目前 ASAP 技术的研究应用有大气颗粒中二次有机气溶胶的鉴定 [7] 麦角甾醇生物合成抑制剂分析 [8] 烟土中吗啡等天然产品分析 [9] 菠菜中类胡萝卜素的鉴定 [10] 稻米中甲氧基丙烯酸酯类化 [6] [11] 合物的检测与离子迁移谱联用鉴定聚丙烯聚合物等, 但目前基本都限于在定性上的应

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握韵邢
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1 [ 应用纪要 ] 黄宝勇农业部农业环境质量监督检验测试中心 ( 北京 ), 北京市农业环境监测站, 农业部农产品质量安全风险评估实验室 ( 北京 ), 北京关键词大气压固体分析探头离子源, 串联质谱, 农药残留, 快速测定摘要将大气压固体分析探头电离源 (Atmospheric Pressure Solids Analysis Probe, ASA P) 与三重四级质谱仪耦合, 在无需净化浓缩等前处理无需色谱分离的条件下, 建立了蔬菜中多种类农药残留直接质谱分析方法, 单个样品仅需 0.5 min 针对常压直接分析质谱易受环境影响和上样精度差的弊端, 对 ASA P 电离源条件如脱溶剂气温度电晕放电电流以及样品溶液组成进样模式等进行了优化 ; 采用多反应监测扫描 (MRM), 产物离子丰度比定性, 内标标准曲线法定量 ; 对韭菜油菜和芹菜三种基质进行了基质效应考察, 表明存在明显的基质效应方法在 5.0 μg/l~500 μg/l 范围线性相关系数均高于 0.995, 检出限为 0.04~0.89 μg/kg, 精密度 (RSD,n=7) 为 5.1%~13.0% 与超高效液相色谱 - 电喷雾串联质谱法对实际样品的检测结果比较表明,ASAP-MS/MS 检出结果与其一致该方法分析速度快灵敏度高, 且不需要有机溶剂, 结果可靠, 可应用于大批量农药残留筛查和应急监测任务蔬菜中农药残留超标事件不时发生, 如海南豇豆超标事件毒韭菜事件草莓膨大剂事件等等因此, 为了更好地确保人们健康和农业效益的提高, 必须加强对农产品中农药残留快速检测方法的研究和应用蔬菜质量安全应急事件的发生不但考验有关部门的管理能力也对检测机构快速分析手段提出了更高要求 [1-2] 常规的农药残留检测方法有色谱法色谱质谱联用法等, 但这些方法的样品前处理要求提取净化浓缩等过程繁琐, 并且需要进行色谱分离方法优化, 耗时长常温常压直接分析质谱技术为近年来研 [3-5] 究热点为此, 本文采用了一种新型离子化技术大气压固体分析探头 (ASAP) 电离源与三重四级质谱仪耦合进行检测 ASAP 是一种热解析常压直接离子化分析技术, 无需复杂前处理或色谱分离, 是目前能 [6] 与多数质谱仪联用的已经商业化的离子化设备之一, 该技术极其显著的特征是快速, 一个样品最快 30 秒钟完成出峰, 不需净化浓缩和色谱分离, 无需流动相, 操作简便

2 目前 ASAP 技术的研究应用有大气颗粒中二次有机气溶胶的鉴定 [7] 麦角甾醇生物合成抑制剂分析 [8] 烟土中吗啡等天然产品分析 [9] 菠菜中类胡萝卜素的鉴定 [10] 稻米中甲氧基丙烯酸酯类化 [6] [11] 合物的检测与离子迁移谱联用鉴定聚丙烯聚合物等, 但目前基本都限于在定性上的应用 [6] Fussell 等对 ASAP 在食品中化合物检测中的应用进行了评估, 认为能用于直接定性筛查分析, 但由于进样精度等问题使用 ASAP 进行定量非常困难目前关于应用 ASAP 对蔬菜中多种农药残留定性及定量研究的报道尚不多见本文将重点针对直接分析质谱定量能力差的特点, 通过优化 ASAP 参数条件改进进样方式和定量校正方式等措施, 以期建立简便快速灵敏高通量环境友好的农药残留快速检测方法, 同时对基质效应进行了评价实验部分 1.1 试剂与仪器 Xevo TQ-S 三重四极杆质谱仪, 大气压固体分析探头离子源 (ASAP),MassLynx 4.1 工作站 ( 美国 Waters 公司 );T-25 高速均质匀浆器 ( 德国 IKA 公司 );Vortex-Genie 2 漩涡混合器 ( 美国 Scientific Industries);Genius 瓶口移液器 (5~50 ml,10~100 ml, 德国 VITLAB 公司 );Eppendorf Research 移液器 (0.5~10 µl 10~100 µl 100~1000 µl); 封端的毛细熔点管 (100 mm 1.5~2.0 mm O.D.), 0.22 µm 滤膜 ( 美国 Waters 公司 ); 乙腈丙酮甲醇 ( 色谱纯, 美国 Honeywell Burdick & Jackson 公司 ) NaCl ( 分析纯, 北京化学试剂公司 ); 苯醚甲环唑哒螨灵毒死蜱除虫脲灭幼脲辛硫磷吡虫啉三羟基克百威啶虫脒克百威氧乐果嘧霉胺多菌灵和抗蚜威标准品购自农业部环境保护科研监测所, 均为 1000 mg/l 1.2 试验过程样品溶液的制备 : 准确称取 10.0 g 试样, 加入 10.0 ml 乙腈在匀浆机中高速匀浆 2 min, 然后抽滤, 滤液进入事先加有 4~5 g 氯化钠的具塞量筒中, 充分震荡, 静置 15 分钟, 取上层乙腈提取液, 转溶于甲醇, 无需过 0.22 µm 滤膜, 直接作为待测液, 并加入相应浓度的内标物 ASAP 质谱条件 : 将仪器设置为 ASAP 正离子模式, 离子源温度 150 ; 样品锥孔电压 30 V; 电晕针电流 5 µa; 脱溶剂气温度 450 ; 脱溶剂气流速 1000 L/H 其他条件见表 1 2

3 表 1. 各农药化合物 MRM 定性离子相对丰度及质谱参数化合物母离子 (m/z) 子离子 (m/z) 相对丰度碰撞能 (ev) 锥孔电压 (V) 苯醚甲环唑 * 哒螨灵 * 毒死蜱 * 除虫脲 * 灭幼脲 * 辛硫磷 * 吡虫啉 * 抗蚜威 (IS) * 羟基克百威 * 啶虫脒 * 克百威 * 氧乐果 * 嘧霉胺 * 多菌灵 * 上样操作 ASAP 分为内部探头和外部组件, 按住外部组件上的密封杆, 取下内部探头, 将毛细管末端浸入或蘸取样品溶液, 或使用精密移液器向毛细管末端加入 1 μl, 然后将内部探头完全插入中央腔体, 大概 30 秒后即完成分析注意毛细管要插到底上样时确保毛细管末端不与外部组件的部件接触携带样品的 ASAP 探头插于质谱离子源的源体内, 热的气流使样品快速脱附, 经电晕放电离子化产生质子化离子, 进入质谱进行分析 ( 图 1) 3

4 图 1. 大气压固体分析探头源 (ASAP) 技术示意图结果与讨论 2.1 ASAP 方法的优化电晕针放电电流对峰面积的影响 ASAP 离子化是基于电晕针放电进行电离, 不同的电流强度会对离子化产生影响分别考察了 3 µa 5 µa 7 µa 对农药峰面积的影响, 每个样品重复进样三次,RSD 范围在 3.4%~34.4% 如图 2 所示, 明显 5 µa 响应值最大, 因此确定放电电流为 5 µa 图 2. 电晕针放电电流对峰面积的影响 (50 μg/l) 4

5 2.1.2 脱溶剂气温度对化合物出峰的影响脱溶剂气温度参数是需要优化评价的重要参数之一, 较高的温度会促进待测物分子的气化提高灵敏度和峰形分别考察了和 450 五种脱溶剂气温度条件对农药出峰的影响试验显示 ( 图 3), 不同温度对峰面积的影响很小, 但对峰形影响较大,450 峰形最优, 容易积分定量, 可有效提高方法的灵敏度和定量能力故选择脱溶剂气温度为 450 图 3. 脱溶剂气温度对色谱峰型的影响不同进样措施对峰面积相对标准偏差的影响 ASAP 采用玻璃毛细管直接进样, 不需要色谱分离, 进样精度相比液相较差, 为提高进样精度和定量可靠性, 试验考察了三种方式对连续 7 次进样农药峰面积相对标准偏差 (RSD) 的影响一种是厂家推荐的将毛细管末端浸入或蘸取样品溶液的方式 ; 另一种是使用微量移液器在毛细管末端进样 1 微升的方式 ; 第三种是采用内标法进行校正结果表明 ( 见图 4), 蘸取进样 RSD 在 25%~35%, 使用移液枪上样 RSD 在 20% 左右, 而使用内标校正后 RSD 基本在 10% 以下, 对直接进样质谱分析来说达到了比较满意的效果 5

6 Dip in With pipette By internal standard RSD, % Difenoconazole Pyridaben Chlorpyrifos Diflubenzuron Chlorbenzuron Phoxim Imidacloprid 3-Hydroxycarbofuran Acetamiprid Carbofuran Omethoate Pyrimethanil Carbendazim 图 4 不同上样方式等措施对峰面积相对标准偏差的影响 (n=7) 根据本试验的待测物情况, 选择以抗蚜威作为内标, 基于三个原因, 1. 该化合物属于氨基甲酸酯类农药, 含有二甲基嘧啶, 分子量 238, 化学性质与待测目标物相似 ; 2. 抗蚜威的 ASAP 离子化质谱信号响应较高, 易定性定量 ; 3. 在蔬菜样品的常规检测中, 很少被检出, 定量不易被干扰 2.2 ASAP-MS/MS 定性分析本研究是针对多种化合物的检测, 由于没有色谱分离, 样品基质中易挥发组分也会形成堆积峰, 一级质谱母离子信号也可由样品中的基质或杂质带入, 因此选择各目标化合物的两对特征二级碎片离子来进行定性, 以排除假阳性误差这种方法也满足欧盟的一个分析物确证至少要达到 4 分的定性要求, 即母离子 1 分, 两个子离子各 1.5 分如果干扰物也同时具有这两对离子对, 那么将根据样品中子离子丰度比的偏差范围是否在合理范围内来确定, 至少应满足欧盟定 [12] 性确证时相对离子丰度的最大允许相对偏差有关规定选择离子丰度比偏差较大的辛硫磷为例, 如图 5 所示, 在 8.89 min 与 min 处分别是辛硫磷标准的 MRM 离子峰, 第一个标准峰子离子与的离子丰度比为 35.4%, 第二个标准峰相应为 43.5%; 两个标准间离子丰度比的相对偏差为 10.3%, 符合表 2 中 25% 的要求 min 处为样品峰, 与的离子丰度比为 846%, 其与标准峰的相对偏差大于 2000%, 远大于 25% 的最大允许偏差, 判断为假阳性 6

7 Analyte Interferent 299>129 (Phoxim) 299>97 (Phoxim) t/min 图 5. 采用离子对丰度比排除干扰物假阳性结果 2.3 ASAP-MS/MS 的瞬时升温效应 ASAP-MS/MS 技术因不需色谱分离过程, 理论上目标物与样品基质同时出峰, 对目标物的鉴定造成严重干扰而影响该技术的应用, 然而, 不同农药目标物因选择离子的不同, 被干扰情况也不尽相同, 如图 6, 即使有干扰物比较多的情况, 也会因目标物与基质组分的错开出峰而相应避免误判情况的发生这也是该技术的优势之一当进样探头载入样品后, 插入质谱过程会有一个快速梯度升温的过程, 而使农药类小分子化合物成功与基质组分中大部分化合物分开 sample matrix- curve4 100 % matrix- curve4 2: MRM of 2 Channels API TIC (Pyrimethanil) e % : MRM of 2 Channels API+ TIC (carbofuran) 1.95e Time 图 6. 痕量目标物在复杂基质干扰物中的分离 7

8 2.4 ASAP-MS/MS 定量性能考察方法的线性范围检出限和定量限直接质谱分析受环境和上样精度的限制, 导致定量的准确度与精密度较差, 原因主要是在常温常压环境下离子化过程的稳定性不如传统离子化方式, 另外上样量的差异也会影响精密度, 故其定量结果为半定量结果本实验通过改进 ASAP 参数进样方式, 用内标法补偿进样量的差异, 来提高定量能力试验对 ASAP 源结合串联质谱的定量能力进行了考察用甲醇配制浓度为和 500 μg/l 的系列混合标准溶液, 以抗蚜威为内标, 使其浓度为 50 μg/l 采用内标法对待测组分进行定量, 以不同浓度标准溶液中的待测物和内标物的峰面积之比为纵坐标, 标准溶液浓度为横坐标, 建立标准曲线 ; 根据线性最低点浓度色谱峰按照 3 倍信噪比 ( 峰对峰 ) 确定化合物的检出限 (LOD), 按照 10 倍信噪比确定化合物的定量限 (LOQ), 并计算 5 μg/l 重复进样 7 次的 RSD 各目标物在 5 μg/l-500 μg/l 浓度范围内线性关系良好,R 2 均高于 0.995, 说明该方法线性范围可靠样品中各化合物的 LODs 为 0.04~0.89 μg/kg,loqs 为 0.12~2.95 μg/kg,rsd 范围 5.1~13.0%, 具有较高的灵敏度和精密度, 足以满足粗定量的要求 ( 见表 2) 表 2. 各农药化合物线性方程 R 2 检出限及定量限 Compound Concentration range(μg/l) Regression equation LOD R2 (μg/kg) LOQ RSD* (μg/kg) (%,n=7) Difenoconazole 5~500 y = x Pyridaben 5~500 y = x Chlorpyrifos 5~500 y = x Diflubenzuron 5~500 y = x Chlorbenzuron 5~500 y = x Phoxim 5~500 y = 0.206x Imidacloprid 5~500 y = x Hydroxycarbofuran 5~500 y = x Acetamiprid 5~500 y = x Carbofuran 5~500 y = x Omethoate 5~500 y = x Pyrimethanil 5~500 y = x Carbendazim 5~500 y = x 基质效应 [13] 在传统液质方法中,ESI 电离源产生的基质效应比 APCI 源要普遍, 因此基于 APCI 的 ASAP 源应该会比其他喷雾型的直接离子化技术基质效应要弱一些但没有色谱分离过程可能又会使大量基质 [14] 成分影响待测物的离子化效率有两种评价基质效应的方法, 简单的一种是相对响应值法, 即样品基质中添加的农药响应值与在纯溶剂中相同含量农药的响应值百分比 ; 另一种是比较不同基质标准曲线的斜率, 本试验采用后者实验考察了芹菜油菜韭菜三种基质对 ASAP-MS/MS 的定量能力的影响分别用空白样品提取液配制浓度为和 500 μg/l 的系列标准溶液, 与上节相同方法建立标准曲线结果表明, 不同基质中标准曲线的斜率会有一定差 8

9 距, 也即存在基质效应, 不同农药间也有差异图 7 为灭幼脲在三种蔬菜基质及甲醇溶剂中标准曲线的对比因此, 本方法使用中应该考虑基质效应, 可以进行基质匹配校正或者进行样品稀释来减少定量误差灭幼脲 Relative Relative intensity(%) (%) Concentration(ng/mL) Methanol Celery Rape Leek Methanol 线性 (Rape) 线性 (Celery) 线性 (Leek) 图 7. 灭幼脲在甲醇溶剂韭菜油菜芹菜基质中标准曲线指纹图谱 2.5 实际样品测定为了验证本方法的适用性, 对一批蔬菜样品进行了快速测定, 并同时采用传统的超高效液相色谱串联质谱仪 (UPLC-MS/MS) 对结果进行了对比结果显示, 在 10 个检出样品中, 涉及 10 种农药被累计检出 17 频次, 除 2 号样品辛硫磷浓度较低没有明显出峰外, 其他 ASAP 质谱检出结果与 UPLC-MS/MS 检出一致 ; 其中 5 个样品中 5 种农药残留量超过国家限量标准 (GB ), 分别为克百威氧乐果和毒死蜱 ( 见表 3) 图 8 为芹菜样品中氧乐果检出与空白样品对照色谱图表 3. 实际样品 ASAP-MS/MS 定量检测结果与 UPLC-MS/MS 检测结果对照 Sample Pesticide Results(mg/kg) Found by UPLC-MS/MS Found by ASAP-MS/MS MRL(mg/kg) TX22 Carbendazim B2 Carbofuran B27 Imidacloprid Pyridaben H35 Chlorpyrifos H28 Pyrimethanil Carbendazim Q20 Carbofuran HG9 Carbofuran Q2 Omethoate

10 Positive sample Positive sample Standard Blank sample Blank sample % Time 图 8. 实际样品农药检出 MRM 图与空白样品对比图 ( 氧乐果 ) 结论大气压固体分析探头串联质谱技术 (ASAP), 为质谱法分析筛选农药残留提供了一种快速低耗的方法在蔬菜复杂基质条件下, 无需复杂的样品前处理及色谱分离和条件优化, 快速定性定量分析 13 种农药, 经 UPLC-MS/MS 方法验证结果可靠, 且仪器运行不需要有机溶剂, 环境友好, 分析速度快, 每个样品目标峰在 30 s 即可完成, 同时, 还将该方法用于实际样品检测, 验证方法的可行性, 满足农药残留快速检测及定量的要求, 有望在大批量农产品安全或食品安全风险筛查以及现场检测方面发挥重要作用 10

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