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1 台 296 灣 獸 醫 誌 Taiwan Vet J 36 (4): , 200 台 灣 中 南 部 地 區 生 乳 中 潛 在 細 菌 種 類 與 藥 物 感 受 性 之 調 查 郭 鴻 志 2 莊 士 德 2 周 濟 眾 費 昌 勇 * 張 紹 光 國 立 台 灣 大 學 獸 醫 專 業 學 院 獸 醫 學 研 究 所 台 北 市 2 國 立 中 興 大 學 獸 醫 學 院 獸 醫 學 系 台 中 市 ( 收 稿 日 期 :99 年 04 月 02 日 接 受 日 期 :99 年 05 月 24 日 ) 摘 要 感 染 菌 對 治 療 藥 品 的 感 受 性, 為 影 響 療 效 的 首 要 因 素 之 一 本 調 查 在 了 解 台 灣 中 南 部 地 區 乳 牛 乳 汁 中 潛 在 細 菌 種 類 對 常 用 治 療 藥 物 的 感 受 性 由 試 驗 結 果 得 知, 於 無 臨 床 症 狀 乳 牛 之 生 乳 中, 細 菌 分 離 率 為 39.6 % (482/26); 革 蘭 氏 陰 性 分 離 菌 中, 以 大 腸 桿 菌 與 克 雷 伯 氏 菌 為 多 ; 革 蘭 氏 陽 性 分 離 菌 中, 以 葡 萄 球 菌 屬 為 最 多 而 腸 球 菌 屬 與 鏈 球 菌 屬 次 之 藥 物 感 受 性 試 驗 的 結 果 指 出, 除 了 畜 福 紅 黴 素 與 羥 四 環 黴 素 外, 葡 萄 球 菌 屬 與 鏈 球 菌 屬 對 於 常 用 抗 菌 劑 的 抗 藥 性 比 率 均 遠 較 腸 球 菌 屬 為 高, 葡 萄 球 菌 屬 與 鏈 球 菌 屬 對 於 恩 氟 奎 林 羧 酸 仍 具 有 較 佳 的 感 受 性 對 大 腸 桿 菌 與 其 他 陰 性 菌 而 言, 具 有 相 似 且 一 致 性 的 敏 感 性 結 果, 即 對 恩 氟 奎 林 羧 酸 與 健 牠 黴 素 具 最 佳 的 感 受 性 由 於 乳 汁 中 可 存 在 的 細 菌 種 類 繁 多, 對 常 用 治 療 藥 物 的 敏 感 性 各 異, 故 適 當 且 定 期 監 測, 確 有 其 必 要 性 [ 郭 鴻 志 莊 士 德 周 濟 眾 費 昌 勇 * 張 紹 光 台 灣 中 南 部 地 區 生 乳 中 潛 在 細 菌 種 類 與 藥 物 感 受 性 之 調 查 台 灣 獸 醫 誌 36 (4): * 通 訊 作 者 TEL: ,FAX: , [email protected]] 緒 言 乳 房 炎 為 乳 牛 最 重 要 的 疾 病 之 一, 亦 是 世 界 酪 農 產 業 最 普 遍 的 疾 病 之 一 [3,6,2] 可 引 起 乳 房 炎 的 原 因, 雖 然 包 括 了 細 菌 黴 菌 黴 漿 菌 和 病 微 生 物 的 感 染 與 各 種 外 在 理 化 因 子 的 刺 激 [9], 但 最 常 見 者, 仍 為 細 菌 性 的 感 染 ; 這 包 括 了 鏈 球 菌 (Streptococcus spp.) 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus spp.) 大 腸 桿 菌 (Escherichia coli) 棒 狀 桿 菌 (Corynebacterium spp.) 芽 胞 梭 菌 (Clostridium spp.) 奴 卡 氏 菌 (Nocardia spp.) 和 假 單 胞 菌 (Pseudomonas spp.) 對 乳 房 直 接 的 感 染, 當 然, 分 枝 桿 菌 (Mycobacterium spp.) 及 布 氏 桿 菌 (Brucella spp.) 的 全 身 性 感 染, 亦 可 以 導 致 乳 房 病 變 的 產 生 [3,7,0] 由 於 上 述 微 生 物 多 可 廣 泛 的 存 在 於 乳 牛 周 圍 的 環 境 與 排 泄 物 中 正 常 牛 隻 的 體 表 和 天 然 孔 道 內 出 現 於 被 感 染 牛 隻 的 乳 腺 與 乳 汁 中 與 / 或 其 他 組 織 的 分 泌 物 中, 故 再 經 由 直 接 乳 頭 口 部 乳 房 皮 膚 傷 口 或 各 種 接 觸 與 血 液 循 環 感 染 乳 腺 組 織 均 可 能 發 生 但 在 現 場 最 主 要 且 常 見 的 感 染 方 式 為 : 被 感 染 的 乳 分 房 排 出 定 著 於 乳 腺 的 菌 種, 經 由 榨 乳 相 關 用 具 ( 抹 布 乳 杯 水 桶 ) 與 榨 乳 者 手 部 的 污 染 或 昆 蟲 媒 介, 經 由 乳 頭 口 部 侵 入 乳 房 內 [3,5]; 另 經 由 牛 隻 體 表 或 天 然 孔 道 常 在 菌 叢 直 接 入 侵 乳 房 者 則 較 少 見 [5] 若 依 乳 房 炎 發 生 時 的 全 身 症 狀 乳 房 狀 態 乳 汁 異 常 和 細 菌 感 染 的 有 無, 可 將 乳 房 炎 細 分 成 甚 急 性 急 性 亞 急 性 慢 性 潛 在 性, 非 特 異 性 六 種, 其 中 除 了 非 特 異 性 乳 房 炎 外, 均 可 由 細 菌 的 感 染 所 產 生 [4,20] 若 是 依 照 國 際 乳 業 聯 盟 建 議, 則 可 將 乳 房 炎 依 病 原 的 有 無, 乳 質 與 乳 房 的 肉 眼 變 化 而 將 乳 房 炎 分 為 感 染 性 臨 床 型 感 染 性 亞 臨 床 型 非 特 異 性 臨 床 型 與 非 特 異 性 亞 臨 床 型 [5, 2,3] 而 上 述 的 感 染 性 臨 床 與 亞 臨 床 型 亦 均 可 分 離 到 病 原

2 生 乳 中 潛 在 細 菌 種 類 與 藥 物 感 受 性 297 菌 另 若 再 以 臨 床 治 療 實 用 的 觀 點 而 言, 依 照 感 染 微 生 物 的 種 類 分 類, 應 是 最 為 實 際 且 和 治 療 相 關 的 分 類 方 法 ; 此 法 可 將 常 見 的 乳 房 炎 次 分 為 : 鏈 球 菌 性 葡 萄 球 菌 性 腸 道 菌 類 假 單 胞 菌 性 化 膿 棒 狀 桿 菌 性 黴 漿 菌 性 黴 菌 性 及 其 他 較 少 發 生 之 細 菌 性 乳 房 炎 以 國 內 近 年 來 針 對 生 乳 樣 本 進 行 調 查 的 結 果 得 知, 葡 萄 球 菌 (4-2%) 及 鏈 球 菌 (0-20%) 感 染 居 多, 大 腸 桿 菌 群 的 感 染 (5%) 次 之, 而 黴 漿 菌 與 黴 菌 性 感 染 則 相 對 較 少 [,2] 但 不 論 乳 房 炎 是 以 何 種 形 式 分 類, 其 可 造 成 的 經 濟 損 失, 在 全 世 界 估 計 每 年 約 為 360 億 美 元, 而 平 均 每 一 頭 受 感 染 的 母 牛 約 損 失 200 美 元, 這 些 損 失 包 括 了 牛 乳 的 減 產 治 療 期 間 因 藥 物 殘 留 所 去 棄 的 乳 汁 藥 物 治 療 花 費 及 勞 力 的 付 出, 因 此, 乳 房 炎 的 防 治, 一 直 均 為 酪 農 業 者 與 相 關 獸 醫 師 的 重 點 工 作 之 一 對 台 灣 現 況 而 言, 近 幾 十 年 來, 臨 床 乳 房 炎 一 直 均 是 以 抗 菌 劑 治 療 為 主, 現 可 見 核 可 的 市 售 乳 房 炎 軟 膏 ( 乳 房 內 灌 注 ) 或 注 射 用 藥 約 十 數 種, 這 包 括 了 鏈 黴 素 (streptomycin) 羥 四 環 黴 素 (oxytetracycline) 配 尼 西 林 (penicillin) 氯 噁 唑 西 林 (cloxacillin) 與 雙 氯 噁 唑 西 林 (dicloxacillin) ; 相 對 而 言, 因 乳 房 炎 治 療 用 抗 菌 劑 長 期 反 覆 與 廣 泛 的 使 用, 部 分 病 原 菌 亦 已 對 特 定 治 療 用 的 藥 物, 產 生 高 比 例 的 抗 藥 性 對 畜 主 而 言, 在 常 無 送 檢 患 病 乳 牛 乳 汁 樣 本 意 願 的 情 況, 加 上 抗 菌 劑 使 用 所 造 成 的 選 擇 性 壓 力, 均 會 使 得 具 有 抗 藥 性 ( 或 多 重 抗 藥 性 ) 的 特 定 菌 種 在 場 中 環 境 常 存, 最 後 除 又 勢 必 再 導 致 因 重 複 感 染 與 治 療 的 困 境 外, 亦 可 能 造 成 乳 品 與 人 畜 公 共 衛 生 上 的 問 題 故 持 續 針 對 乳 汁 中 細 菌 進 行 抗 菌 劑 藥 物 敏 感 性 試 驗 與 監 控, 為 改 善 療 效 與 減 少 農 民 經 濟 損 失 的 不 二 手 段 基 於 上 述 原 因, 本 研 究 為 針 對 健 康 牛 隻 的 乳 汁 進 行 採 樣, 分 離 與 乳 房 炎 最 常 見 的 相 關 細 菌 ( 革 蘭 氏 陽 性 菌 : 葡 萄 球 菌 鏈 球 菌 與 腸 球 菌 ; 革 蘭 氏 陰 性 菌 : 以 大 腸 桿 菌 為 主 ), 了 解 其 在 生 乳 中 的 發 生 率, 並 且 經 由 選 定 藥 物 的 感 受 性 試 驗, 了 解 現 用 治 療 藥 物, 在 臨 床 上 的 療 效 材 料 與 方 法 樣 本 收 集 針 對 選 定 並 有 意 願 配 合 的 6 個 中 大 型 乳 牛 場 進 行 採 樣, 乳 汁 樣 品 的 採 集 時 間, 均 多 為 清 晨 或 傍 晚, 即 各 場 集 乳 前 乳 汁 樣 本 收 集 前, 均 先 以 70% 酒 精 噴 灑 後, 由 內 而 外 仔 細 擦 拭 乳 房 與 乳 頭 管 末 端 ( 乳 頭 口 ), 於 去 棄 前 3-5 次 榨 出 的 前 段 乳 汁 後, 再 直 接 以 5 ml 無 菌 離 心 管 收 集 乳 汁 ; 收 集 時, 均 會 避 免 乳 頭 直 接 碰 觸 管 壁, 採 集 乳 汁 量 約 5-0 ml 後, 立 即 緊 閉 管 蓋, 並 暫 將 樣 品 置 於 預 置 有 碎 冰 的 冰 箱 中 保 存, 待 整 場 採 樣 完 畢 後, 盡 快 將 樣 本 送 回 試 驗 室, 於 十 二 小 時 內 進 行 細 菌 分 離 與 培 養 於 本 調 查 中, 除 了 不 泌 乳 或 最 近 曾 接 受 治 療 的 乳 房 外, 每 一 頭 乳 牛 均 分 別 採 取 四 個 乳 分 房 的 生 乳 樣 本 細 菌 培 養 將 乳 汁 樣 本 以 滅 菌 棉 棒 塗 抹 於 血 液 培 養 基 與 MacConkey (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA) 培 養 基 上, 置 於 37 恆 溫 箱 中 經 6-20 小 時 後, 挑 選 疑 似 菌 落 進 行 次 培 養 與 純 化, 經 純 化 後 的 疑 似 菌, 再 挑 取 單 一 菌 落, 以 20% 甘 油 保 存 於 -70 冰 箱 中, 供 鑑 定 或 藥 物 感 受 性 試 驗 使 用 細 菌 鑑 定 以 革 蘭 氏 染 色 與 3% KOH 區 分 革 蘭 氏 陽 性 或 陰 性 菌 本 試 驗 所 選 的 革 蘭 氏 陽 性 菌 包 括 : 葡 萄 球 菌 鏈 球 菌 與 腸 球 菌, 上 述 陽 性 菌 的 鑑 定, 均 係 抽 取 細 菌 的 去 氧 核 糖 核 酸 (DNA), 以 多 重 引 子 進 行 聚 合 鏈 鎖 反 應 進 行 ( 引 子 對 如 Table 所 示 ) 屬 革 蘭 氏 陰 性 的 大 腸 桿 菌 (Escherichia coli) 克 雷 伯 氏 菌 (Klebsiella oxytoca) 弗 氏 檸 檬 酸 桿 菌 (Citrobacter freundii) 綠 膿 桿 菌 (Pseudomonas aeruginosa), 則 是 以 GFB 4E 及 API 20NE (BioMérieux, Marcy l Etoile, France) 細 菌 鑑 定 系 統 對 已 純 化 的 菌 株 進 行 鑑 定 藥 物 感 受 性 試 驗 本 試 驗 是 依 照 美 國 臨 床 實 驗 室 國 家 標 準 委 員 會 (Clinical Laboratory Standard Intistitute; CLSI, 2006) 的 標 準 操 作 程 序, 以 肉 湯 微 量 稀 釋 法 (micro broth dilution) 測 定 抗 菌 劑 對 分 離 菌 株 的 最 小 抑 制 濃 度 (minimal inhibitory concentrations; MICs) [6] 預 選 擇 的 藥 物 包 括 了 市 售 乳 房 炎 軟 膏 常 用 注 射 製 劑 的 主 要 成 分 與 少 數 研 究 者 有 興 趣 的 藥 物, 這 包 含 了 : 配 尼 西 林 (penicillin) 安 比 西 林 (ampicillin) 安 默 西 林 (amoxicillin) 畜 福 (ceftiofur) 噁 唑 西 林 (oxacillin) 可 利 斯 汀 (colistin) 鏈 黴 素 (streptomycin) 健 牠 黴 素 (gentamicin) 紅 黴 素 (erythromycin) 羥 四 環 黴 素 (oxytetracycline) 恩 氟 奎 寧 羥 酸 (enrofloxacin) 氯 黴 素 (chloramphenicol) 與 西 氟 奎 寧 羥 酸 (ciprofloxacin) 常 用 抗 菌 劑 ; 此 外, 研 究 者 亦 會 依 分 離 株 的 特 性, 自 上 述 藥 品 中, 選 擇 所 需 進 行 抗 生 素 感 受 性 試 驗

3 298 The sequence of primers used for the identification of Gram (+) bacteria Name of bacteria Sequence of primer (5-3 ) Size of PCR product (bp) Reference Streptococcus agalactiae F-GGAAACCTGCCATTGCG R-TAACTTAACCTTATTAACCTAG Streptococcus dysgalactiae F-TGGAACACGTTAGGGTCG R-CTTTTACTAGTATATCTTAACTA Streptococcus uberis F-TAAGGAACACGTTGGTTAAG R-TCCAGTCCTTAGACCTTCT Staphylococcus aureus F-TCTTCAGAAGATGCGGAATA R-TAAGTCAAACGTTAACATACG Staphylococcus chromogenes F-ACGGAATATCGCTTTTAAGC R-CGTTTACATTCGGCTTTCG Staphylococcus epidermidis F-TCTACGAAGATGAGGGATA R-TTTCCACCATATTTTGAATTGT Staphylococcus hyicus F-TACGGAATATCGCCTTAGG R-AAAACATCTGTCATCCGAAG Staphylococcus simulans F-ATTCGGAACAGTTTCGCAG R-ATTGTGAGTAATCGTTTGCC Staphylococcus xylosus F-TCTTTAGAAGATGACAGAGG R-TGACTTTTAACACGACGAAG Streptococcus spp. F-TGTTTAGTTTTGAGAGGTCTTG R-CGTGGAATTTGATATAGATATTC Staphylococcus spp. F-GGAATAACGTGACATATTGTA R-TTCACTCGGTTTTGCTTGG Enterococcus faecalis F-ATCAAGTACAGTTAGTCTTTATTAG 94 4 R-ACGATTCAAAGCTAACTGAATCAGT Enterococcus faecium F-TTGAGGCAGACCAGATTGACG R-TATGACAGCGACTCCGATTCC 市 售 乳 房 炎 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 試 劑 組 MAS- TiK (MASTiK Antibiotic Susceptibility Test ImmuCell Corporation U. S. A.) 的 使 用, 則 是 依 套 組 生 產 廠 商 說 明 書 所 提 供 的 操 作 程 序 進 行 操 作 與 判 讀 結 果 針 對 國 內 中 南 部 6 個 酪 農 戶 共 366 頭 乳 牛, 以 上 述 方 法 所 採 集 的 生 乳 樣 本 共 26 件 (Table 2), 其 中 總 含 菌 生 乳 佔 39.6% (482/26) 對 上 述 分 離 株 而 言, 革 蘭 氏 陽 性 菌 的 總 分 離 株 數 (350 株 ) 遠 較 革 蘭 氏 陰 性 菌 為 多 (32 株 ), 但 兩 者 均 可 隨 機 在 各 場 不 同 的 牛 隻 出 現, 而 不 見 有 場 次 間 的 明 顯 差 異 對 各 單 一 菌 種 所 佔 的 百 分 比 而 言, 以 大 腸 桿 菌 最 高 (74 株 /482,5.3%), 次 為 Staphylococcus chromogenes (53 株 /482,.0%) 與 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (52 株 /482,0.8%), 其 他 較 多 被 分 離 到 的 陽 性 菌 則 包 括 :Staphylococcus epidermidis (4 株 /482, 8.5%) 無 乳 鏈 球 菌 (Streptococcus agalactiae;8 株 /482,3.7%) Staphylococcus haemolyticus (7 株 /482,3.5%) 糞 腸 球 菌 (Enterococcus faecalis;

4 生 乳 中 潛 在 細 菌 種 類 與 藥 物 感 受 性 株 /482,9.3%) 與 Enterococcus faecium (8 株 / 482,3.7%), 其 他 分 離 率 較 低 的 各 革 蘭 氏 陽 性 菌 的 分 離 率 詳 如 Table 2 所 列 對 革 蘭 氏 陰 性 菌 而 言, 除 大 腸 桿 菌 具 最 高 分 離 率 外, 尚 有 產 酸 克 雷 伯 氏 菌 (Klebsiella oxytoca;34 株 /482,7.%) 弗 氏 檸 檬 酸 桿 菌 (Citrobacter freundii;2 株 /482, 2.5%) 與 兩 株 伺 機 性 病 原 菌 - 綠 膿 桿 菌 (Pseudomonas aeruginosa) (Table 2) 藥 物 感 受 性 試 驗 由 於 本 調 查 從 生 乳 中 所 分 得 的 革 蘭 氏 陰 陽 性 細 菌 種 類 多 達 23 種, 且 各 個 菌 種 分 離 數 差 異 極 大, 多 者 可 達 74 株 而 最 少 者 僅 為 2 株 (Table 2), 若 對 單 一 分 離 菌 種 的 藥 物 感 受 性 試 驗 分 The species, number and percentage of isolated bacteria from 26 raw milk samples Name of bacteria Number of bacteria Percentage Streptococcus agalactiae Streptococcus bovis 9.9 Streptococcus dysgalactiae 8.7 Streptococcus uberis 5.0 Aerococcus viridans 9.9 Staphylococcus aureus Staphylococcus chromogenes 53.0 Staphylococcus epidermidis Staphylococcus hyicus 9.9 Staphylococcus simulans 5 3. Staphylococcus xylosus Staphylococcus haemolyticus Other Staphylococcus spp Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Other Enterococcus spp Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Corynebacterium efficiens Citrobacter freundii Klebsiella oxytoca Shigella boydii Proteus mirabilis Total 別 列 表, 則 將 過 於 瑣 碎 冗 長, 故 研 究 者 參 考 前 人 經 驗 [], 將 上 述 分 離 菌 株 以 臨 床 最 常 導 致 乳 房 炎 的 細 菌, 為 藥 物 敏 感 性 試 驗 歸 類 標 準, 這 包 含 了 金 黃 色 葡 萄 球 菌 鏈 球 菌 方 面 腸 球 菌 大 腸 桿 菌 與 其 他 革 蘭 氏 陽 性 與 陰 性 菌 屬 8 大 類 (Table 3 to Table 5) 試 驗 分 離 所 得 的 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus) 對 於 安 比 西 林 青 黴 素 紅 黴 素 羥 四 環 黴 素 與 氯 黴 素 均 已 具 有 高 比 率 的 抗 藥 性 ( 分 別 為 88.5% 86.5% 86.5% 78.8% 與 65.4%), 對 於 枯 草 菌 素 安 默 西 林 與 噁 唑 西 林 則 具 有 中 程 度 的 抗 藥 性 比 率 ( 分 別 為 48.% 36.5% 與 28.8%), 對 於 氟 奎 林 類 的 恩 氟 奎 林 羧 酸 與 人 用 的 ciprofloxacin 僅 有 較 低 的 抗 藥 性 比 率 ( 分 別 為.5% 與 9.6%) 其 他 79 株 葡 萄 球 菌 屬 細 菌 的 抗 藥 性 比 例, 雖 與 金 黃 色 葡 萄 球 菌 的 感 受 性 值 具 有 差 異, 但 均 略 高 或 約 略 相 似 (Table 3) 對 鏈 球 菌 而 言, 前 述 金 黃 色 葡 萄 球 菌 具 高 比 率 的 抗 藥 性 的 五 種 藥 品 ( 即 安 比 西 林 青 黴 素 紅 黴 素 羥 四 環 黴 素 與 氯 黴 素 ) 與 枯 草 菌 素, 其 所 呈 現 的 抗 藥 性 比 率 亦 相 對 具 有 高 比 例 的 抗 藥 性 ( 分 別 為 9.8% 8.6% 89.8% 7.4% 7.4% 與 65.3%), 但 對 於 安 默 西 林 恩 氟 奎 林 羧 酸 與 ciprofloxacin 則 具 有 中 至 低 抗 藥 性 比 率 ( 分 別 為 36.7% 4.3% 與 0.2%) (Table 3) 對 最 常 見 的 指 標 性 革 蘭 氏 陽 性 腸 球 菌 而 言, 其 對 所 選 藥 物 的 藥 物 感 受 性 遠 較 葡 萄 球 菌 屬 與 鏈 球 菌 屬 的 細 菌 為 高, 其 中 又 以 安 比 西 林 ( %) 與 青 黴 素 ( %) 最 為 明 顯 但 對 於 紅 黴 素 與 羥 四 環 黴 素 仍 保 持 極 高 比 例 的 抗 藥 性 ( 分 別 為 % 與 00%) 對 分 離 株 最 多 的 大 腸 桿 菌 與 其 他 陰 性 菌 而 言, 則 見 具 有 相 似 且 一 致 性 的 敏 感 性 趨 勢, 即 對 恩 氟 奎 林 羧 酸 ( %) 與 健 牠 黴 素 (77-8.%) 具 最 佳 的 感 受 性 ; 但 對 雙 氫 鏈 黴 素 與 羥 四 環 黴 素 的 抗 藥 性 比 例 為 最 高 ( 分 別 為 00% 與 %), 其 他 具 低 中 抗 藥 性 比 率 的 藥 品 與 對 細 菌 的 MIC 50 與 MIC 90 則 如 Table 5 所 列 對 市 售 乳 房 炎 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 試 劑 組 MAS- TiK 的 測 試 結 果, 則 會 因 分 離 菌 的 種 類 與 其 感 受 性 而 明 顯 有 所 不 同 即 部 份 分 離 菌 對 某 些 藥 物 可 準 確 估 計 其 感 受 性 ( 例 : 部 分 鏈 球 菌 對 紅 黴 素 ), 但 部 份 藥 物 則 會 超 出 本 抗 生 素 敏 感 性 試 驗 試 劑 組 所 包 含 的 範 圍 ( 例 : 部 分 金 黃 色 葡 萄 球 菌 對 配 尼 西 林 與 紅 黴 素 )

5 300 The MIC 50,MIC 90 and the percentage of resistance of spp. and spp. for ten preselected antimicrobials Streptococcus spp. (n = 49) Staphylococcus aureus (n = 52) other Staphylococcus spp. (n = 67) Amoxicillin Ampicillin Bacitracin Penicillin Oxicillin *** Erythromycin Oxytetracycline Enrofloxacin Ciprofloxacin Chloramphenicol The MIC 50,MIC 90 and the percentage of resistance of spp. for nine pre-selected antimicrobials Enterococcus faecalis (n = 45) Enterococcus faecium (n = 8) other Enterococcus spp. (n = 9) Ampicillin Penicillin Oxicillin *** 8 28 *** *** Ceftiofur Erythromycin Oxytetracycline Enrofloxacin Ciprofloxacin Gentamicin 討 論 本 次 試 驗 中, 於 收 集 的 26 個 生 乳 樣 本 中, 共 有 482 個 樣 本 (39.6 %) 含 菌 上 述 分 離 率 的 結 果 若 與 劉 (2002 年 ) 及 趙 (997 年 ) 的 研 究 結 果 比 較 得 知 : 劉 人 的 分 離 率 高 達 73%, 此 結 果 遠 高 於 本 次 調 查 所 見, 造 成 上 述 差 異 的 主 要 原 因 為 劉 人 是 針 對 頑 固 性 細 菌 性 乳 房 炎 病 例 進 行 細 菌 分 離, 故 獲 得 如 此 高 的 分 離 率 亦 不 足 為 奇 [,2] 反 觀 趙 人 的 研 究 條 件, 其 亦 是 針 對 生 乳 樣 本 進 行 採 樣, 結 果 顯 示 有 菌 性 乳 房 炎 分 離 率 為 5.4% 本 次 試 驗 主 針 對 乳 牛 場 外 表 健 康 的 乳 牛 進 行 採 樣 調 查, 此 採 樣 條 件 與 莊 人 的 採 樣 條 件 較 為 相 似 又 於 每 一 個 採 樣 場, 或 多 或 少 均 可 見 到 含 菌 生 乳 樣 本, 故 場 分 離 率 為 00% 此 一 結 果 當 然 可 能 會 被 質 疑 肇 因 於 污 染, 但 若 反 推 之, 約 60% 的 生 乳 樣 本 中 為 無 菌, 因 此, 採 樣 前 的 消 步 驟 與 採 樣 中 的 小 心 操 作 ( 避 免 碰 觸 管 壁 ) 手 續 均 應 屬 有 效 此 外, 綠 膿 桿 菌 與 變 形 桿 菌 環 境 中 常 見 的 污 染 菌 分 離 菌 株 數 均 低, 更 證 明 其 應 非 來 自 污 染

6 生 乳 中 潛 在 細 菌 種 類 與 藥 物 感 受 性 30 and other gram-negative bacteria for nine pre-se- The MIC 50,MIC 90 and the percentage of resistance of lected antimicrobials E. coli (n = 74) Other G (-) bacteria (n = 58) Ampicillin Colistin Ceftiofur Ceftriaxone Oxytetracycline Enrofloxacin Ciprofloxacin Streptomycin Gentamicin 細 菌 性 乳 房 炎 又 可 以 分 為 : 傳 染 性 環 境 性 與 伺 機 性 三 種 病 原 菌, 傳 染 性 病 原 菌 主 要 以 金 黃 色 葡 萄 球 菌 與 無 乳 鏈 球 菌 為 主, 環 境 性 病 原 菌 則 包 括 了 大 腸 桿 菌 與 乳 房 鏈 球 菌 (Streptococcus uberis) [0,,7,8,9]; 在 本 次 調 查 中, 以 環 境 性 大 腸 桿 菌 分 離 率 最 高 (74/482,5.4%), 其 次 為 Staphylococcus chromogenes (53/482,.0%) 與 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (52/482,0.8%), 此 結 果 與 劉 人 於 2002 年 研 究 所 得 結 果 約 略 相 似 [] 但 若 將 所 有 分 離 菌 以 菌 屬 為 最 低 劃 分 標 準 時, 對 分 離 率 而 言, 則 會 見 不 同 的 排 序, 即 由 多 而 少 的 順 序 為 葡 萄 球 菌 屬 > 腸 球 菌 屬 > 大 腸 桿 菌 > 鏈 球 菌 屬 > 與 其 他 革 蘭 氏 陰 性 菌 屬 此 外, 雖 然 於 分 離 株 中 可 見 Corynebacterium efficiens Klebsiella oxytoca Shigella boydii 不 同 的 革 蘭 氏 陽 性 或 陰 性 菌, 由 已 發 表 的 文 獻 中 得 知, 其 雖 可 引 起 各 種 不 同 的 系 統 性 感 染, 但 並 未 查 到 上 述 細 菌 在 乳 牛 引 起 乳 房 炎 的 相 關 報 告 故 對 上 述 細 菌 的 存 在 與 乳 房 炎 間 的 確 實 因 果 關 係, 需 要 更 近 一 步 的 研 究 細 菌 性 乳 房 炎 的 感 染 菌 對 治 療 用 藥 的 感 受 性, 成 為 影 響 療 效 的 首 要 因 素 市 售 含 抗 菌 劑 的 乳 房 炎 軟 膏 種 類 主 要 成 分 包 括 : 四 環 素 類 ( 四 環 黴 素 與 羥 四 環 黴 素 ) 胺 基 醣 類 ( 新 黴 素 與 雙 氫 鏈 黴 素 ) 乙 內 醯 胺 與 頭 孢 子 素 類 ( 安 比 西 林 青 黴 素 安 默 西 林 氯 噁 唑 西 林 雙 氯 噁 唑 西 林 cefuroxime 與 cephapirin) 與 枯 草 菌 素 由 本 次 分 離 菌 株 進 行 藥 物 感 受 性 試 驗 結 果 發 現, 金 黃 色 葡 萄 球 菌 對 於 安 比 西 林 青 黴 素 羥 四 環 黴 素 與 枯 草 菌 素 均 已 具 有 高 抗 藥 性 比 例 ; 相 同 情 形 亦 見 於 無 乳 鏈 球 菌 與 其 他 鏈 球 菌 環 境 性 細 菌 - 大 腸 桿 菌 對 於 安 比 西 林 可 利 斯 汀 畜 福 ceftriaxone 鏈 黴 素 抗 菌 劑 亦 具 有 中 至 高 抗 藥 性 比 例 雖 然 各 場 次 間 的 抗 藥 性 情 形 不 盡 相 同, 但 若 由 上 述 感 受 性 結 果 仍 可 輕 易 推 知, 一 般 常 用 的 乳 房 炎 軟 膏, 現 可 能 已 無 法 達 到 預 期 的 療 效, 而 需 要 增 加 使 用 劑 量 或 更 換 種 類 才 能 達 到 治 療 效 果, 相 對 而 言, 增 加 劑 量 的 方 式 不 但 會 增 加 治 療 支 出 外, 同 時 亦 會 增 加 停 藥 期 與 增 強 抗 生 素 選 擇 性 壓 力 與 / 或 未 來 抗 藥 性 產 生 的 風 險, 而 更 需 在 獸 醫 師 ( 佐 ) 的 診 治 下 進 行 另 由 感 受 性 結 果 得 知, 恩 氟 奎 林 羧 酸 ( 與 健 牠 黴 素 對 革 蘭 氏 陰 性 菌 ) 對 所 有 分 離 菌 仍 均 保 持 良 好 的 感 受 性, 這 可 能 是 因 為 臨 床 上 多 為 注 射 劑 型, 使 用 不 若 乳 房 灌 注 劑 型 為 方 便, 故 較 少 使 用 所 至 但 也 因 恩 氟 奎 林 羧 酸 主 為 注 射 而 非 乳 房 灌 注 劑 型 且 被 建 議 用 於 乾 乳 期, 故 若 一 定 需 要 使 用 時, 其 乳 汁 去 棄 期 將 更 需 注 意 又 因 國 內 研 究 者 多 著 重 金 黃 色 葡 萄 球 菌 的 研 究 與 感 受 性 試 驗, 故 若 要 以 本 次 結 果 與 國 內 相 似 調 查 且 已 發 表 的 論 文 進 行 比 較 [], 亦 僅 能 比 較 此 菌 與 共 同 測 試 過 的 相 同 抗 菌 劑 ; 由 本 次 分 離 菌 株 進 行 藥 物 感 受 性 試 驗 結 果 發 現, 金 黃 色 葡 萄 球 菌 對 於 安 比 西 林 與 青 黴 素 與 羥 四 環 黴 素 的 抗 藥 性 比 例, 均 較 以 往 提 高 約 5-20%, 此 應 明 顯 與 長 期 使 用 及 選 擇 性 壓 力 相 關 若 對 單 一 牧 場 內 金 黃 色 葡 萄 球 菌 分 離 株 較 多 的 場 進 行 該 菌 感 受 性 值 的 比 較 ( 於 結 果 中 未 單 獨 標 示 ), 結 果 發 現 各 分 離 菌 株 的 感 受 性 值 多 均 極 相 似, 此 結

7 302 果 應 是 代 表 場 內 有 相 同 單 一 型 態 金 黃 色 葡 萄 球 菌, 於 場 內 環 境 或 個 體 間 進 行 散 播 感 染 所 致 至 於 推 究 造 成 原 因, 則 可 能 是 由 於 金 黃 色 葡 萄 球 菌 所 引 起 乳 房 炎 常 為 亞 臨 床 型 乳 房 炎, 乳 房 外 觀 與 乳 汁 於 肉 眼 下 觀 察 並 無 異 常, 所 以 場 內 散 播 較 容 易 被 忽 視 所 致 此 外, 本 菌 亦 可 為 體 表 常 在 菌 之 一 且 極 易 存 在 於 環 境 中, 所 以 藉 由 不 同 的 機 械 性 媒 介 或 動 物 直 接 接 觸 而 散 播, 亦 可 能 為 重 要 原 因 之 一 另 由 此 結 果 亦 可 旁 證 牧 場 內 環 境 及 榨 乳 設 備 清 潔 衛 生 與 消 工 作 的 重 要 性 由 採 樣 過 程 口 頭 詢 問 的 結 果 得 知, 酪 農 戶 在 初 見 乳 房 炎 的 症 狀 時, 雖 會 延 請 獸 醫 師 ( 佐 ) 進 行 診 療, 但 不 論 處 理 方 式 為 何, 均 很 少 會 將 治 療 前 後 的 乳 汁 樣 本, 主 動 送 交 地 方 防 疫 機 關 或 學 術 單 位 的 實 驗 室, 進 行 病 原 分 離 與 藥 物 感 受 性 試 驗 ; 另 一 方 面, 因 為 採 樣 過 程 會 影 響 集 乳 時 間 與 乳 牛 泌 乳 量, 所 以 酪 農 戶 多 無 進 行 大 規 模 例 行 性 採 樣 送 檢 的 意 願 至 於 國 內 大 動 物 獸 醫 師 人 數 較 少, 亦 為 國 內 並 未 見 定 期 性 大 規 模 地 調 查 或 較 少 見 病 例 報 告 的 原 因 之 ㄧ 另 實 際 購 買 自 國 外 進 口 且 可 自 行 快 速 操 作 的 乳 房 炎 抗 生 素 感 受 性 試 驗 試 劑 套 組 MASTiK 進 行 測 試, 探 討 該 產 品 在 我 國 的 適 用 性 由 產 品 說 明 書 得 知, 其 所 含 抗 菌 劑 的 濃 度 如 下 :erythromycin ( g/ml) oxacillin ( g/ml) ampicillin ( g/ml) penicillin ( g/ml) cephalothin ( g/ml) pirllmycin ( g/ ml) oxytetracycline ( g/ml) sulfadimethoxine ( g/ml) 若 與 本 次 以 微 量 肉 湯 稀 釋 法 的 試 驗 結 果 比 較, 以 金 黃 色 葡 萄 球 菌 為 例, 對 於 penicillin (4 g/ml) erythromycin (32 g/ml) 與 oxytetracycline (64 g/ml) 的 MIC 50 值, 均 超 過 套 組 所 標 示 的 有 效 範 圍 以 鏈 球 菌 為 例 :ampicillin (6 g/ml) penicillin (6 g/ml) oxacillin (32 g/ml) erythromycin (4 g/ml) 與 oxytetracycline (32 g/ml) 的 MIC 50 值 亦 多 超 過 套 組 所 所 標 示 的 有 效 範 圍 故 對 此 二 菌 而 言, 超 過 50 % 的 分 離 菌 無 法 以 此 套 組 測 試 所 需 的 抗 菌 劑 濃 度 而 大 腸 桿 菌 方 面 ampicillin (28 g/ml) 與 oxytetracycline (256 g/ml) 亦 有 相 同 情 況 發 生 另 由 本 試 驗 中 的 藥 物 敏 感 性 試 驗 結 果 得 知, 部 分 藥 物 如 增 加 劑 量, 即 可 達 到 治 療 的 效 果, 但 部 份 藥 物 幾 乎 完 全 無 效, 而 進 口 套 組 中 所 含 藥 物 濃 度 多 偏 低, 篩 選 能 力 有 限, 故 自 行 設 計 與 發 展 符 合 我 國 現 況 的 藥 物 敏 感 性 試 驗 套 組, 確 有 其 必 要 性 總 之, 由 本 調 查 結 果 得 知, 外 表 健 康 乳 牛 生 乳 中 含 菌 量 約 佔 採 樣 數 三 分 之 ㄧ 強, 分 離 株 對 乳 房 炎 常 用 治 療 藥 品 的 抗 藥 性, 在 場 次 間 常 明 顯 不 同, 因 此, 適 當 的 藥 物 感 受 性 試 驗 或 場 內 定 期 的 監 測, 均 將 有 助 於 細 菌 性 乳 房 炎 的 預 防 與 治 療 此 外, 發 展 適 合 我 國 現 況 的 藥 物 敏 感 性 試 驗 套 組, 實 有 其 必 要 性 致 謝 作 者 除 要 感 謝 王 郁 菁 孫 友 梅 中 興 大 學 莊 士 德 老 師 研 究 室 同 學 與 曾 參 與 本 次 調 查 的 酪 農 場 外, 並 要 感 謝 行 政 院 農 業 委 員 會 動 植 物 防 疫 檢 疫 局 提 供 研 究 經 費 參 考 文 獻. 劉 世 賢 施 閔 郡 劉 炳 燦 黃 森 源 吳 虹 惠 余 明 德 廖 明 輝 乳 牛 乳 房 炎 細 菌 分 離 鑑 定 及 藥 物 敏 感 性 試 驗 中 華 民 國 獸 醫 學 會 暨 台 灣 省 畜 牧 學 會 9 年 度 聯 合 學 術 發 表 會 P35, 趙 瑞 龍 楊 忠 亮 董 好 德 張 登 欽 台 灣 中 部 地 區 乳 牛 潛 在 性 乳 房 炎 調 查 中 華 獸 醫 誌 23: 6-65, Barkema HW, Schukken YH, Lam TJ, Beiboer ML, Wilmink H, Benedictus G, Brand A. Incidence of clinical mastitis in dairy herds grouped in three categories by bulk milk somatic cell counts. J Dairy Sci 8: 4-49, Bradley A. Bovine mastitis: An evolving disease. Vet J 64: 6-28, Chagunda MG, Larsen GT, Bjerring M, Ingvartsen KL. L-lactate dehydrogenase and N-acetyl- -D-glucosaminidase activities in bovine milk as indicators of non-specific mastitis. J Dairy Res 73: , Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Document M7-A7. Wayne, PA, Erskine RJ, Kirk JH, Tyler JW, DeGraves FJ. Advances in the therapy for mastitis.vet Clin North Am Food Anim Pract 9: , Forsman P, Tilsala-Timisjärvi A, Alatossava T. Identification of staphylococcal and streptococcal causes of bovine mastitis using 6S-23S rrna spacer regions. Microbiology 43: , Gröhn, YT, Wilson DJ, González RN, Hertl JA, Schulte H, Bennett G, Schukken YH. Effect of pathogenspecific clinical mastitis on milk yield in dairy cows. J Dairy Sci 87: , Hogan JS, Smith KL. Coliform mastitis. Vet Res 34: , Hogan JS, Weiss WP, Smith KL, Todhunter DA, Schoenberger PS, Sordillo LM. Effects of an J5 vaccine on mild clinical coliform mastitis. J Dairy Sci 78: , 995.

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9 304 Investigation the Species of Bacteria within Raw Milk and Their Susceptibility for Therapeutic Antimicrobials in Middle and Southern Taiwan Shian-Jyue DU, Hung-Chih KUO, 2 Shih-Te CHUANG, 2 Chi-Chung CHOU, Andrew C. Y. FEI, * Shao-Kuang CHANG 2 (Received: April 2, 200. Accepted: May 24, 200)