<4D F736F F D204C432D4D534D53B7A8B2E2B6A8CAB3C6B7D6D0B5C4CBD5B5A4BAEC2E646F63>

Size: px

Start display at page:

Download "<4D F736F F D204C432D4D534D53B7A8B2E2B6A8CAB3C6B7D6D0B5C4CBD5B5A4BAEC2E646F63>"

杆晟轶宓
7 years ago
Views:

1 LC-MS/MS 法测定食品中的苏丹红蔡增轩钱欣王怡超任一平浙江省疾病预防控制中心中国浙江省杭州 309 摘要 : 本文应用电喷雾串联四极杆质谱法测定食品中的苏丹红样品经均质, 乙腈超声波提取, 用 Waters Sunfire TM C18 Column( 5µm, mm) 分离,0.1 甲酸的乙腈溶液和 0.1 甲酸的水溶液 (90/10,V/V) 作流动相, 经 MS/MS 检测定性和定量四种苏丹红在 0.4~ 20.00μg/mL 的线性范围内,r 2 均大于 0.999, 平均回收率大于 92, 日内重复取样测定,4 种物质的 RSD 分别为日间重复取样测定, 四种物质的 RSD 分别为 , 最低检出限 (LOQ) 分别达到为 0.05 ng/ml 0.08 ng/ml 0.45ng/mL 和 0.13ng/mL 该方法灵敏度高, 重现性和选择性好, 易于操作, 是检测食品中苏丹含量之有效确认和定量方法 Determination of Sudan Dyes in Foods by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Cai Zengxuan Qian Xin Wang Yichao Ren Yiping Zhejiang Provincial Center for Disease Prevention and Control,Hangzhou 309 Abstract A HPLC-MS/MS method was developed for the determination of sudan dyes in foods. After homogenisation, the sample was extracted with acetonitrile in ultrasonic bath. LC analysis was performed on a Sunfire MS C18 ( mm I.D., 5µm) column, 0.1 formic acid acetonitrile and 0.1 formic acid water was used as mobile phase with the ratio of 90 to 10. The limits of quantification (LOQ) were 0.05, 0.08, 0.45, 0.13ng/mL respectively. The linear ranges were from 1 to 20μg/mL with correlation coefficients of The mean recoveries were above 92. This method can validly quantify the sudan dyes in food for its high sensitivity and high selectivity. Keywords HPLC-MS/MS, Sudan Dye, 关键词 : 电喷雾串联四极杆质谱法苏丹红 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 号苏丹红是应用于诸如汽油, 柴油, 润滑剂, 聚合染料, 油彩, 蜡, 地板蜡和香皂等化工产品中的一种非生物合成着色剂, 一般不溶于水而易溶于有机溶剂苏丹染色剂中, 无论是 I 号 II 号 III 号, 还是 IV 号, 都含有偶氮苯, 当偶氮苯被降解后, 就会产生苯胺, 这是一种中等毒性的致癌物过量的苯胺被吸入人体, 可能会造成组织缺氧, 呼吸不畅, 引起中枢神经系统心血管系统和其他脏器受损, 甚至导致不孕症苏丹红 I 不属于 1995 欧盟食品法规中允许使用的颜料 [10] 它被认为是一种有基因毒性的致癌物质, 不允许在食品中以任何目的和水平出现

2 图 1 四种苏丹红结构图目前, 食品中苏丹红的常用测定方法为液相色谱紫外光检测法该方法已列入国家标准并于 2005 年 3 月 29 日起实施. 但该法在定性确证方面还存在一定的局限性. 本实验的目的是建立一种高灵敏度的, 高选择性的, 精确的 LC-ESI-MS/MS 的方法来同时确认和测定食品中的苏丹红 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 方法学确认方案包括检出限, 定量限, 线性范围, 精确度 ( 日内精密度和日间精密度 ), 回收率和选择性 1 实验部分 1.1 仪器液质联用串联四极杆质谱仪 :2695 Alliance HPLC 系统 (Waters,USA);(Waters,USA), 质谱检测器 :Micromass*-Quattro Ultima Pt; 高速离心机 (Bcekman 公司,Avanti TM J-20xp 型 ); 氮气吹干仪 ; 均质机 ; 摇床振荡器 ;milli-q 超纯水纯化系统 (Millipore 公司 ) 样品瓶 Waters KG 32*11.6mm ; 移液枪 : tripette 10-μL(NO.11z0394) 10-0μL(NO.11z8768) 1.2 试剂苏丹红标准品 : 购自美国 Sigma 公司, 乙腈 (TEDIA, 色谱纯 ) 甲酸 (TEDIA, 色谱纯 ) 1.3 仪器检测参数液相色谱参数色谱柱 :Waters Sunfire TM C18 Column 5µm, mm 柱温 :30 ; 样品温度 :20 ; 进样量 ;10μL; 流动相 : 含 0.1 甲酸的乙腈溶液和含 0.1 甲酸的水溶液 (90/10,V/V); 流速 : 200 μl/min 进样量 :10uL 质谱参数离子源 (Source):ESI(+); 毛细管电压 (Capillary):3.8kV; 锥孔电压 (Cone): 60V; 离子源温度 (Source Temperature ): ; 脱溶剂气温度 ( Desolvation Temperature):350 ; 脱溶剂气流量 (Desolvation Gas Flow):450L/hr; 锥孔反吹气流量 (Cone Gas Flow):60 L/hr; 检测器电压 :400V 分析器 1 低端分辨率 RF Lens1:12.0V; 高端分辨率 HM Lens1:12.0V; 入口透镜

3 电压 (Entrance):1V; 碰撞电压 (Collision): eV;; 碰撞梯度 :1.6; 出口电压 (Exit):0V; 分析器 2 低端分辨率 RF Lens2:12.0V; 高端分辨率 HM Lens2:12.0V 苏丹红 LC-ESI-MS/MS 质谱多离子反应检测 (MRM) 参数参数详见表 1 表 1 苏丹红 LC-ESI-MS/MS 质量条件参数分析物保留时间母离子子离子停顿时间锥孔电压碰撞能量 (mins) (m/z) (m/z) (s) (V) (ev) 苏丹红 I * 苏丹红 II * 苏丹红 III * 苏丹红 IV * 苏丹红 7B 注 : 打 "*" 者定量离子 1.4 样品预处理粉状调味品辣椒酱辣椒油 : 称取 1-5g( 准确至 0.01g) 样品于三角瓶中, 添加 µl 浓度为 4ug/mL 的苏丹红 7B 内标, 用 25mL 乙腈超声波萃取 2 次 ( 每次萃取 20m in), 合并萃取液, 并用乙腈定容至合适体积萝卜干榨菜和肉制品 : 称取 1-5g( 准确至 0.01g) 经组织捣碎机捣碎的样品于三角瓶中, 添加 µl 浓度为 4ug/mL 的苏丹红 7B 内标, 用 25mL 乙腈超声波萃取 2 次 ( 每次萃取 20m in), 合并萃取液, 并用乙腈定容至合适体积萃取液在 15000rpm 下离心 10 分钟, 上清液用 0.45um 的滤膜过滤后进入 LC-MS/MS 系统检测检测样品取样量和其稀释液浓度要视产品中的苏丹红含量而定, 再稀释 10- 倍以符合液相色谱质谱联用仪检测限的要求 2 结果与讨论 2.1 色谱条件的选择流动相的选择由于苏丹红能溶于乙腈, 本文采用乙腈和水作为流动相进行分离测定当乙腈 / 水的体积比为 90/10 时, 苏丹红 I II III IV 的保留时间分别 5.11mins 8.01 mins mins mins 在本实验中采用了乙腈/ 含 0.1 甲酸的水或含 0.1 甲酸的乙腈 / 含 0.1 甲酸的水 (V/V,90/10) 作为流动相, 使用同一色谱柱色谱条件进行梯度洗脱分离由图可见 : 使用 0.1 甲酸的乙腈 / 含 0.1 甲酸的水作流动相的离子相对强度 (2.28 e6) 高于乙腈 / 含 0.1 甲酸的水作流动相的离子相对强度 (1.04e6), 且峰形也较好, 能够去除在苏丹红 I 峰前和夹在苏丹红 I 和苏丹红 II 之间的杂峰这说明甲酸对苏丹红的离子化有促进作用 ( 见图 1)

4 SUDAN I 10.6 II 10.4III 23.4 IV B1.6 SDH e CH3CN SDH e CH3CN+0.1HCOOH Time 图 2 流动相中甲酸对色谱分离和离子强度的影响质谱条件的优化根据苏丹红分子结构, 选择 ESI(+) 作为电离模式, 将标准品配成浓度为 ng/ml 的乙腈溶液, 分别对毛细管电压锥孔电压原温度脱溶剂温度 RFlens 碰撞能量质谱分辨率等条件进行了优化苏丹红 I 的分子量 248, 通过扫描得到其母离子分子量为 249.3, 随着碰撞能量的增加, 母离子丰度逐渐减少, 子离子 93.13,128.00, 的丰度逐渐增加, 再增加碰撞能量, 子离子 93.13,128.00, 的丰度逐渐下降, 所以苏丹红 I 最终选用选用在 16ev 的碰撞能量下荷质比为 156 的子离子为定量离子, 在 16ev 的碰撞能量下荷质比为的子离子和在 24ev 的碰撞能量下荷质比为 128 的子离子为辅助定性离子苏丹红 II 的分子量 276, 通过扫描得到其母离子分子量为 277, 选择了在 20ev 的碰撞能量下荷质比为的子离子为定量离子, 在 16ev 的碰撞能量下荷质比为的子离子为辅助定性离子苏丹红 III 的分子量 352, 通过扫描得到其母离子分子量为 353, 选择了在 24ev 的碰撞能量下荷质比为的子离子为定量离子, 在 24ev 的碰撞能量下荷质比为的子离子为辅助定性离子苏丹红 IV 的分子量 380, 通过扫描得到其母离子分子量为 381, 选择了在 20ev 的碰撞能量下荷质比为的子离子为定量离子, 在 24ev 的碰撞能量下荷质比为的子离子为辅助定性离子 2.2 标准曲线绘制苏丹红 I 和苏丹红 II 的灵敏度约为苏丹红 III 和苏丹红 IV 灵敏度的 2 倍, 将苏丹红 I 和苏丹红 II 浓度分别为 ng/mL 和苏丹红 III 和苏丹红 IV 的浓度分别为 ng/mL 的苏丹红标准系列, 依次进样, 进样量均为 10µL, 以苏丹红 I II III IV 峰面积和苏丹红 7B 内标峰面积的比值为纵坐标, 标样浓度为横坐标分别作标准曲线相关系数及回归方程见表 2 表 2 苏丹红 I II III IV 的线性范围回归方程和相关系数名称线性范围回归方程相关系数 (r) 苏丹红 I ng/mL y = *x

5 苏丹红 II ng/mL y = *x 苏丹红 III ng/mL y = *x 苏丹红 IV ng/mL y = 0.232*x 最低检出限当信噪比为 3 倍时的溶液浓度为检出限, 当信噪比为 10 倍时的溶液浓度为定量限, 将苏丹红 I 苏丹红 II 苏丹红 III 苏丹红 IV 标准溶液分别配成 0.02 ng/ml 0.2 ng/ml 和 0.1 ng/ml 的浓度后进样由此可见, 苏丹红 I,II,III,IV 的定量限分别为 ng/ml ng/ml 1.47 ng/ml 和 0.413ng/mL, 再由此推算出苏丹红 I,II,III,IV 的检出限分别为 0.05 ng/ml 0.08 ng/ml 0.45ng/mL 和 0.13ng/mL 2.4 空白样品图谱取阴性样品, 按照 1.3 方法进行处理后进样, 见图 SDH SAM MRM of 9 Channels ES+ 6.24e Time 图 3 阴性样品的测定图谱 2.5 精密度试验日内精密度 : 取实际只含有苏丹红 I 和 II 的样品作为试验样品, 重复取样 7 次, 再加入相当水平的苏丹红 III 和苏丹红 IV 的混标, 按样品前处理方法进行处理, 依次进样结果见表 3 可见, 日内重复取样测定,4 种物质的 RSD 分别为表 3 日内精密度天数苏丹红 I 苏丹红 II 苏丹红 III 苏丹红 IV (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) 平均 R.S.D 日间精密度 : 将上述实际只含有苏丹红 I 和 II 的试验样品, 每天取样 1 份, 再加入相当水平的苏丹红 III 和苏丹红 IV 的混标, 按样品前处理方法进行处理分别进样, 结果见表 4 可见, 日间重复取样测定, 四种物质的 RSD 分别为 , 日间精密度良好

6 表 4 日间精密度天数苏丹红 I 苏丹红 II 苏丹红 III 苏丹红 IV (ug/kg) (ug/kg) (ug/kg) (ug/kg) 平均 R.S.D 回收试验取三个已知含有不同含量苏丹红的样品为试验样品, 分别加入不同量的标准溶液, 按样品前处理方法进行处理进样, 结果见表 5 表 5 方法回收率名称样品原含量理论加入量实际测得回收率平均回收率 (µg/kg) (µg/kg) 量 (µg/kg) () () 苏丹红 I 苏丹红 II 苏丹红 III 苏丹红 IV 实样测定 : 从市场上购买了腌辣泡粉辣椒油榨菜萝卜干酸辣酱等, 按照预处理方法进行处理, 依次进样, 测定结果见表 6, 实样测定图见图 5. 表 6 实样测定结果 (ug/kg) 样品苏丹红 I 苏丹红 II 苏丹红 III 苏丹红 IV 未检出未检出未检出未检出未检出未检出未检出未检出 650

7 sample-nong SDH Sm (Mn, 2x3) > e6 Time Height SDH Sm (Mn, 2x3) Time Height > e SDH Sm (Mn, 2x3) SDH Sm (Mn, 2x3) Time e6 Height Time > e4 Height SDH Sm (Mn, 2x3) Time > e4 Height SDH Sm (Mn, 2x3) e Time Height Time 图 4 两个阳性样品的图和 EIC 图 3 结论本文主要建立了一种快速准确可靠的检测苏丹红 I,II.III.IV 含量的方法本方法主要采用 LC-MS/MS 的检测手段来减少背景干扰, 能使苏丹红 I,II.III.IV 检出限分别达到为 0.05 ng/ml 0.08 ng/ml 0.45ng/mL 和 0.13ng/mL 同时采用苏丹红 7B 作为内标, 消除了前处理所带来的损失, 结果可靠利用 Waters SunfireTM C18 色谱柱能对极性化合物能有效分离的特点, 同时分离测定 4 种苏丹红在预处理方法上, 本文的样品预处理方法适用于固体液体油性样品的检测分析, 但油性样品中苏丹红的回收率较低 ( 约 50), 提取的预处理办法有待于进一步研究由于苏丹红的污染比较严重, 所以须对实验器皿采用铬酸洗液浸泡, 有机溶剂洗涤, 高温烘烤等措施, 可使苏丹红污染基本消除总之, 本方法可快速测定食品中苏丹红 I,II.III.IV 的残留量, 结果准确可靠, 重复性好, 灵敏度高 4 参考文献 [1] M.S. Reisch, Chem. Eng. News 66 (1988) 7. [2] Color Index, Society of Dyers and Colorists, third ed., [3] IARC Monographs on the Evaluation of the Carcinogenic Risk of Chemicals to Man, vol. 8, IARC, Lyon, 1975, p [4] C.E. Searly (Ed.), Chemical Carcinogenesis (ACS Monograph No.173), American Chemical Society, Whashington, DC, [5] M.J. Prival, V.M. Davis, M.D. Peiperl, S.J. Bell, Mutat. Res. 206(1988) 247. [6] M.F. Boeninger, US Department of Health and Human Service,

8 Pubblication No. NIOSH, 1980, pp [7] EC Regulation No 178/2002, OJ L. 31 ( ). [8] Commission Decision of 20 June 2003 on emergency measures regarding hot chilli and hot chilli products, notified under document number C(2003) 1970, (2003/460/EC), OJ No L. 154/114( ). [9] Food Standards Agency: [10] The Colours in Food Regulations 1995, ISBN , on the Evaluation of Carcinogenic Risk of Chemicals to Man. International Agency for Research on Cancer. Geneva Vol. 8, pp

!$"!" # # &$ I+C-C 57; 96J 9)&2&+# +-.E2&BE&KF 9)&2&+# C-F-D+, 7 ) ! A+%)BC L-#+&,B) %%M <DBEC IB!+.-DC 8-FF-&EB) $(! 8# D 2 (! *EF " 7 &5 )(! #

!$! # # &$ I+C-C 57; 96J 9)&2&+# +*-.E2&BE&KF 9)&2&+# C-F-D+, *7 ) *! A+%)BC L-#*+&,B) %%M <DBEC IB!+.-DC 8-FF-&EB) $*(! 8# D* 2 (! *EF 7 &5 )(! # !""# $!"#!""#!"#$%&% ()*$+, (-!"*(.+/(0*+1"2 $%&!% (% &! & (! )!!"!,,!,,!,,!,! &""")!! """ &,!6!! 78 $.!" 89: ;"?@AB)C AD9? )! :+8? / ". E, ". "! ( ". &/!1 F G1 ". ") (.!)!1 F G1!!1 F G1 ". %!1 F