1428 中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2013,29(8):1428 1432 [ 文章编号 ] 1000 4718(2013)08 1428 05 mir 335 靶向 Sp1 对人骨肉瘤 MG 63 细胞增殖的调控 王勇, 赵伟 ( 沈阳医学院附属中心医院骨四科, 辽宁沈阳 110024) [ 摘要 ] 目的 : 探讨 mir 335 对人骨肉瘤 MG 63 细胞增殖的调控是否通过靶向抑制 Sp1 基因的表达实现 方法 : 利用萤光素酶报告基因实验验证 mir 335 能否靶向作用于 Sp1 基因的 3 非翻译区 (untranslatedregion, UTR); 利用 real timepcr 和 Westernbloting 分析 Sp1mRNA 和蛋白表达的变化 ; 通过 MTT 法分析 MG 63 细胞增殖水平 结果 : 萤光素酶报告基因实验结果显示,miR 335 可特异性结合于 Sp1 基因的 3 UTR Real timepcr 和 Westernbloting 结果显示, 转染 mir 335 可减少 Sp1 蛋白的表达, 但对 mrna 表达无显著影响 ; 转染 Sp1 表达质粒可上调 Sp1mRNA 和蛋白表达 MTT 结果显示,miR 335 可抑制 MG 63 细胞增殖, 转染 Sp1 表达质粒可部分逆转 mir 335 对 MG 63 细胞增殖的抑制作用 结论 :mir 335 可能通过靶向 Sp1 基因抑制人骨肉瘤 MG 63 细胞增殖 [ 关键词 ] mir 335;Sp1 转录因子 ; 骨肉瘤 ; 细胞增殖 [ 中图分类号 ] R363 [ 文献标志码 ] A doi:10.3969/j.isn.1000 4718.2013.08.015 mir 335regulatesproliferationofhumanosteosarcomaMG 63celsby targetingsp1 WANGYong,ZHAOWei (TheFourthDepartmentofOrthopaedics,CentralHospitalAfiliatedtoShenyangMedicalColege,Shenyang110024,Chi na.e mail:zhaowei332@126.com) [ABSTRACT] AIM:ToinvestigatetheregulatoryroleofmiR 335ontheproliferationofhumanosteosarcomacel linemg 63.METHODS:LuciferasereportergeneasaywasusedtodetectthespecificbindingabilityofmiR 335toSp1 3 untranslatedregion(utr).real timepcrandwesternblotingwereusedtoevaluatetheexpresionofsp1mrna andprotein,respectively.mttasaywasusedtoanalyzetheproliferationofmg 63cels.RESULTS:Theluciferasere portergeneasayshowedthatmir 335targetedSp13 UTR.Westernblotingandreal timepcrshowedthatmir 335in hibitedtheproteinexpresionofsp1,buthadnoefectonthemrnaexpresionofsp1.transfectionofsp1expresion plasmidincreasedtheproteinandmrnaexpresionofsp1.mttasayshowedtheviabilityofmg 63celstransfectedwith mir 335wassignificantlydecreasedcomparedwithnegativecontrol.TransfectionofSp1expresionplasmidpartlyreversed theinhibitoryefectofmir 335ontheproliferationofMG 63cels.CONCLUSION:miR 335inhibitstheproliferationof humanosteosarcomamg 63cels,whichmayberelatedtoitstargetingonSp13 UTRandthesubsequentdown regulation ofsp1expresion. [KEYWORDS] mir 335;Sp1transcriptionfactor;Osteosarcoma;Celproliferation 微小 RNA(microRNA,miRNA) 是近年来发现的长度约 22nt 的内源性短链 RNA, 在个体发育 细胞分化 增殖及凋亡等生理活动中以及在肿瘤发生 发展等病理过程中发挥重要调控作用 [1 3] mir 335 在人类定位于 7q32.2, 近来研究发现它在乳腺癌 肺癌及胃癌中低表达而失去对其靶基因 Sp1 的调控, 导致 Sp1 表达上调, 进而促进肿瘤的发生发展 [4 6] 有研究表明骨肉瘤组织和细胞系中 mir 335 异常表达 [7 8], 提示 mir 335 可能参与骨肉瘤的发生发展, 但具体机制目前尚不清楚 本研究旨在观察 mir 335 对人骨肉瘤 MG 63 细胞增殖的影响, 并探讨其是否通过抑制 Sp1 基因的表达实现 [ 收稿日期 ]2013 01 26 [ 修回日期 ]2013 07 02 [ 基金项目 ] 辽宁省自然科学基金资助项目 (No.20102218) 通讯作者 Tel:024 85715200;E mail:zhaowei332@126.com
1429 1 材料 材料和方法 人骨肉瘤细胞系 MG 63 和人成骨细胞系 hfob1.19 购自中科院上海细胞库 ; 质粒提取试剂盒 RNA 提取试剂盒 逆转录试剂盒 PCR 试剂盒及 Lipofectamine TM 2000 转染试剂盒购自 Invitrogen;MTT 购自 Sigma;Sp1 兔源单克隆抗体购自 CelSignaling; 引物由上海生物工程公司合成 ;pgl3 购自 Promega; Sp1 表达质粒购自 Origene;miR 335mimic 及 mimic control 购自广州锐博生物科技有限公司 2 方法 2.1 细胞培养及分组 hfob1.19 细胞培养于添加 10% 胎牛血清 DMEM/F12 培养液中 34 5%CO 2 孵箱中培养 MG 63 细胞培养于添加 10% 胎牛血清 DMEM 培养液中 37 5%CO 2 孵箱中培养 取对数生长期的 MG 63 细胞随机分为 4 组 :(1) 空白对照组, 未做任何处理 ;(2) 阴性对照组, 转染 mimiccon trol;(3)mir 335mimic 组, 转染 mir 335mimic;(4) mir 335mimic+Sp1 组, 共转染 mir 335mimic 和 Sp1 表达质粒 相同条件下重复 3 次以上 2.2 脂质体介导的细胞转染将 MG 63 接种于 6 孔板中, 接种密度 2 10 5 cels/wel,24h 后利用 Li pofectamine TM 2000 转染 50nmol/LRNAmimic 和相应的 mimiccontrol, 利用 Lipofectamine TM 2000 转染 5 μgsp1 表达质粒, 具体操作见转染试剂盒说明书 48h 后收集细胞进行后续实验 2.3 载体构建及萤光素酶报告实验利用 PCR 法从人基因组 DNA 中扩增含有 mir 335 结合位点的 Sp1 的 3 非翻译区 (untranslatedregion,utr), 然后将其插入到 pgl3controlvector 中 ; 携带突变的 Sp1 3 UTR 的 pgl3controlvector 载体作为验证其特异性的对照 24 孔板中, 按照 Lipofectamine TM 2000 说明书转染干预因素, 同时共转染 mir 335 转染 MG 63 细胞 24h 后, 利用双萤光素酶报告基因检测法检测, 具体操作见说明书 2.4 MTT 法检测细胞增殖胰蛋白酶消化单层培养的 MG 63 细胞, 用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基制成单细胞悬液,2 10 3 cels/wel 接种于 96 孔板中, 每孔加入培养基 200μL 将细胞放入 37 5% CO 2 培养箱中培养, 待细胞长至 50% 融合时更换无血清培养基同步化 24h 后, 加入血清, 不同时间 (24 h 48h 和 72h) 加入 MTT, 继续培养 4h, 弃去培养基, 加入 150μLDMSO, 室温孵育 10min, 上机测定 A 490, 以该值代表细胞活力 2.5 Real timepcr 细胞总 RNA 提取按 Trizol 试 剂盒说明书操作 使用 Invitrogen 的逆转录反应试 剂盒, 按试剂盒说明书进行 反应产物进行 PCR 扩 增,PCR 过程按 Invitrogen 的 SYBRGreen 实时荧光 定量 PCR 试剂盒说明书在荧光定量仪上进行,Sp1 使用 GAPDH 作为内参照同时进行,miR 335 使用 U6 作为内参照同时进行, 引物序列见表 1 以 Sp1mR NA 拷贝数与内参照 GAPDHmRNA 拷贝数的比值为 Sp1 的相对表达量 ;mir 335 拷贝数与内参照 U6 拷 贝数的比值为 mir 335 的相对表达量 表 1 GAPDH Sp1 U6 及 mir 335 引物序列 Table1.PrimersequencesforGAPDH,Sp1,U6andmiR 335 Name Primer Sequence(5 3 ) GAPDH PCRprimer Forward:GGAGTCAACGGATTTGGT Reverse:GTGATGGGATTTCCATTGAT Sp1 PCRprimer Forward:TGGTGGGCAGTATGTTGT Reverse:GCTATTGGCATTGGTGAA U6 PCRprimer Forward:CTCGCTTCGGCAGCACA Reverse:AACGCTTCACGAATTTGCGT mir 335 RTprimer GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCG AGGTATTCGCACTGGATACGACA PCRprimer Forward:AGCCGTCAAGAGCAATAACGAA Reverse:GTGCAGGGTCCGAGGT 2.6 Westernbloting 提取细胞总蛋白, 采用 BCA 法进行蛋白定量 各取 30μL 样品上样进行 SDS PAGE, 电泳后电转移至 PVDF 膜上,5% 脱脂奶粉室 温封闭 1h, 加入 Ⅰ 抗,4 孵育过夜,TBST 洗涤 3 次 加入 Ⅱ 抗 37 孵育 45min,TBST 洗涤 3 次, 最 后按 ECL 试剂盒说明进行电化学发光检测 3 统计学处理 用 SPSS16.0 统计软件处理, 数据以均数 ± 标准 差 (mean±sd) 表示, 多组比较采用单因素方差分析 以 P<0 05 为差异有统计学意义 结果 1 MG 63 及 hfob1.19 细胞 mir 335 和 Sp1 表达 Real timepcr 及 Westernbloting 结果显示, 与正常成骨细胞系 hfob1.19 相比, 人骨肉瘤细胞系 MG 63 中 mir 335 表达明显降低 (P<0 05),Sp1 蛋白表达明显增加 (P<0 05), 见图 1 2 mir 335mimic 上调人骨肉瘤细胞系 MG 63 mir 335 的表达 Real timepcr 结果显示, 转染外源性 mir 335 mimic, 与阴性对照组相比,miR 335 的表达明显增加 (P<0 05), 见图 2
1430 显升高, 也就是抑制了 mir 335 与 Sp13 UTR 的结合, 见图 3 Figure1.TheexpresionofmiR 335(A)andSp1protein(B) inmg 63andhFOB1.19cels.Mean±SD.n=3. P<0 05vshFOB1.19. 图 1 人骨肉瘤细胞系 MG 63 及 hfob1.19 中 mir 335 和 Sp1 的表达水平 Figure2. TheexpresionofmiR 335inhumanosteosarcoma MG 63celsquantifiedbyreal timepcr.mg 63 celsweretransfectedwithmir 335for48h.Mean± SD.n=3. P<0 05vsnegativecontrol(NC). 图 2 Real timepcr 检测 MG 63 细胞转染 mir 335mimic 48h 后 mir 335 的表达水平 3 mir 335 靶向作用 Sp13 UTR 萤光素酶报告基因检测结果显示, 经 Sp13 UTR 和 mir 335mimic 共转染的 MG 63 细胞的萤光素酶活性比阴性对照组下降 (P<0 05) 同时, 把 Sp13 UTR 与 mir 335 结合的位点做了突变, 并进行转染, 可以看到突变后均能够使萤光素酶活性明 Figure3.BindingofmiR 335toSp13 UTRdetectedbylucife rasereportergeneasay.a:sequencesofthemir 335bindingsiteswithinwild type(wt)andmutant (Mut)Sp13 UTR;B:luciferaseactivityinMG 63 celsafterco transfectedwithwtsp13 UTRorMut Sp13 UTRinthepresenceofmiR 335mimic.Mean ±SD.n=3. P<0.05vsnegativecontrol(NC). 图 3 萤光素酶报告基因实验检测 mir 335 与 Sp13 UTR 的结合 4 mir 335 通过调控 Sp1 蛋白表达抑制 MG 63 细胞增殖 MTT 法检测细胞增殖结果显示, 转染 mir 335 mimic 后, 各时点 (24h 48h 及 72h) 细胞增殖率均较阴性对照组显著降低 (P<0 05), 共转染 mir 335 mimic 和 Sp1 表达质粒后, 其细胞增殖率较单独 mir 335mimic 处理明显增加 (P<0 05), 见图 4A Real timepcr 检测 MG 63 细胞中 Sp1mRNA 表达结果显示, 与阴性对照相比,miR 335mimic 处理组各时点 (24h 48h 及 72h)Sp1mRNA 表达水平较阴性对照组的变化均不明显 (P>0 05), 共转染 mir 335 mimic 和 Sp1 表达质粒后,Sp1mRNA 表达水平较单独 mir 335mimic 处理明显增加 (P<0 05), 见图 4B Westernbloting 检测 MG 63 中 Sp1 蛋白表达结果显示, 与阴性对照相比,miR 335mimic 处理组各时点 (24h 48h 及 72h)Sp1 蛋白表达水平较阴性对照组明显降低 (P<0 05), 共转染 mir 335mimic 和 Sp1 表达质粒后,Sp1 蛋白表达水平较单独 mir 335mimic 处理明显增加 (P<0 05), 见图 4C
1431 Figure4.miR 335regulatestheproliferationofhumanosteosar comamg 63celsbytargetingSp1.A:efectsofmiR 335ontheproliferationofhumanosteosarcomaMG 63 cels;b:sp1mrnaexpresioninmg 63cels48h afterco transfectedwithmir 335andSp1expresion vectorwasdetectedbyreal timepcr;c:sp1protein expresioninmg 63cels48hafterco transfected withmir 335andSp1expresionvectorwasdetected bywesternbloting.mean±sd.n=3. P<0 05vs negativecontrol(nc); # P<0 05vsmiR 335mimic. 图 4 mir 335 通过调控 Sp1 蛋白表达抑制 MG 63 细胞增殖 讨论骨肉瘤在原发性骨肿瘤中, 骨肉瘤的发病率仅 次于浆细胞骨髓瘤, 居第 2 位, 好发于 10~25 岁青年, 男女患者比例约为 1.5 1 骨肉瘤的恶性程度很高, 生长非常迅速, 转移早, 侵袭性强, 在临床上做出诊断时已有 80% 左右的患者发生了肺部或其它部位的转移 目前, 骨肉瘤的治疗仍是主要针对于肿瘤整体, 通过辅助化疗和手术切除去除或杀灭大多数骨肉瘤的肿瘤细胞, 但仍很难阻止骨肉瘤的复发和转移 mirna 广泛存在于真核生物中, 是一类在进化上高度保守的非编码小分子单链 RNA 在正常状态下,miRNA 的表达具有严格的组织及时序特异性, 当 mirna 异常表达时则可能导致疾病的发生 研究表明,miRNA 在肿瘤组织中常异常表达, 可能起到癌基因或抑癌基因的作用 [9 11] mir 335 在人类定位于 7q32.2, 研究发现 mir 335 在不同的肿瘤中发挥着不同的作用,miR 335 在乳腺癌 胃癌中低表达, 过表达后抑制肿瘤侵袭转移 [5 6], 发挥着类似于肿瘤抑制基因的功能, 而在星形细胞瘤中高表达能促进肿瘤细胞增殖侵袭 [12], 发挥着癌基因的作用 有研究表明骨肉瘤组织和细胞系中 mir 335 低表达 [7 8], 提示 mir 335 可能在骨肉瘤中发挥着类似于肿瘤抑制基因的功能 本研究发现人骨肉瘤细胞系 MG 63 中 mir 335 低表达, 通过转染 mir 335mimic 上调骨肉瘤细胞系 MG 63 中 mir 335 的表达, 细胞增殖能力明显下降, 表明 mir 335 对骨肉瘤细胞的增殖有抑制作用 Sp1 基因位于人染色体第 12q13.1 区域, 有 6 个外显子, 其 mrna 长 7667bp, 由 788 个残基组成, 参与几乎所有的细胞功能, 包括细胞增殖 凋亡和分化 [13] 另外,Sp1 是一种重要和必需的转录因子 越来越多的研究发现 [14 16],Sp1 蛋白的表达是肿瘤发生发展的一个重要因素, 这与其能激活与肿瘤生长或转移相关的基因有关, 如激活 VEGF 及多种蛋白激酶, 促进肿瘤的转移 本研究发现人骨肉瘤细胞系 MG 63 中 Sp1 蛋白高表达, 通过转染 mir 335 mimic 上调骨肉瘤细胞系 MG 63 中 mir 335 后,Sp1 蛋白表达降低,Sp1mRNA 变化不明显, 这提示 mir 335 在转录后水平调控 Sp1 的表达 同时, 本研究在骨肉瘤细胞系 MG 63 中利用萤光素酶报告基因实验证实了 mir 335 可靶向作用于 Sp13 UTR 区, 这与以往研究结果一致 [4 6] 此外, 在骨肉瘤细胞系 MG 63 中转染 Sp1 表达质粒可部分逆转 mir 335 对细胞增殖的抑制作用 以上结果提示, 在骨肉瘤细胞系 MG 63 中,miR 335 可通过靶向作用于 Sp13 UTR 区, 在转录后水平抑制 Sp1 的表达, 进而抑制细胞的
1432 增殖 由于 mir 335 的靶基因众多, 转染 Sp1 表达质粒仅部分逆转 mir 335 对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用, 提示 mir 335 对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用可能通过靶向多种基因来实现, 这还有待于进一步研究 综上所述,miR 335 能够通过靶结合到 Sp13 UTR 区并干扰 Sp1 的表达, 抑制骨肉瘤细胞的增殖, 提示 mir 335 在骨肉瘤的发生和发展过程中发挥了重要作用, 有可能成为骨肉瘤治疗的靶基因 [ 参考文献 ] [1] EcksteinF.Smalnon codingrnasasmagicbulets[j]. TrendsBiochemSci,2005,30(8):445 452. [2] WuW,SunM,ZouGM,etal.MicroRNAandcancer: curentstatusandprospective[j].intjcancer,2007, 120(5):953 960. [3] PetriA,LindowM,KauppinenS.MicroRNAsilencingin primates:towardsdevelopmentofnoveltherapeutics[j]. CancerRes,2009,69(2):393 395. [4] WangH,LiM,ZhangR,etal.EfectofmiR 335upreg ulationontheapoptosisandinvasionoflungcancercel A549andH1299[J].TumourBiol,2013Jun6.[Epub aheadofprint] [5] XuY,ZhaoF,WangZ,etal.MicroRNA 335actsasa metastasissuppresoringastriccancerbytargetingbcl w andspecificityprotein1[j].oncogene,2012,31(11): 1398 1407. [6] HeynH,EngelmannM,SchreekS,etal.MicroRNA mir 335iscrucialfortheBRCA1regulatorycascadein breastcancerdevelopment[j].intjcancer,2011,129 (12):2797 2806. [7] MaireG,MartinJW,YoshimotoM,etal.Analysisof mirna geneexpresion genomicprofilesrevealscomplex mechanismsofmicrorna deregulation in osteosarcoma [J].CancerGenet,2011,204(3):138 146. [8] HuH,ZhangY,CaiXH,etal.ChangesinmicroRNAex presioninthemg 63osteosarcomacellinecompared withosteoblasts[j].oncollet,2012,4(5):1037 1042. [9] 嵇晓辉, 范秉琳, 张红鸽, 等.MicroRNA 100 对肝癌细胞增殖活力和细胞周期的影响 [J]. 中国病理生理杂志,2013,29(1):108 111. [10] 胡婷, 陈梅香, 翁泽平, 等.miR 21 通过下调 PTEN 增强人脑胶质瘤细胞对卡莫司汀耐药 [J]. 中国病理生理杂志,2012,28(8):1345 1351. [11] 赵文健, 杨亮, 李坚, 等.miR 181b 对肝癌 HepG2 细胞增殖以及 Bcl 2 和 Sp1 蛋白表达的影响 [J]. 中国病理生理杂志,2010,26(11):2106 2111. [12]ShuM,ZhengX,WuS,etal.TargetingoncogenicmiR 335inhibitsgrouthandinvasionofmalignantastrocytoma cels[j].molcancer,2011,10:59. [13]StrokeG.TheSp familyoftranscription factors[j]. Gene,1999,238(2):291 300. [14]ChaeYM,ParkKK,MagaeJ,etal.Sp1 decoyoligode oxynucleotideinhibitshighglucose inducedmesangialcel proliferation[j].biochem BiophysResCommun,2004, 319(2):550 555. [15] SafeS,AbdelrahimM.SPtranscriptionfactorfamilyand itsroleincancer[j].eurjcancer,2005,41(16):2438 2448. [16] WangL,WeiD,HuangS,etal.TanscriptionfactorSp1 expresionisasignificantpredictorofsurvivalinhuman gastriccancer[j].clincancerres,2003,9(17):6371 6380.