovis:100% (16/16),S. dysgalactiae:100% (16/16),S. agalactiae;66.6% (4/6) 及 2 株 S. equinus 和 1 株 S. mitis : 100% (3/3)), 抗 藥 性 次 高 為 四 環 素 類 (tetracyclines) 藥 物 的 oxytetracycline 和 tetracycline ; 再 之 為 屬 林 可 醯 胺 類 (lincosamides) 藥 物 的 lincomycin S. uberis 對 於 青 黴 素 類 (penicillins) 藥 物 的 penicillin (22.4%,26/116) 及 Ampicillin (29.3%,34/116) 抗 藥 性 表 現 相 對 於 其 他 青 黴 素 類 (penicillins) 藥 物 的 amoxicillin (0.9%,1/116) 和 cloxacillin (5.2%,6/116) 的 抗 藥 性 呈 現 較 高, 而 S. uberis 對 於 頭 孢 子 素 類 (cephalosporins) 藥 物 cefazolin (2.6%, 3/116) 29

40 cefuroxime (0.9%,1/116) 及 ceftiofur (2.6%,3/116) 及 bacitracin (3.4%,4/116) 抗 生 素 呈 現 較 低 的 抗 藥 性 比 例, 具 有 較 好 的 感 受 性 鏈 球 菌 之 S. bovis S. dysgalactiae S. agalactiae S. equinus 及 S. mitis 皆 對 於 青 黴 素 類 (penicillins) 藥 物 和 頭 孢 子 素 類 (cephalosporins) 藥 物 呈 現 良 好 的 的 感 受 性 二 抗 藥 性 之 分 型 157 株 鏈 球 菌 中, 依 照 鏈 球 菌 對 本 研 究 所 測 試 的 16 種 抗 生 素 藥 物 之 抗 藥 性 可 分 為 30 種 抗 藥 型 態 ; 抗 藥 性 最 低 的 菌 株 對 所 檢 測 的 16 種 藥 物 之 2 種 抗 生 素 產 生 抗 藥 性 (1.3%,2/157); 其 次 依 序 為 4 種 (5.0%,8/157),5 種 (6.4%,10/157) 6 種 (16.6%,26/157) 7 種 (45.9%,72/157) 8 種 (10.2%,16/157),9 種 (8.9%, 14/157) 10 種 (4.4%,7/157) 及 11 種 (1.3%,2/157) 其 抗 藥 性 型 態 最 常 被 觀 察 為 對 7 種 抗 生 素 具 有 抗 藥 性, 又 以 對 amikacin kanamycin neomycin streptomycin oxytetracycline tetracycline 和 lincomycin 的 抗 藥 性 型 態 比 例 最 高 其 抗 藥 性 型 態 詳 列 於 Table 4 30

41 Inhibition zone No inhibition zone Inhibition zone diameter Fig. 5 Antimicrobial susceptibility test of streptococcal isolates from milk samples by using disk diffusion method with 24 hours incubation at 37. The results were evaluated with Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility test for bacterial isolated from animals; approved standards- third edition (CLSI, 2008) and information of commercial product (Oxoid Ltd., Basingstoke, UK). Antimicrobial agents disk: no.1 disk is N30 (neomycin), no.2 disk is B10 (bacitracin), no.3 disk is OB5 (cloxacillin), no.4 disk is AMP (ampicillin), no.5 disk is KZ30 (cefazolin), no.6 disk is CXM30 (cefuroxime), no.7 disk is EFT30 (ceftiofur), no.8 disk is OT30 (oxytetracycline). 31

42 Table 2. Result of antimicrobial susceptibility test of streptococcal isolates from milk samples. Antimicrobial All isolates (n=157) agents S * % I % R % Amikacin (AK 30) Amoxicillin (AML 25) Ampicillin (AMP 10) Bacitracin (B 10) Cefazolin (KZ 30) Cefuroxime (CXM 30) Ceftiofur (EFT 30) Cloxacillin (OB 5) Chloramphenicol (C 30) Kanamycin (K 30) Lincomycin (MY 15) Neomycin (N 30) Oxytetracycline (OT 30) Penicillin (P 10) Streptomycin (S 10) Tetracycline (TE 30) * : S, susceptible; I, intermediate; R, resistant. 32

43 Antimicrobial resistance % Antimicrobial agents* Fig. 6 Proportion (%) of antimicrobial resistance in streptococci from bovine milk samples. * : AK30, amikacin; AML25, amoxicillin; AMP10, ampicillin; B10, bacitracin; KZ30, cefazolin; CXM30, cefuroxime; EFT30, ceftiofur; OB5, cloxacillin; C30, chloramphenicol; K30, kanamycin; MY15, lincomycin; N30, neomycin; OT30, oxytetracycline; P10, penicillin; S10, streptomycin; TE30, tetracycline. 33

44 Table 3. Result of antimicrobial susceptibility of different species of streptococcal isolates identified by API 20 Strept in this study. Antimicrobial S. uberis S. bovis S. dysgalactiae S. agalactiae Streptococcus spp. a agents S b % I % R % S % I % R % S % I % R % S % I % R % S % I % R % Amikacin (AK 30) Amoxicillin (AML 25) Ampicillin (AMP 10) Bacitracin (B 10) Cefazolin (KZ 30) Cefuroxime (CXM 30) Ceftiofur (EFT 30) Cloxacillin (OB 5) Chloramphenicol (C 30) Kanamycin (K 30) Lincomycin (MY 15) Neomycin (N 30) Oxytetracycline (OT 30) Penicillin (P 10) Streptomycin (S 10) Tetracycline (TE 30) a : Streptococcus spp. = S. mitis + S. equines. b : S, susceptible; I, intermediate; R, resistant. 34

45 Table different antibiotic resistance patterns of streptococcal isolates. Type Resistance patterns * No. of isolates with pattern and % No. of isolates with Type Resistance patterns a pattern and % 1 OT-TE Ak-K-N-S-B-OT-TE Ak-K-N-S Ak-K-N-S-OB-OT-TE-MY Ak-K-S-MY Ak-K-N-S-AMP-OT-TE-MY Ak-K-N-S-MY Ak-K-N-S-AMP-OT-P-MY Ak-K-N-S-P Ak-K-N-S-AMP-OT-TE-P-MY Ak-K-N-S-TE Ak-K-N-S-AMP-OB-OT-TE-MY Ak-K-N-S-OT-TE Ak-K-N-S-AMP-KZ-CXM-OB-P Ak-K-N-S-AMP-MY Ak-K-N-S-B-OB-OT-TE-MY Ak-K-N-S-AMP-P Ak-K-N-S-AMP-OT-TE-P-C-MY Ak-K-N-S-P-MY Ak-K-N-S-AMP-EFT-OB-OT-TE-MY Ak-K-N-S-OT-MY Ak-K-N-S-AML-AMP-OT-TE-P-MY Ak-K-N-S-TE-MY Ak-K-N-S-B-KZ-OT-P-C-MY Ak-K-N-S-OT-TE-MY Ak-K-N-S-B-KZ-OT-TE-P-MY Ak-K-N-S-AMP-OT-MY Ak-K-N-S-AMP-B-EFT-OT-TE-P-MY Ak-K-N-S-AMP-OT-TE Ak-K-N-S-AMP-EFT-OB-OT-TE-P-MY * : AK, amikacin; AML, amoxicillin; AMP, ampicillin; B, bacitracin; KZ, cefazolin; CXM, cefuroxime; EFT, ceftiofur; OB, cloxacillin; C, chloramphenicol; K, kanamycin; MY, lincomycin; N, neomycin; OT, oxytetracycline; P, penicillin; S, streptomycin; TE, tetracycline. 35

46 第 三 節 鏈 球 菌 於 各 類 抗 生 素 抗 藥 性 結 果 一 乙 內 醯 胺 類 (β-lactam) 抗 生 素 本 實 驗 之 鏈 球 菌 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 共 選 用 了 16 種 抗 生 素 藥 物, 其 中 屬 於 乙 內 醯 胺 類 (β-lactam) 抗 生 素 類 藥 物 共 有 7 種, 分 別 為 屬 於 青 黴 素 類 的 penicillin amoxicillin ampicillin 和 cloxacillin 及 屬 於 頭 孢 子 素 類 藥 物 的 第 一 代 頭 孢 子 素 cefazolin 第 二 代 頭 孢 子 素 cefuroxime 和 第 三 代 頭 孢 子 素 ceftiofur 將 157 株 鏈 球 菌 對 其 這 7 種 藥 物 之 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 結 果 來 進 行 抗 藥 性 的 統 計 學 的 分 析, 分 析 鏈 球 菌 對 於 青 黴 素 類 藥 物 的 penicillin amoxicillin ampicillin 和 cloxacillin 抗 藥 性 結 果 之 間 相 比 較 是 否 具 有 統 計 學 上 的 差 異 鏈 球 菌 對 於 頭 孢 子 素 類 藥 物 的 cefazolin cefuroxime 及 ceftiofur 共 3 種 藥 物 的 抗 藥 性 結 果 之 間 相 互 比 較, 再 將 此 7 種 藥 物 之 抗 藥 性 結 果 相 互 比 較 於 青 黴 素 類 藥 物 結 果 鏈 球 菌 對 於 penicillin (17.2%,27/157,) 與 ampicillin (22.9%,36/157) 之 抗 藥 性 呈 現 顯 著 高 於 amoxicillin (0.7%,1/157) 與 cloxacillin (4.5%,7/157),(P<0.05, 具 有 統 計 學 上 顯 著 的 差 異 ) 詳 見 於 Fig. 7 之 圖 A 與 圖 B, 根 據 統 計 結 果 顯 示 鏈 球 菌 對 於 amoxicillin 及 cloxacillin 的 抗 藥 性 表 現 是 明 顯 低 於 penicillin 及 ampicillin 鏈 球 菌 對 於 amoxicillin 與 cloxacillin 之 間 抗 藥 性 無 顯 著 差 異, 鏈 球 菌 對 於 penicillin 與 ampicillin 抗 藥 性 無 顯 著 差 異 鏈 球 菌 對 於 頭 孢 子 素 類 藥 物 其 抗 藥 性 的 結 果 cefazolin (1.9%,3/157), cefuroxime (0.7%,1/157) 及 ceftiofur (1.9%,3/157), 經 統 計 分 析 後 鏈 球 菌 對 此 三 種 藥 物 之 抗 藥 性 皆 無 明 顯 的 差 異 鏈 球 菌 對 此 三 種 藥 物 之 抗 藥 性 百 分 比 圖 詳 見 於 Fig. 8 將 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 結 果 進 行 統 計 學 分 析 鏈 球 菌 對 其 7 種 屬 乙 內 醯 胺 類 (β-lactam) 的 抗 生 素 藥 物 penicillin amoxicillin ampicillin 和 cloxacillin cefazolin cefuroxime 和 ceftiofur 抗 藥 性 結 果 之 間 相 互 比 較 是 否 有 差 異, 其 結 果 為 鏈 球 菌 對 amoxicillin (0.7%,1/157) cloxacillin (4.5%,7/157) cefazolin (1.9%,3/157) cefuroxime (0.7%,1/157) 和 ceftiofur (1.9%,3/157) 之 抗 藥 性 結 果 呈 現 皆 無 統 計 學 上 的 差 異 而 penicillin (17.2%,27/157,) 與 ampicillin (22.9%,36/157) 抗 藥 性 結 果 經 統 計 分 析 後 皆 與 amoxicillin (0.7%,1/157) cloxacillin (4.5%,7/157) cefazolin (1.9%,3/157) cefuroxime (0.7%,1/157) 和 ceftiofur (1.9%,3/157) 有 統 計 學 上 顯 著 的 差 異 (P<0.05) 36

47 二 乙 內 醯 胺 類 (β-lactam) 抗 生 素 抗 藥 性 之 分 型 本 實 驗 選 用 皆 屬 乙 內 醯 胺 類 (β-lactam) 的 抗 生 素, 如 青 黴 素 類 (penicillins) 和 頭 孢 子 素 類 (cephalosporins) 的 7 種 抗 生 素 ;penicillin (P10) ampicillin (AMP10) amoxicillin (AML25) cloxacillin (OB5) cefazolin (KZ30) cefuroxime (CXM30) 及 ceftiofur (EFT30), 將 鏈 球 菌 對 於 藥 物 之 抗 藥 性 型 態 分 佈 作 成 Table 5, 共 有 12 種 的 抗 藥 性 型 態 分 型, 而 以 第 1 型 對 7 種 乙 內 醯 胺 (β-lactam) 類 抗 生 素 皆 無 抗 藥 性 所 佔 之 比 例 為 最 高 (71.4%,112 /157), 其 次 為 第 5 型 (11.0%,17/157; 對 penicillin 及 ampicillin 具 有 抗 藥 性 ), 再 之 為 第 3 型 (8.3%,13/157 ; 只 對 ampicillin 具 有 抗 藥 性 ) 三 四 環 類 (tetracyclines) 及 胺 基 配 醣 體 (aminoglycosides) 抗 生 素 之 抗 藥 性 鏈 球 菌 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 測 試 藥 物 中 有 2 種 屬 於 四 環 素 類 抗 生 素 的 藥 物 為 oxytetracycline 和 tetracycline 及 4 種 屬 於 胺 基 配 醣 體 的 藥 物 為 amikacin kanamycin streptomycin 及 neomycin 藥 敏 結 果 呈 現 鏈 球 菌 對 四 環 素 類 抗 生 素 及 胺 基 配 醣 體 類 抗 生 素 均 呈 現 出 高 度 的 抗 藥 性 比 例,oxytetracycline (85.4%, 134/157) 及 tetracycline (85.4%,134/157); 對 amikacin (98.7%,155/157) kanamycin (98.7%,155/157) streptomycin (98.7%,155/157) 及 neomycin (98.0%, 154/157) 更 是 呈 現 出 極 高 的 抗 藥 性 比 例 鏈 球 菌 對 四 環 素 類 抗 生 素 及 胺 基 配 醣 體 類 抗 生 素 之 抗 藥 性 百 分 比 圖 詳 見 於 Fig. 9 將 oxytetracycline tetracycline amikacin kanamycin streptomycin 及 neomycin 之 抗 藥 性 結 果 經 統 計 分 析 後 無 顯 著 差 異 四 其 他 類 抗 生 素 本 實 驗 之 157 株 鏈 球 菌 於 抗 生 素 敏 感 性 實 驗 結 果 顯 示 對 於 bacitracin 抗 藥 性 比 例 (3.2%,5/157) 較 低 實 驗 之 157 株 鏈 球 菌 對 於 chloramphenicol 之 抗 藥 性 比 例 偏 低 (2.5%, 4/157), 但 是 介 於 抗 藥 性 與 敏 感 性 之 間 的 中 間 性 (intermediate) 的 比 例 (23.0%,36/157) 卻 是 所 有 測 試 藥 物 中 最 高 的 鏈 球 菌 對 於 lincomycin 的 抗 藥 性 (75.8%,119/157) 比 例 偏 高 五 牛 隻 乳 房 炎 軟 膏 抗 生 素 藥 物 之 比 較 將 從 乳 汁 樣 本 分 離 出 之 鏈 球 菌 對 於 台 灣 市 售 乳 房 炎 軟 膏 內 含 的 抗 生 素 藥 37

48 物 之 敏 感 性 試 驗 結 果 來 比 較 鏈 球 菌 對 其 之 抗 藥 性 程 度, 其 抗 生 素 種 類 有 屬 於 四 環 素 類 的 tetracycline oxytetracycline, 胺 基 配 醣 體 類 的 neomycin 青 黴 素 類 的 ampicillin cloxacillin, 頭 孢 子 素 類 的 cefuroxime, 以 及 bacitracin 根 據 本 實 驗 之 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 結 果 顯 示 鏈 球 菌 對 其 藥 物 之 抗 藥 性 比 例 為 : tetracycline (85.4%,134/157) oxytetracycline (85.4%,134/157) neomycin (98.0%,154/157) ampicillin (22.9%,36/157) cloxacillin (4.5%,7/157) cefuroxime (0.7%,1/157) 和 bacitracin (3.2%,5/157) 將 鏈 球 菌 之 抗 藥 性 相 對 較 高 的 tetracycline (85.4%,134/157) oxytetracycline (85.4%,134/157) 及 neomycin (98.0%,154/157) 經 由 統 計 分 析 其 結 果 顯 示 鏈 球 菌 對 此 三 種 藥 物 之 抗 藥 性 彼 此 間 無 統 計 上 的 差 異 而 將 鏈 球 菌 抗 藥 性 較 低 之 cloxacillin (4.5%, 7/157) cefuroxime (0.7%,1/157) 和 bacitracin (3.2%,5/157) 經 由 統 計 分 析 後 其 結 果 無 統 計 學 上 的 差 異 ampicillin (22.9%,36/157) 與 抗 藥 性 較 高 組 藥 物 (oxytetracycline tetracycline 及 neomycin) 及 抗 藥 性 較 低 組 藥 物 (cloxacillin cefuroxime 及 bacitracin) 進 行 統 計 學 分 析, 其 結 果 皆 具 有 統 計 學 上 顯 著 的 差 異 (P<0.05), 如 Fig. 10 及 Fig.11 38

49 Table 5. Number of streptococci resistant to β-lactam antimicrobials patterns in this study. All strains (n=157) Antimicrobial agents* Type NO. strain (%) P AMP AML KZ CXM EFT OB (71.4%) S S S S S S S 2 4 (2.5%) R S S S S S S 3 13 (8.3%) S R S S S S S 4 3 (1.9%) S S S S S S R 5 17 (11.0%) R R S S S S S 6 1 (0.6) S R S S S S R 7 2 (1.3%) R S S R S S S 8 1 (0.6%) R R R S S S S 9 1 (0.6%) R R S S S R S 10 1 (0.6%) S R S S S R R 11 1 (0.6%) R R S S S R R 12 1 (0.6%) R R S R R S R * : P, penicillin; AMP, ampicillin; AML, amoxicillin; KZ, cefazolin; CXM, cefuroxime; EFT, ceftiofur; OB, cloxacillin. 39

50 A. B. Antibiotic resistance % a 17.2% b b 0.7% 4.5% P10 AML25 OB5 Antimicrobial agents * Antibiotic resistance % a 22.9% b b 0.7% 4.5% AMP10 AML25 OB5 Antimicrobial agents * Fig. 7 Proportion (%) of the penicillins resistance in streptococcal strains (n=157). Significant difference between a and b (P<0.05). * : P10, penicillin; AML25, amoxicillin; AMP10, ampicillin; OB5, cloxacillin. Antibiotic resistance % % 0.7% 1.9% KZ30 CXM30 EFT30 Antimicrobial agents * Fig. 8 Proportion (%) of the cephalosporins resistance in streptococcal strains (n=157). * : KZ, cefazolin; CXM, cefuroxime; EFT, ceftiofur. 40

51 Antibiotic resistance % % 85.4% 98.7% 98.7% 98.0% 98.7% OT30 TE30 AK30 K30 N30 S10 Antimicrobial agents * Fig. 9 Proportion (%) of the tetracyclines and the aminoglycosides resistance in streptococcal strains (n=157). * : OT30, oxytetracycline; TE30, tetracycline; AK30, amikacin; K30, kanamycin; N30, neomycin; S10, streptomycin. Antibiotic resistance % a 22.9% b 85.4% 85.4% 98.0% AMP10 OT30 TE30 N30 Antimicrobial agents * b b Fig. 10 Proportion (%) of ampicillin, oxytetracycline, tetracycline and neomycin resistance in streptococcal strains (n=157). Significant difference between a and b (P<0.05). * : AMP10, ampicillin; OT30, oxytetracycline; N30, neomycin; TE30, tetracycline. 41

52 Antibiotiv resistance % a 22.9% b b b 4.5% 0.7% 3.2% AMP10 OB5 CXM30 B10 Antimicrobial agents * Fig. 11 Proportion (%) of ampicillin, cloxacillin, cefuroxime and bacitracin resistance in streptococcal strains (n=157). Significant difference between a and b (P<0.05). * : AMP10, ampicillin; OB5, cloxacillin; CXM30, cefuroxime; B10, bacitracin. 42

53 第 四 節 地 理 位 置 之 菌 種 分 部 及 抗 藥 性 結 果 統 計 一 鏈 球 菌 菌 種 之 地 理 分 佈 本 實 驗 的 157 株 鏈 球 菌 來 自 台 灣 各 地 區 共 計 30 個 牧 場 (Fig. 12), 依 據 生 乳 樣 本 收 集 來 源 的 乳 牛 場 之 地 理 位 置 分 為 北 中 南 和 東 部 四 個 地 理 區 域, 北 部 包 括 台 北 市 新 竹 和 苗 栗 共 3 個 乳 牛 牧 場, 中 部 為 台 中 市 彰 化 及 南 投 共 計 3 個 乳 牛 牧 場, 南 部 為 雲 林 嘉 義 台 南 及 屏 東 共 計 18 個 乳 牛 牧 場, 東 部 花 蓮 共 計 5 個 乳 牛 牧 場 其 中 S. uberis 有 7 株 來 自 北 部 乳 牛 場,17 株 來 自 中 部,82 株 來 自 南 部,10 株 來 自 於 東 部 S. bovis 及 S. dysgalactiae 皆 來 自 台 灣 各 牧 場, 而 S. agalactiae 皆 來 自 南 部 的 同 一 個 牧 場 各 牧 場 收 集 的 鏈 球 菌 經 鑑 定 後 其 菌 種 詳 列 於 Table 6 Fig. 12 Bovine milk samples collected from 30 dairy farms examined in this study. 43

54 Table 6. Distribution of dairy farms and numbers of streptococci isolated from milk samples. No. of No. of Streptococcus species. Part of Farm County streptotocci Taiwan S. uberis S. bovis S. dysgalactiae S. agalactiae S. equinus S. mitis isolates (%) Northern A Taipei 5/ B Hsinchu C Miaoli 3/ Central D Taichung 5/ E Changhua 9/ F Changhua 2/ G Nantou 7/ Southern H Yunlin 16/ I Yunlin 4/ J Yunlin 9/ K Chiayi 22/ L Tainan 2/ M Tainan 7/ N Tainan 17/ O Tainan 2/ P Tainan 1/

55 Table 6. Distribution of dairy farms and numbers of streptococci isolated from milk samples. No. of No. of Streptococcus species. Part of Farm County streptotocci Taiwan S. uberis S. bovis S. dysgalactiae S. agalactiae S. equinus S. mitis isolates (%) Southern Q Tainan 1/ R Tainan 1/ S Tainan 2/ T Tainan 7/ U Tainan 1/ V Tainan 2/ W Tainan 1/ X Tainan 7/ Y Pingtung 11/ Eastern ZA Hualien 5/ ZB Hualien 2/ ZC Hualien 2/ ZD Hualien ZE Hualien 4/

56 二 鏈 球 菌 抗 藥 性 表 現 於 地 理 位 置 的 分 佈 實 驗 收 集 之 鏈 球 菌 菌 種 與 臺 灣 地 理 位 置 分 佈 相 互 比 較 發 現 於 北 部 中 部 南 部 及 東 部 的 乳 牛 場 皆 鑑 定 出 S. uberis, 並 以 此 菌 種 的 盛 行 率 最 高 (Table 6) 鏈 球 菌 菌 種 中 以 S. uberis 對 於 乙 內 醯 胺 類 (β-lactam) 抗 生 素 的 penicillin 及 ampicillin 相 較 於 amoxicillin cloxacillin cefazolin cefuroxime 及 ceftiofur 之 抗 生 素 呈 現 較 高 的 抗 藥 性, 具 有 統 計 學 上 顯 著 的 差 異 (P<0.05) 針 對 S. uberis 對 於 penicillin 及 ampicillin 具 有 抗 藥 性 的 菌 種 與 台 灣 地 理 分 佈 相 互 比 對 結 果, 其 中 以 從 南 部 地 區 乳 牛 場 所 分 離 出 之 鏈 球 菌 對 於 penicillin (25.6%) 及 ampicillin (32.9%) 的 抗 藥 性 較 其 它 地 區 高, 詳 見 Table 7 及 Fig. 13 三 鏈 球 菌 抗 藥 性 表 現 於 不 同 地 區 乳 牛 場 分 佈 蒐 集 於 臺 灣 北 中 南 及 東 部 共 計 30 個 牧 場 (Fig. 12 及 Table 7) 之 116 株 S. uberis 中, 共 有 27 株 (22.4%) 對 於 penicillin 及 34 株 (29.3%) 對 ampicillin 具 有 抗 藥 性, 而 於 之 中 有 21 株 (18.1%) 菌 是 同 時 對 於 penicillin 及 ampicillin 具 有 抗 藥 性 依 據 本 實 驗 之 藥 物 敏 感 性 試 驗 結 果 顯 示 共 有 40 株 對 於 penicillin 或 ampicillin 具 有 抗 藥 性, 其 40 株 S. uberis 分 別 來 自 15 個 乳 牛 場 以 臺 灣 中 部 及 南 部 地 區 的 乳 牛 牧 場 之 S. uberis 檢 測 出 較 多 對 於 penicillin 或 ampicillin 具 有 抗 藥 性 本 實 驗 中 由 5 個 乳 牛 場 (D,E,K,N 及 T) 分 離 出 的 S. uberis 對 penicillin 或 ampicillin 具 有 抗 藥 性 比 例 為 D (60%,3/5) E (33.3%,2/6) K (47.6%,10/21) N (35.7%,5/14) 及 T (80%,4/5), 此 5 個 乳 牛 牧 場 分 布 於 臺 灣 4 個 地 理 區 域, 包 括 台 中 彰 化 嘉 義 及 台 南 檢 測 出 較 多 對 於 penicillin 或 ampicillin 具 有 抗 藥 性 的 S. uberis (n 5), 其 他 的 乳 牛 場 的 樣 本 數 比 較 少, 故 相 互 比 較 較 無 意 義 相 對 於 S. uberis, 其 他 菌 種 S. bovis,s. dysgalactiae,s. agalactiae,s. quines 及 S. mistis 於 每 個 乳 牛 牧 場 檢 測 出 之 比 列 較 少, 故 其 比 較 意 義 不 大 157 株 鏈 球 菌 中, 依 照 鏈 球 菌 對 本 實 驗 抗 生 素 敏 感 性 實 驗 的 16 種 藥 物 之 抗 藥 性 可 分 為 30 種 抗 藥 型 態, 如 Table 4 及 Fig. 14 抗 藥 性 型 態 最 常 被 觀 察 到 為 對 7 種 抗 生 素 (amikacin kanamycin neomycin streptomycin oxytetracycline tetracycline 及 lincomycin) 的 抗 藥 性 型 態 比 例 最 高 (45.9%, 72/157), 其 次 為 對 8 種 (10.2%,16/157),9 種 (8.9%,14/157) 10 種 (4.4%, 7/157) 及 11 種 (1.3%,2/157) 抗 生 素 具 有 抗 藥 性 本 實 驗 使 用 16 種 抗 生 素 藥 物 敏 感 應 試 驗 結 果, 對 於 包 含 8 種 或 以 上 具 有 抗 藥 性 的 菌 株 共 有 39 株 (24.8%, 39/157), 其 地 理 位 置 分 部 北 部 地 區 分 離 出 3 株 (7.7%,3/39), 中 部 地 區 有 3 株 46

57 (7.7%,3/39), 南 部 地 區 32 株 (82.0%,32/39) 及 東 部 地 區 有 1 株 (2.6%,3/39) 抗 藥 性 程 度 最 高 為 對 11 種 藥 物 具 有 抗 藥 性, 共 有 2 株 鏈 球 菌, 分 佈 於 臺 灣 南 部 的 台 南 兩 個 乳 牛 牧 場 其 次 為 對 10 種 抗 生 素 具 有 抗 藥 性 共 有 7 株 菌, 地 理 位 置 分 佈 於 臺 灣 北 部 1 株 及 南 部 6 株 對 9 種 抗 生 素 具 有 抗 藥 性 共 有 14 株 菌, 分 佈 於 臺 灣 中 部 乳 牛 場 有 2 株, 南 部 有 11 株 及 東 部 1 株 對 8 種 抗 生 素 具 有 抗 藥 性 之 鏈 球 菌 共 有 16 株, 分 佈 於 臺 灣 北 部 乳 牛 牧 場 有 2 株, 中 部 乳 牛 場 有 1 株 及 南 部 乳 牛 場 有 13 株 由 臺 灣 南 部 乳 牛 場 分 離 出 的 鏈 球 菌 同 時 對 多 種 藥 物 之 抗 藥 性 程 度 相 對 於 臺 灣 北 部 中 部 及 東 部 地 區 的 乳 牛 場 是 高 的, 之 中 又 以 台 南 地 區 的 N 及 X 乳 牛 牧 場 及 嘉 義 的 K 乳 牛 場 分 離 出 之 鏈 球 菌 對 多 種 抗 生 素 的 抗 藥 性 比 例 高 47

58 Table 7. Distribution of S. uberis of penicillin and ampicillin resistance in Taiwan (n=116). NO. of penicillin ampicillin penicillin and ampicillin S. uberis resistance (%) resistance (%) resistance (%) Northern 7 1 (14.3%) 2 (28.6%) 0 (0%) Central 17 4 (23.5%) 4 (23.5%) 3 (17.6%) Southern (25.6%) 27 (32.9%) 18 (22%) Eastern 10 0 (0%) 1 (10%) 0 (0%) Total Antibiotic resistance % Penicillin resistance Ampicillin resistance Penicillin and Ampicillin resistance 0 Northern Central Southern Eastern Fig. 13 Proportion (%) of S. uberis of penicillin and ampicillin resistance in Taiwan (n=116). Percentage of strains % R2 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 Resistance pattern a Fig. 14 Resistant pattern of streptococci in this study (n=157). a : R2-R11, number of resistant to antimicrobial agents. 48

59 第 五 章 討 論 一 鏈 球 菌 之 分 離 及 鑑 定 結 果 乳 牛 乳 房 炎 對 於 牛 隻 及 乳 品 行 業 的 經 濟 成 本 影 響 很 大 且 重 要, 因 乳 房 炎 會 導 致 牛 乳 的 品 質 下 降, 影 響 生 乳 的 價 格, 廢 棄 奶 量 的 增 加, 或 是 造 成 牛 隻 過 早 的 被 淘 汰 撲 殺, 提 高 牛 隻 的 死 亡 風 險, 以 及 會 造 成 獸 醫 及 勞 動 成 本 提 高 及 增 加 使 用 抗 生 素 藥 物 的 頻 率 ; 於 澳 洲 及 美 國 因 為 乳 房 炎 的 問 題, 每 年 損 失 約 莫 1.3 億 至 2 億 美 元 (Petzer et al., 2009; Shum et al., 2009) 許 多 微 生 物 皆 可 能 是 引 起 乳 牛 乳 房 炎 症 狀 之 因 素, 包 括 革 蘭 氏 陰 性 菌 革 蘭 氏 陽 性 菌, 黴 漿 菌 和 藻 類 ; 根 據 國 外 的 文 獻 指 出, 細 菌 性 的 乳 房 炎 為 最 主 要 成 因, 其 中 又 以 葡 萄 球 菌 屬 鏈 球 菌 屬 及 大 腸 桿 菌 群 為 最 常 致 病 之 菌 屬 (Bal et al., 2002; Petrovski et al., 2011 ) 然 而 在 臺 灣 相 關 的 研 究 少, 根 據 杜 (2010) 及 蔡 (2010) 的 研 究 指 出, 造 成 乳 房 炎 菌 種 以 革 蘭 氏 陽 性 菌 的 葡 萄 球 菌 及 鏈 球 菌 為 主 要, 腸 球 菌 則 較 少 ( 曾, 2011) 本 實 驗 的 鏈 球 菌 菌 株 樣 本 均 從 乳 牛 的 生 乳 採 樣, 以 無 菌 操 作 的 方 式 將 乳 汁 劃 於 血 液 瓊 脂 培 養 基 上, 恆 溫 37 培 養 小 時 後, 依 據 菌 落 的 外 觀 初 步 先 將 疑 似 為 鏈 球 菌 的 菌 株 挑 選 起 來, 再 經 由 鏈 球 菌 選 擇 性 培 養 基 (Edwards agar plate) 培 養 篩 選 後, 最 後 以 API 20 Strept 進 行 細 菌 菌 種 的 鑑 定 菌 種 鑑 定 結 果 中, 分 離 率 最 高 的 菌 種 為 S. uberis (73.9%,116/157), 其 次 為 S. bovis (10.2%, 16/157) S. dysgalactiae (10.2%,16/157) S. agalactiae (3.8%,6/157) S. equines (1.3%,2/157) 及 S. mistis (0.6%,1/157) 本 次 鏈 球 菌 菌 種 分 離 的 結 果 與 德 國 紐 西 蘭 澳 洲 及 愛 沙 尼 亞 相 似, 其 鏈 球 菌 菌 種 檢 測 結 果 皆 以 S. uberis 為 主 要 的 細 菌 (Tenhagen et al., 2006; Petrovski et al., 2009; Shum et al., 2009; Kalmus et al., 2011; Petrovski et al., 2011) 而 有 文 獻 報 導 美 國 加 州 中 部 的 乳 牛 場 檢 測 生 乳 病 原 菌 之 鏈 球 菌 分 離 的 結 果, 是 以 S. dysgalactiae 為 主 要 的 盛 行 菌 (Rossitto et al., 2002) 根 據 上 述 的 結 果, 雖 然 很 多 文 獻 都 指 出 由 鏈 球 菌 所 造 成 的 乳 房 炎 其 致 病 菌 種 都 導 向 是 乳 房 鏈 球 菌 (S. uberis), 本 研 究 鑑 定 出 來 之 菌 種 結 果 也 符 合 許 多 文 獻 菌 種 鑑 定 的 結 果, 但 推 測 有 可 能 會 因 為 地 區 的 差 異 而 導 致 各 實 驗 室 鑑 定 出 的 主 要 致 病 菌 種 結 果 不 同 相 較 於 過 去 15 至 20 年 間, 各 國 對 於 鏈 球 菌 導 致 乳 房 炎 之 菌 種 的 分 離 結 果 有 很 大 的 改 變, 由 原 本 是 以 傳 染 性 病 原 菌 的 無 乳 鏈 球 菌 (S. agalactiae) 為 最 主 要 的 致 病 菌, 而 於 最 近 的 文 獻 指 出, 目 前 培 養 49

60 分 離 出 來 之 鏈 球 菌 菌 種 大 多 以 乳 房 鏈 球 菌 (S. uberis) 為 主 要 推 測 如 此 的 改 變 之 原 因 為 全 球 大 部 分 的 乳 品 行 業 實 施 乳 房 炎 監 控 策 略 之 成 效 (Bradley, 2002) 本 實 驗 之 菌 種 以 API 20 Strept 進 行 細 菌 菌 種 的 鑑 定, 雖 然 細 菌 鑑 定 前 會 經 過 鏈 球 菌 的 選 擇 性 培 養 基 (Modified Edwards Medium with 5% bovine washed erythrocyte) 培 養 篩 選, 但 鑑 定 結 果 除 了 157 株 確 定 為 鏈 球 菌 外, 仍 有 28 株 不 為 鏈 球 菌 屬, 有 21 株 的 Aerococcus viridans,2 株 的 Aerococcus urinae,2 株 的 Enterococcus durans,1 株 的 Enterococcus faecium,1 株 Enterococcus faecalis 及 1 株 的 Lactococcus lactis spp., 其 這 些 菌 株 之 生 化 特 性 跟 鏈 球 菌 相 似, 皆 為 可 以 水 解 aesculin 觸 酶 (catalase) 陰 性 的 革 蘭 氏 陽 性 球 菌, 故 無 法 利 用 選 擇 性 培 養 基 將 其 菌 種 篩 選 掉 (Devriese et al 1999; Tohno et al., 2014) 鏈 球 菌 根 據 其 菌 種 的 不 同, 可 在 血 液 瓊 脂 培 養 基 上 觀 察 到 菌 落 週 圍 的 溶 血 特 性 也 不 相 同 有 不 完 全 溶 血 (α-hemolysis) 完 全 溶 血 (β-hemolysis) 或 不 溶 血 (γ-hemolysis) 的 特 性 B 族 的 無 乳 鏈 球 菌 (S. agalactiae) 與 A 族 的 化 膿 性 鏈 球 菌 (S. pyogenes) 皆 為 具 有 完 全 溶 血 (β-hemolysis) 的 特 性, 於 血 液 瓊 脂 培 養 基 上 不 易 區 分,CAMP 試 驗 為 利 用 B 族 S. agalactiae 會 與 金 黃 色 葡 萄 球 菌 產 生 半 月 型 或 是 三 角 型 的 共 同 溶 血 之 特 性 來 檢 測, 此 項 檢 驗 方 法 是 可 以 準 確 來 判 定 (Facklam, 2002; Guélat-Brechbuehl et al., 2010) 本 實 驗 由 乳 牛 生 乳 中 分 離 出 的 6 株 具 有 完 全 溶 血 的 鏈 球 菌 經 CAMP 測 試 後 皆 與 金 黃 色 葡 萄 球 菌 產 生 共 同 溶 血 的 表 現, 而 S. uberis S. bovis S. dysgalactiae 及 S. equines 皆 與 金 黃 色 葡 萄 球 菌 無 反 應, 與 上 述 文 獻 的 結 果 和 本 研 究 利 用 API 20 Strept 鑑 定 結 果 為 相 符 合 本 次 實 驗 依 據 Lancefield 分 類 法 (Lancefield, 1933; Facklam, 2002) 利 用 商 業 化 的 鑑 定 套 組 (Oxoid Dryspot Streptococcal Grouping Kit) 來 將 鏈 球 菌 分 族 並 與 API 20 Strept 鑑 定 菌 種 的 結 果 相 互 比 較 其 鏈 球 菌 特 異 性 多 醣 類 抗 原 抗 體 凝 集 反 應 試 驗 結 果 未 有 A 族 鏈 球 菌 與 API 20 Strept 未 鑑 定 出 相 關 之 菌 種 結 果 相 符 B 族 鏈 球 菌 共 有 6 株 菌 具 有 凝 集 反 應, 與 API 20 Strept 鑑 定 出 之 6 株 菌 種 為 S. agalactiae 及 與 CAMP 試 驗 結 果 相 同 C 族 鏈 球 菌 檢 測 結 果 共 有 16 株 與 API 20 Strept 鑑 定 出 之 16 株 菌 種 為 S. dysgalactiae 結 果 一 致 於 D 族 的 抗 原 抗 體 凝 集 反 應 共 有 15 株 鏈 球 菌, 包 含 2 株 API 20 Strept 鑑 定 為 S. equines 及 13 株 的 S. bovis F 族 未 有 鏈 球 菌 有 抗 原 抗 體 凝 集 反 應 與 API 20 Strept 鑑 定 結 果 相 同 G 族 鏈 球 菌 有 1 株 菌 具 有 凝 集 反 應, 其 此 菌 在 API 20 Strept 鑑 定 結 果 為 S. bovis, 相 互 比 較 其 結 果 不 一 致 而 抗 原 抗 體 無 凝 集 反 應 共 有 119 株 菌, 包 含 API 20 Strept 鑑 定 為 S. uberis 共 有 116 株 2 株 的 S. bovis 和 1 株 的 S. mitis, 在 血 清 抗 原 抗 體 反 50

61 應 中 皆 無 凝 集,2 株 的 S. bovis 在 抗 原 抗 體 反 應 試 驗 結 果 與 API 20 Strept 鑑 定 結 果 為 不 相 同 的, 而 所 有 的 S. uberis 與 S. mitis 於 兩 種 檢 測 下 結 果 相 互 符 合 根 據 結 果 發 現 對 於 從 乳 牛 生 乳 中 分 離 所 得 的 S. bovis 於 API 20 Strept 的 鑑 定 與 鏈 球 菌 血 清 抗 原 抗 體 試 驗 中 結 果 並 未 完 全 相 符, 而 文 獻 (Poutrel and Ryniewicz, 1984) 也 指 出 API 20 Strept 對 於 S. bovis 鑑 定 準 確 性 不 高, 可 以 利 用 其 他 鑑 定 方 法 如 Biolog 或 Vitek 2 再 予 以 鑑 定 由 上 述 結 果 可 知, 本 次 實 驗 利 用 實 驗 室 常 規 的 檢 測 方 法 對 蒐 集 的 鏈 球 菌 進 行 分 離 及 鑑 定, 根 據 菌 落 的 外 觀 及 溶 血 型 態 做 初 步 的 篩 選, 再 經 革 蘭 氏 染 色 觸 酶 試 驗 鏈 球 菌 的 選 擇 性 培 養 基 篩 選 CAMP 試 驗 鏈 球 菌 Lancefield 血 清 抗 原 抗 體 凝 集 反 應 測 試 及 API 20 Strept 進 行 細 菌 菌 種 的 鑑 定, 與 許 多 文 獻 對 於 從 乳 汁 樣 本 分 離 鑑 定 鏈 球 菌 的 方 法 一 致 (Fortin et al., 2003) 二 鏈 球 菌 抗 藥 性 結 果 探 討 本 研 究 利 用 6 大 種 類 的 藥 物 類 別 共 計 16 種 抗 生 素 藥 物 來 對 從 乳 汁 樣 本 分 離 出 的 157 株 鏈 球 菌 做 藥 物 敏 感 性 測 試, 鏈 球 菌 對 於 所 有 的 胺 基 配 醣 體 類 (aminoglycosides) 藥 物 呈 現 出 最 高 的 抗 藥 性 比 例 為 amikacin (97.8%) kanamycin (97.8%) streptomycin (97.8%) 及 neomycin (98.0%), 其 次 依 序 為 oxytetracycline (85.4%) tetracycline (85.4%) 和 lincomycin (75.8%); 而 抗 藥 性 出 現 率 最 低 的 抗 生 素 有 amoxicillin (0.7%) cefuroxime (0.7%) cefazolin (1.9%) ceftiofur (1.9%) chloramphenicol (2.5%) bacitracin (3.2%) cloxacillin (4.5%), 再 其 次 為 penicillin (17.2%) 和 ampicillin (22.9%) 其 結 果 與 Ma 等 人 (2006) 由 生 乳 中 分 離 出 的 鏈 球 菌 菌 株 相 互 比 較, 本 研 究 檢 測 的 鏈 球 菌 菌 株 對 於 penicillin 及 oxytetracycline 的 抗 藥 性 表 現 是 較 高 的, 而 對 於 chloramphenicol 的 抗 藥 性 程 度 為 較 相 似 (2.5% v.s 1.9%) 與 其 他 國 家 的 研 究 結 果 相 互 比 較,Rato 等 人 (2013) 在 丹 麥 於 11 個 牧 場 從 具 有 次 臨 床 乳 房 炎 乳 牛 蒐 集 生 乳 樣 本 培 養 後 分 離 出 的 鏈 球 菌, 對 其 進 行 藥 物 敏 感 性 試 驗, 其 抗 藥 性 結 果 以 streptomycin (97.2%) 為 最 高, 其 次 為 gentamicin (80.6%) 及 tetracycline (64.8%); 與 本 實 驗 抗 藥 性 的 趨 勢 基 本 上 相 似, 除 了 penicillin 在 本 研 究 中 抗 藥 性 的 比 例 是 偏 高 的 Nam 等 人 (2009) 於 韓 國 從 乳 牛 乳 汁 樣 本 分 離 出 的 鏈 球 菌 研 究 其 抗 藥 性 表 現, 檢 測 的 178 株 鏈 球 菌 對 於 tetracycline (61.2%) 呈 現 最 高 的 抗 藥 性 結 果, 其 次 為 lincomycin (43.2%) 和 gentamicin (35.3%), 而 對 於 penicillin 及 cephalothin 為 最 具 有 藥 物 的 敏 感 性 ; 其 對 藥 物 種 類 的 抗 藥 性 呈 現 與 本 次 研 究 結 果 相 似, 但 對 tetracycline 51

62 lincomycin 抗 藥 性 比 例 卻 較 本 實 驗 結 果 低 於 Rato 等 人 (2013) 及 Nam 等 人 (2009) 的 兩 篇 文 獻 中, 均 提 出 鏈 球 菌 普 遍 對 於 tetracycline 皆 有 較 高 的 抗 藥 性 的 表 現, 兩 作 者 皆 推 測 歸 咎 其 原 因 為 於 所 在 的 國 家 其 四 環 素 類 藥 物 被 廣 泛 大 量 且 長 時 間 的 運 用 於 動 物 治 療 用 藥 上, 因 此 可 能 為 造 成 鏈 球 菌 對 四 環 素 藥 物 具 有 高 的 抗 藥 性 表 現 而 於 臺 灣, 四 環 素 類 藥 物 也 已 長 時 間 且 被 廣 泛 使 用 於 人 類 和 動 物 感 染 的 預 防 和 治 療 上, 另 外, 乳 牛 牧 場 施 打 此 類 針 劑 藥 物 治 療 疾 病 以 及 使 用 含 有 四 環 素 類 軟 膏 治 療 乳 房 炎 情 形 相 當 普 遍, 推 測 在 台 灣 因 為 大 量 廣 泛 的 使 用 四 環 素 類 藥 物 可 能 為 造 成 許 多 細 菌 對 於 此 種 藥 物 產 生 了 抗 藥 性, 與 上 述 兩 篇 文 獻 面 臨 相 同 的 問 題 本 次 研 究 實 驗 的 結 果, 鏈 球 菌 對 於 胺 基 配 醣 體 類 (aminoglycosides) 藥 物 的 敏 感 性 普 遍 低 且 不 佳, 推 測 其 原 因 為 此 類 藥 物 的 殺 菌 作 用 機 制 不 適 合 針 對 於 由 革 蘭 氏 陽 性 菌 所 造 成 之 疾 病 來 做 治 療, 如 ; 本 次 實 驗 研 究 的 鏈 球 菌 菌 株 由 於 胺 基 配 醣 體 類 (aminoglycosides) 藥 物 具 有 極 性 不 易 通 過 陽 性 菌 的 細 胞 壁 而 發 生 作 用 ; 但 此 類 藥 物 於 陰 性 菌 上, 可 以 利 用 陰 性 菌 外 膜 的 通 道 (porin) 擴 散 進 入 細 菌 細 胞 內 作 用 (Adams, 2001; Magnet et al., 2005) Chloramphenicol 於 本 次 實 驗 中 及 Ma 等 人 (2006) 的 研 究 中 均 觀 察 到 鏈 球 菌 對 此 藥 物 具 有 良 好 的 藥 物 感 受 性, 但 因 其 副 作 用 毒 性 大 會 造 成 骨 髓 抑 制 或 再 生 不 良 性 貧 血 (Smilack, 1991), 故 在 臺 灣 美 國 及 法 國 (Guérin-Faublée et al., 2002), 已 將 chloramphenicol 列 為 禁 止 使 用 在 經 濟 動 物 上 之 藥 物 Lincomycin 於 本 次 實 驗 結 果, 鏈 球 菌 對 此 藥 物 的 抗 藥 性 表 現 度 高, 推 測 其 造 成 原 因 為 lincomycin 於 臺 灣 早 期 廣 泛 的 添 加 於 飼 料 中 來 促 進 動 物 的 生 長, 如 預 防 仔 豬 的 下 痢 等, 並 且 也 是 經 濟 動 物, 如 牛 豬 經 常 使 用 的 治 療 細 菌 感 染 的 注 射 液 長 期 且 廣 泛 的 使 用, 推 測 可 能 此 可 能 是 造 成 細 菌 對 此 藥 物 產 生 抗 藥 性 的 成 因 之 一 於 157 株 鏈 球 菌 藥 物 敏 感 性 測 試 的 結 果, 觀 察 到 鏈 球 菌 對 於 屬 於 乙 內 醯 胺 類 (β-lactam) 藥 物 的 青 黴 素 類 抗 生 素 及 頭 孢 子 素 類 抗 生 素 呈 現 出 良 好 的 藥 物 感 受 性,amoxicillin (0.7%) cefuroxime (0.7%) cefazolin (1.9%) ceftiofur (1.9%) 及 cloxacillin (4.5%); 但 對 penicillin (17.2%) 及 ampicillin (22.9%) 的 抗 藥 性 程 度 較 高 根 據 實 驗 結 果 觀 察 到 鏈 球 菌 對 於 同 屬 於 青 黴 素 類 抗 生 素 呈 現 了 不 同 的 抗 藥 性 表 現, 相 較 於 Petrovski 等 人 (2011) 於 紐 西 蘭 的 研 究 結 果 也 出 現 鏈 球 菌 會 對 同 為 青 黴 素 藥 物 的 oxacillin 及 ampicillin 呈 現 出 不 同 的 藥 物 敏 感 性, 分 別 為 93.2% 及 81.7%; 此 外, 實 驗 結 果 也 顯 示 鏈 球 菌 對 於 penicillin 的 感 受 性 較 ampicillin 好, 並 且 大 多 皆 以 S. uberis 為 主 要, 與 本 實 驗 結 果 大 致 相 似 S. uberis 52

63 之 不 同 的 抗 藥 性 結 果, 其 可 能 原 因 為 S. uberis 的 青 黴 素 結 合 蛋 白 經 過 修 飾 後 突 變, 導 至 使 細 菌 對 於 青 黴 素 類 藥 物 的 敏 感 性 程 度 有 不 同 (Haenni et al., 2010); 而 第 二 個 原 因 推 測 為 可 能 與 乳 牛 場 內 的 用 藥 習 慣 有 關 在 臺 灣, 因 ampicillin 為 臺 灣 市 售 乳 房 炎 軟 膏 內 所 含 的 成 分, 而 penicillin 為 注 射 用 的 治 療 針 劑, 這 兩 類 藥 物 被 廣 泛 的 使 用 在 乳 牛 場 裡, 而 當 使 用 這 些 藥 物 來 治 療 患 病 動 物 時, 倘 若 無 依 照 正 確 的 給 藥 日 程 及 劑 量, 是 容 易 造 成 細 菌 產 生 抗 藥 性 的 現 象, 這 可 能 是 造 成 本 實 驗 由 乳 汁 分 離 的 鏈 球 菌 之 抗 藥 性 結 果 呈 現 對 於 ampicillin 及 penicillin 具 有 較 高 的 抗 藥 性 表 現 之 原 因 本 實 驗 共 分 離 出 116 株 的 S. uberis, 其 次 為 16 株 的 S. bovis 16 株 S. dysgalactiae 6 株 S. agalactiae 2 株 S. equines 及 1 株 的 S. mistis 在 抗 生 素 藥 物 敏 感 性 試 驗 結 果, 產 生 抗 藥 性 表 現 程 度 最 高 的 菌 種 以 S. uberis 為 最 主 要, 尤 其 是 對 於 以 乙 醯 胺 類 (β-lactam) 藥 物 的 ampicillin 及 penicillin 此 兩 種 藥 物 的 抗 藥 性 表 現 都 相 對 於 其 他 菌 種 比 較 高, 與 韓 國 與 紐 西 蘭 的 研 究 相 似 (Nam et al., 2009; Petrovski et al., 2011) 本 實 驗 結 果 顯 示 有 除 了 S. uberis, 也 有 其 它 鏈 球 菌 菌 種 對 於 乙 醯 胺 類 (β-lactam) 藥 物 具 有 抗 藥 性 的 表 現, 但 其 比 例 低, 而 於 其 它 國 家 如 德 國 (Tenhagen et al., 2006) 阿 根 廷 (Denamiel et al., 2005) 及 愛 沙 尼 亞 (Kalmus et al., 2011), 在 鏈 球 菌 所 導 致 的 乳 房 炎 用 藥 的 選 擇 仍 然 是 建 議 以 乙 醯 胺 類 (β-lactam) 藥 物 為 優 先 選 擇 本 實 驗 中 分 離 出 的 6 株 S. agalactiae 之 抗 藥 性 結 果 相 較 於 程 (1993) 在 台 灣 所 蒐 集 的 178 株 S. agalactiae 之 抗 藥 性 結 果 的 表 現 發 現 本 實 驗 之 S. agalactiae 對 抗 生 素 藥 物 敏 感 性 試 驗 所 使 用 的 藥 物 之 tetracycline neomycin 及 amikacin 的 抗 藥 性 比 例 tetracycline (100%) neomycin (66.7%) 及 amikacin (66.7%) 是 高 於 程 (1993) 對 蒐 集 的 178 株 S. agalactiae 的 抗 藥 性 比 例 ;tetracycline (34.8%), neomycin (39.9%) 及 amikacin (23.6%) 而 其 它 與 程 (1993) 實 驗 中 使 用 的 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 檢 測 之 相 同 藥 物, 在 本 次 實 驗 均 具 有 敏 感 性 推 測 tetracycline neomycin 及 amikacin 其 可 能 原 因 為 近 20 年 用 藥 習 慣 導 致 無 乳 鏈 球 菌 對 某 些 特 定 的 藥 物 產 生 抗 藥 性 相 較 於 程 (1993) 所 收 集 到 的 178 株 無 乳 鏈 球 菌, 本 實 驗 只 蒐 集 到 6 株 無 乳 鏈 球 菌, 明 顯 較 低 本 研 究 之 116 株 S. uberis 的 抗 藥 性 結 果 相 較 於 由 趙 (1994) 在 臺 灣 針 對 分 離 出 的 76 株 的 S. uberis 其 抗 藥 性 的 表 現 其 結 果 對 於 streptomycin (100% v.s 97.3%) 及 tetracycline (84.5% v.s 78.7%) 呈 現 出 相 似 的 抗 藥 性 表 現 而 本 實 驗 的 S. uberis 對 於 penicillin (22.4%) bacitracin (3.4%) kanamycin (100%) neomycin 53

64 (99.1%) ampicillin (29.3%) 及 chloramphenicol (2.6%) 的 抗 藥 性 均 較 趙 (1994) 實 驗 結 果 penicillin (2.7%) kanamycin (49.3%) neomycin (66.7%) ampicillin (1.3%) 及 chloramphenicol (1.3%) 來 得 高 值 得 關 切 的 是,bacitracin 由 原 本 的 無 抗 藥 性 結 果 至 現 今 已 經 有 抗 藥 性 的 現 象 產 生, 而 S. uberis 對 於 penicillin 及 ampicillin 也 大 幅 度 的 增 加 推 測 其 可 能 的 原 因 為 此 些 藥 物 為 長 期 頻 繁 的 使 用 在 乳 牛 場, 經 年 累 月 後, 鏈 球 菌 對 此 些 藥 物 已 發 展 出 抗 藥 性 機 制 來 抵 抗 藥 物 的 作 用, 結 果 令 人 堪 憂 市 售 乳 房 炎 軟 膏 常 見 的 抗 生 素 藥 物 成 分 有 四 環 素 類 的 tetracycline oxytetracycline, 胺 基 配 醣 體 類 的 neomycin 青 黴 素 類 的 ampicillin cloxacillin, 頭 孢 子 素 類 的 cefuroxime 和 bacitracin 從 乳 汁 樣 本 分 離 出 之 鏈 球 菌 對 其 藥 物 之 抗 藥 性 比 例 為 :tetracycline (85.4%,134/157) oxytetracycline (85.4%,134/157) neomycin (98.0%,154/157) ampicillin (22.9%,36/157) cloxacillin (4.5%,7/157) cefuroxime (0.7%,1/157) 和 bacitracin (3.2%,5/157); 相 較 於 董 (2004) 及 江 (2005) 同 樣 從 乳 汁 樣 本 分 離 出 之 金 黃 色 葡 萄 球 菌 蔡 (2010) 及 余 (2012) 分 離 出 的 大 腸 桿 菌 及 曾 (2011) 分 離 出 腸 球 菌 之 抗 藥 性 結 果, 本 研 究 的 鏈 球 菌 對 於 neomycin tetracycline 及 oxytetracycline 之 抗 藥 性 結 果 比 例 均 是 高 於 董 (2004) 江 (2005) 蔡 (2010), 余 (2012) 及 曾 (2011) 之 實 驗 結 果 推 測 此 三 種 藥 物 用 於 由 鏈 球 菌 感 染 所 造 成 的 乳 房 炎 其 治 療 效 果 較 金 黃 色 葡 萄 球 菌 大 腸 桿 菌 及 腸 球 菌 造 成 乳 房 炎 症 狀 不 佳 三 鏈 球 菌 抗 藥 性 分 型 及 於 臺 灣 各 乳 牛 場 之 盛 行 率 探 討 本 實 驗 由 乳 牛 生 乳 中 分 離 出 共 157 株 鏈 球 菌, 經 藥 物 敏 感 性 試 驗 結 果, 依 照 鏈 球 菌 對 本 實 驗 抗 生 素 的 16 種 藥 物 之 抗 藥 性 表 現, 可 分 為 30 種 抗 藥 型 態, 抗 藥 性 程 度 最 低 的 菌 株 對 所 檢 測 的 16 種 藥 物 之 2 種 抗 生 素 產 生 抗 藥 性, 其 抗 藥 性 型 態 是 非 常 多 樣 化 的 最 常 被 觀 察 到 的 為 同 時 對 7 種 抗 生 素 藥 物, 為 amikacin kanamycin neomycin streptomycin oxytetracycline tetracycline 和 lincomycin 的 藥 物 具 有 抗 藥 性, 佔 44.0% 然 而 抗 藥 性 表 現 程 度 最 高 的 菌 株 為 對 檢 測 的 16 種 藥 物 之 中 的 11 種 藥 物 產 生 抗 藥 性, 共 有 2 株 菌, 而 這 兩 株 菌 為 來 自 不 同 牧 場 所 分 離 出 的, 推 測 其 成 因 可 能 與 乳 牛 場 內 長 期 以 來 使 用 藥 物 的 習 慣 頻 率 及 是 否 選 擇 正 確 的 抗 生 素 藥 物 來 治 療 病 原 菌 有 關 本 實 驗 蒐 集 之 鏈 球 菌 菌 種 與 臺 灣 地 理 位 置 分 佈 相 互 比 較 結 果 中, 發 現 北 部 中 部 南 部 及 東 部 的 乳 牛 場 皆 有 鑑 定 出 S. uberis, 比 傳 染 性 病 原 之 S. 54

65 agalactiae 高 很 多, 推 測 其 可 能 原 因 為 臺 灣 實 施 的 乳 房 炎 監 控 策 略 是 有 所 成 效 的, 大 幅 降 低 了 傳 染 性 病 原 菌 的 傳 染 及 感 染 來 自 南 部 牧 場 之 鏈 球 菌 的 分 離 率 佔 較 高 比 例, 其 原 因 為 在 此 地 理 區, 所 蒐 集 生 乳 樣 本 的 牧 場 數 量 佔 全 部 牧 場 數 的 一 半 以 上, 故 才 會 有 如 此 分 布 不 均 的 情 形 而 從 南 部 地 區 乳 牛 場 所 分 離 出 之 鏈 球 菌 對 於 乙 醯 胺 類 (β-lactam) 藥 物 的 penicillin (25.6%) 及 ampicillin (32.9%) 的 抗 藥 性 較 其 它 地 區 高, 推 測 可 能 跟 牧 場 本 身 的 飼 養 管 理 (Trevisi et al., 2014) 所 導 致 的 用 藥 習 慣 有 關 55

66 第 六 章 總 結 依 據 鏈 球 菌 的 生 理 生 化 特 性 來 做 為 鏈 球 菌 的 鑑 定 方 式 為 較 方 便 快 速 且 為 合 適 正 確 的 選 擇 抗 生 素 藥 物 的 種 類 來 治 療 由 鏈 球 菌 所 導 致 的 乳 房 炎 疾 病 是 非 常 重 要 的, 可 避 免 細 菌 產 生 抗 藥 性 或 藥 物 殘 留 的 問 題 本 實 驗 使 用 16 藥 物 來 檢 測 鏈 球 菌 的 抗 藥 性 程 度, 結 果 顯 示 鏈 球 菌 普 遍 對 於 乙 內 醯 胺 類 藥 物 有 較 好 的 感 受 性, 因 此 在 台 灣, 對 於 鏈 球 菌 所 造 成 的 乳 房 炎 建 議 以 乙 內 醯 胺 類 藥 物 為 優 先 考 慮 使 用 的 治 療 藥 物 種 類 台 灣 目 前 乳 牛 場 使 用 來 治 療 牛 隻 乳 房 炎 軟 膏 內 含 的 成 分 多 以 四 環 素 類 及 乙 內 醯 胺 類 藥 物 為 主 ; 對 於 本 次 實 驗 結 果, 從 牛 隻 生 乳 中 分 離 出 的 鏈 球 菌 對 於 四 環 素 類 藥 物 具 有 高 的 抗 藥 性 (85.4%) 表 現, 但 是 現 在 用 於 治 療 乳 房 炎 上 四 環 素 藥 物 依 舊 普 遍 的 運 用, 其 原 因 歸 咎 為 在 乳 牛 牧 場 的 酪 農 普 遍 較 無 正 確 的 用 藥 資 訊, 且 對 於 細 菌 的 種 類 及 抗 藥 性 認 知 度 不 佳 ; 而 實 驗 室 分 離 出 的 細 菌 之 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 結 果 較 不 易 宣 導 於 在 乳 牛 場 的 酪 農 們, 至 使 現 在 細 菌 高 抗 藥 性 藥 物 仍 被 廣 泛 的 使 用 56

67 參 考 文 獻 程 博 文 本 省 無 乳 鏈 球 菌 的 分 佈 抗 藥 型 態 以 及 特 異 血 清 型 的 研 究 碩 士 論 文 國 立 中 興 大 學 獸 醫 學 研 究 所 臺 中 中 華 民 國 1993 趙 瑞 龍 本 省 中 部 地 區 乳 牛 乳 房 炎 病 原 細 菌 的 種 類 抗 藥 型 態 及 乳 房 鏈 球 菌 之 分 子 流 行 病 學 分 類 研 究 碩 士 論 文 國 立 中 興 大 學 獸 醫 學 研 究 所 臺 中 中 華 民 國 1994 蔡 文 城 微 生 物 學 藝 軒 圖 書 出 版 社 臺 北 中 華 民 國 2002 董 佳 琦 應 用 PCR-RFLP 的 方 法 於 乳 牛 乳 羊 乳 汁 中 金 黃 色 葡 萄 球 菌 分 子 流 行 病 學 之 研 究 碩 士 論 文 國 立 中 興 大 學 獸 醫 學 研 究 所 臺 中 中 華 民 國 2004 江 禎 偉 金 黃 色 葡 萄 球 菌 於 臺 灣 乳 房 炎 牛 隻 抗 藥 性 及 流 行 病 學 分 型 之 研 究 碩 士 論 文 國 立 中 興 大 學 獸 醫 學 研 究 所 臺 中 中 華 民 國 2005 杜 先 覺, 郭 鴻 志, 莊 士 德, 周 濟 眾, 費 昌 勇, 張 紹 光 台 灣 中 南 部 地 區 生 乳 中 潛 在 細 菌 種 類 與 藥 物 感 受 性 之 調 查 台 灣 獸 醫 誌 36: 蔡 哲 宇 台 灣 乳 牛 場 病 原 性 大 腸 桿 菌 抗 藥 性 及 乙 內 醯 胺 酶 基 因 之 研 究 碩 士 論 文. 國 立 中 興 大 學 獸 醫 學 研 究 所 臺 中 中 華 民 國 2010 曾 惠 玲 臺 灣 乳 牛 場 腸 球 菌 抗 藥 性 表 現 及 以 多 重 引 子 聚 合 酶 鏈 鎖 反 應 檢 測 四 環 素 抗 藥 性 基 因 之 研 究 碩 士 論 文 國 立 中 興 大 學 獸 醫 學 研 究 所 臺 中 中 華 民 國 2011 余 燦 百 臺 灣 乳 牛 場 大 腸 桿 菌 抗 藥 性 及 四 環 素 抗 藥 性 基 因 盛 行 率 之 調 查 碩 士 論 文 國 立 中 興 大 學 獸 醫 學 研 究 所 臺 中 中 華 民 國 2012 Aarestrup FM. Monitoring of antimicrobial resistance among food animals: principles and limitations. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health 51: ,

68 Adams HR. Veterinary pharmacology and therapeutics. 8 th ed. A Blackwell Publishing Company, Iowa, U.S.A., Aminov RI, Garrigues-Jeanjean N, Mackie RI. Molecular ecology of tetracycline resistance: development and validation of primers for detection of tetracycline resistance genes encoding ribosomal protection proteins. Appl Environ Microbiol 67: 22-32, Bal EB, Bayar S, Bal MA. Antimicrobial susceptibilities of coagulase-negative staphylococci (CNS) and streptococci from bovine subclinical mastitis cases. J Microbiol 48: , Baltimore RS. Pathogenesis of neonatal group B streptococcal infections. Yale J Biol Med 55: , Bang RL, Gang RK, Sanyal SC, Mokaddas EM, Lari AR. Beta-haemolytic Streptococcus infection in burns. Burns 25: , Bar D, Tauer LW, Bennett G, González RN, Hertl JA, Schukken YH, Schulte HF, Welcome FL, Gröhn YT. The cost of generic clinical mastitis in dairy cow as estimated by using dynamic programming. J Dairy Sci 91: , Bhakdi S, Tranum-Jensen J, Sziegoleit A. Mechanism of membrane damage by streptolysin-o. Infect Immun 47: 52-60, Bisharat N, Crook DW, Leigh J, Harding RM, Ward PN, Coffey TJ, Maiden MC, Peto T, Jones N. Hyperinvasive neonatal group B Streptococcus has arisen from a bovine ancestor. J Clin Microbiol 42: , 2004 Botrel MA, Haenni M, Morignat E, Sulpice P, Madec JY, Calavas D. Distribution and antimicrobial resistance of clinical and subclinical mastitis pathogens in dairy cows in Rhône-Alpes, France. Foodborne Pathog Dis 7: ,

69 Bradley A. Bovine mastitis: an evolving disease. Vet J 164: , Brochet M, Couvé E, Zouine M, Vallaeys T, Rusniok C, Lamy MC, Buchrieser C, Trieu-Cuot P, Kunst F, Poyart C, Glaser P. Genomic diversity and evolution within the species Streptococcus agalactiae. Microbes Infect 8: , Chopra I, Roberts M. Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance. Microbiol Mol Biol Rev 65: , Clausell A1, Pujol M, Alsina MA, Cajal Y. Influence of polymyxins on the structural dynamics of Escherichia coli lipid membranes. Talanta 60: , Courvalin P, Ounissi H, Arthur M. Multiplicity of macrolide-lincosamide-streptogramin antibiotic resistance determinants. J Antimicrob Chemother 16: , Cunningham MW. Pathogenesis of group A streptococcal infections. Clin Microbiol Rev 13: , De Francesco MA, Caracciolo S, Gargiulo F, Manca N. Phenotypes, genotypes, serotypes and molecular epidemiology of erythromycin-resistant Streptococcus agalactiae in Italy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 31: , Denamiel G, Llorente P, Carabella M, Rebuelto M, Gentilini E. Antimicrobial susceptibility of Streptococcus spp. isolated from bovine mastitis in Argentina. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health 52: , Devriese LA, Hommez J, Laevens H, Pot B, Vandamme P, Haesebrouck F. Identification of aesculin-hydrolyzing streptococci, lactococci, aerococci and enterococci from subclinical intramammary infections in dairy cows. Vet Microbiol 70: 87-94,

70 Dutta GN, Devriese LA. Resistance to macrolide, lincosamide and streptogramin antibiotics and degradation of lincosamide antibiotics in streptococci from bovine mastitis. J Antimicrob Chemother 10: , 1982 Economou NJ, Cocklin S, Loll PJ. High-resolution crystal structure reveals molecular details of target recognition by bacitracin. Proc Natl Acad Sci USA 110: , Facklam R. What happened to the streptococci: overview of taxonomic and nomenclature changes. Clin Microbiol Rev 15: , Fernández M, Conde S, de la Torre J, Molina-Santiago C, Ramos JL, Duque E. Mechanisms of resistance to chloramphenicol in Pseudomonas putida KT2440. Antimicrob Agents Chemother 56: , Fisher JF, Meroueh SO, Mobashery S. Bacterial resistance to beta-lactam antibiotics: compelling opportunism, compelling opportunity. Chem Rev 105: , Fortin M, Messier S, Paré J, Higgins R. Identification of catalase-negative, non-beta-hemolytic, gram-positive cocci isolated from milk samples. J Clin Microbiol 41: , Guélat-Brechbuehl M, Thomann A, Albini S, Moret-Stalder S, Reist M, Bodmer M, Michel A, Niederberger MD, Kaufmann T. Cross-sectional study of Streptococcus species in quarter milk samples of dairy cows in the canton of Bern, Switzerland. Vet Rec 167: , Guérin-Faublée V, Tardy F, Bouveron C, Carret G. Antimicrobial susceptibility of Streptococcus species isolated from clinical mastitis in dairy cows. Int J Antimicrob Agents 19: , Haenni M, Galofaro LUthier M, Giddey M, Majcherczyk P, Moreillon P, Madec JY. Penicillin-binding protein gene alterations in Streptococcus uberis isolates presenting 60

71 decreased susceptibility to penicillin. Antimicrob Agents Chemother 54: , Hancock RE, Chapple DS. Peptide antibiotics. Antimicrob Agents Chemother 43: , Hirsh DC, Zee YC. Veterinary microbiology. Blackwell Science, Inc., Malden, U.S.A., Hooper DC. Mechanisms of action of antimicrobials: focus on fluoroquinolones. Clin Infect Dis 32: 9-15, Hung SW, Wang SL, Tu CY, Tsai YC, Chuang ST, Shieh MT, Liu PC, Wang WS. Antibiotic susceptibility and prevalence of erythromycin ribosomal methylase gene, erm(b) in Streptococcus spp. Vet J 176: , Jardetzky O. Studies on the mechanism of action of chloramphenicol. I. The conformation of chlioramphenicol in solution. J Biol Chem 238: , Joan C. Fourth-generation cephalosporins. Clin Microbiol Newsl 19: , Kalmus P, Aasmäe B, Kärssin A, Orro T, Kask K. Udder pathogens and their resistance to antimicrobial agents in dairy cows in Estonia. Acta Vet Scand 53: 4, 2011 Kotra LP, Haddad J, Mobashery S. Aminoglycosides: perspectives on mechanisms of action and resistance and strategies to counter resistance. Antimicrob Agents Chemother 44: , Lancefield RC. A serological differentiation of human and other groups of hemolytics streptococci. J Exp Med 57: , Landman D, Georgescu C, Martin DA, Quale J. Polymyxins revisited. Clin Microbiol Rev 21: ,

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74 library of ferrocene-containing acetoacetates and phenyl analogs: the discovery of a potent anticandidal agent. Mol Divers [Epub ahead of print], Redding LE, Cubas-Delgado F, Sammel MD, Smith G, Galligan DT, Levy MZ, Hennessy S. Comparison of two methods for collecting antibiotic use data on small dairy farms. Prev Vet Med 114: , Robert MC. Update on acquired tetracycline resistance genes. FEMS Microbiol Lett 245: , Rossitto PV, Ruiz L, Kikuchi Y, Glenn K, Luiz K, Watts JL, Cullor JS. Antibiotic susceptibility patterns for environmental streptococci isolated from bovine mastitis in central California dairies. J Dairy Sci 85: , Runciman DJ, Malmo J, Deighton M. The use of an internal teat sealant in combination with cloxacillin dry cow therapy for the prevention of clinical and subclinical mastitis in seasonal calving dairy cows. J Dairy Sci 93: , Rurangirwa FR, Teitzel CA, Cui J, French DM, McDonough PL, Besser T. Streptococcus didelphis sp. nov., a Streptococcus with marked catalase activity isolated from opossums (Didelphis virginiana) with suppurative dermatitis and liver fibrosis. Int J Syst Evol Microbiol 50: , Sabath LD. Reappraisal of the antistaphylococcal activities of first-generation (narrow-spectrum) and second-generation (expanded-spectrum) cephalosporins. Antimicrob Agents Chemother 33: Sandholm M, Kaartinen L, Pyörälä S. Bovine mastitis--why does antibiotic therapy not always work? An overview. J Vet Pharmacol Ther 13: , Sanford CJ, Keefe GP, Sanchez J, Dingwell RT, Barkema HW, Leslie KE, Dohoo IR. Test characteristics from latent-class models of the California Mastitis Test. Prev Vet Med 77: ,

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76 Todhunter DA, Smith KL, Hogan JS. Environmental streptococcal intramammary infections of the bovine mammary gland. J Dairy Sci 78: , Tohno M, Kitahara M, Matsuyama S, Kimura K, Ohkuma M, Tajima K. Aerococcus vaginalis sp. nov., isolated from the vaginal mucosa of a beef cow, and emended descriptions of Aerococcus suis, Aerococcus viridans, Aerococcus urinaeequi, Aerococcus urinaehominis, Aerococcus urinae, Aerococcus christensenii and Aerococcus sanguinicola. Int J Syst Evol Microbiol 64: , Trevisi E, Zecconi A, Cogrossi S, Razzuoli E, Grossi P, Amadori M. Strategies for reduced antibiotic usage in dairy cattle farms. Res Vet Sci 96: , Vandamme P, Pot B, Gillis M, de Vos P, Kersters K, Swings J. Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics. Microbiol Rev 60: , Waksman SA, Woodruff HB. Selective antibiotic action of various substances of microbial origin. J Bacteriol 4: , Zadoks RN, Middleton JR, McDougall S, Katholm J, Schukken YH. Molecular epidemiology of mastitis pathogens of dairy cattle and comparative relevance to humans. J Mammary Gland Biol Neoplasia 16: ,

77 附 錄 Appendix 1. The classification of streptococcal group (Facklam, 2002). Specics Lancefield group Origin S. pyogenes A Human S. agalactiae B Human, bovine S. dysgalactiae subsp. dysgalactiae C Animals subsp. equisimilis A, C, G, L Human, animals S. equi subsp. equi C Animals subsp. zooepidemicus C Human, animals S. canis G Dog, human S. anginosus A, C, G, F, None Human S. constellatus subsp. pharyngis C Human S. porcinus E, P, U, V, none,new Swine, human S. iniae None Dolphin, fish, human S. phocae C, F Seal S. didelphis None Opossum S. pneumoniae - Human S. equinus (S. bovis) D Equine, bovine S. gallolyticus (S. bovis I) D Human, koala, bovine S. pasteurianus (S. bovis II.2) D S. infantarius (S. bovis II/1) D Human, bovine S. lutetiensis D S. suis Type 1-35(R,S,T) Swine, human Viridans streptococci A, C, G, F,none Human Other streptococci and genera Unknown Animal, human 67

78 附 錄 A. B. β-lactam ring Thiazolidine ring β-lactam ring Dihydrothiazine ring Appendix 2. The chemical structure of penicillin G and ceftazidime (Fisher et al., 2005). Appendix 3. The chemical structure of streptomycin. ( Appendix 4. The chemical structure of lincomycin clindamycin and pirlimycin. 68

79 附 錄 Appendix 5. The drugs used to treat bovine mastitis in Taiwan. Trade name Component Manufacturer 萬 靈 素 軟 膏 Oxytetracycline hydrochloride Neomycin sulfate Sulfathiazole Hydrocortisone acetate 中 國 化 學 製 藥 股 份 有 限 公 司 新 萬 靈 素 軟 膏 泌 多 靈 軟 膏 Tetracycline HCL Neomycin sulfate Bacitracin Prednisolone Ampicillin sodium Cloxacillin sodium 中 國 化 學 製 藥 股 份 有 限 公 司 中 國 化 學 製 藥 股 份 有 限 公 司 賜 福 樂 軟 膏 Cefuroxime sodium 中 國 化 學 製 藥 股 份 有 限 公 司 乳 安 軟 膏 Ampicillin sodium Cloxacillin sodium 建 盈 股 份 有 限 公 司 乳 寶 一 號 軟 膏 Cefuroxime sodium 嘉 信 藥 品 股 份 有 限 公 司 克 倍 寧 LC Cefquinome 英 特 威 藥 品 股 份 有 限 公 司 69

80 附 錄 Appendix 6. Active ingredients and reactions enzyme table for API 20 Strept test. Test Active ingredients Reactions/enzyme VP Sodium pyruvate Acetoin production (Voges proskauer) HIP Hippuric acid Hydrolysis (HIPpuric acid) ESC Esculin ferric citrate β-glucosidase hydrolysis (ESCulin) PYRA Pyroglutamic acid-β-naphthylamide PYRrolidonyl Arylamidase αgal 6-bromo-2-naphthyl-αD-galactopyranoside αgalactosidase βgur Naphthol ASBI-glucuronic acid β-giucuronidase βgal 2-naphthyl-βD-galactopyranoside β-galactosidase PAL 2-naphthyl phosphate Alkaline phosphase LAP L-leucine-β-naphthylamide Leucine AminoPeptidase ADH L-arginine Arginine DiHydrolase RIB D-ribose Acidification (RIBose) ARA L-arabinose Acidification (ARAbinose) MAN D-mannitol Acidification (MANnitol) SOR D-sorbitol Acidification (SORbitol) LAC D-lactose (Bovine origin) Acidification (LACtose) TRE D-trehalose Acidification (TREhalose) INU Inulin Acidification (INUlin) RAF D-raffinose Acidification (RAFfinose) AMD Starch Acidification (AmiDon) GLYG Glycogan Acidification (GLYcoGen) 70

81 附 錄 Appendix 7. Reading table for API 20 Strept test. Test Result Negative Positive VP VP 1 + VP 2 / wait 10 min colorless pink - red HIP NIN / wait 10 min colorless / pale blue / bluish - grey dark blue / violet ESC 4 hrs. 24 hrs. 4 hrs. 24 hrs. colorless colorless black Black pale yellow pale yellow light grey grey ZYM A + ZYM B / 10 min (PYRA to LAP) PYRA colorless or very pale orange orange αgal colorless violet βgur colorless blue βgal colorless or very pale violet violet PAL colorless or very pale violet violet LAP colorless orange ADH yellow red RIB red orange / red Orange / yellow yellow ARA red orange / red Orange / yellow yellow MAN red orange / red Orange / yellow yellow SOR red orange / red Orange / yellow yellow LAC red orange / red Orange / yellow yellow TRE red orange / red Orange / yellow yellow INU red orange / red Orange / yellow yellow RAF red orange / red Orange / yellow yellow AMD red orange / red Orange / yellow yellow GLYG red orange / red Orange / yellow yellow 71

82 附 錄 Appendix 8. Zone diameter interpretive standards of streptococci. Zone diameter (mm) Antibiotics Disk content S a I R Amikacin (AK 30) 30 μg Amoxicillin (AML 25) 25 μg Ampicillin (AMP 10) 10 μg Bacitracin (B 10) 10 units Cefazolin (KZ 30) 30 μg Cefuroxime (CXM 30) 30 μg Ceftiofur (EFT 30) 30 μg Cloxacillin (OB 5) 5 μg Chloramphenicol (C 30) 30 μg Kanamycin (K 30) 30 μg Lincomycin (MY 15) 15 μg Neomycin (N 30) 30 μg Oxytetracycline (OT 30) 30 μg Penicillin (P 10) 10 units Streptomycin (S 10) 10 μg Tetracycline (TE 30) 30 μg : The results were evaluated with Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility test for bacterial isolated from animals; approved standards- third edition (CLSI, 2008) and information of commercial product (Oxoid Ltd., Basingstoke, UK). a : S, susceptible; I, intermediate; R, resistant. 72