mir-49-3p 通过抑制 TGFβR1 基因表达进而抑制结肠癌细胞的转移和侵袭王晓凤, 等 67 Keywords n>3). Over-expression of mir-49-3p significantly inhibited the CRC cell migration and inva

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乾愿储
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1 66 临床与病理杂志 J Clin Pathol Res 216, 36(5) doi: /j.issn View this article at: mir-49-3p 通过抑制 TGFβR1 基因表达进而抑制结肠癌细胞的转移和侵袭王晓凤, 金红艳 ( 武汉科技大学附属武汉普仁医院肿瘤科, 武汉 4381) [ 摘要 ] 目的 : 研究 mir-49-3p 在结肠癌细胞 (colorectal cancer cell,crc) 转移中的表现和生物功能, 及其调控作用机制方法 : 通过荧光定量 PCR 测定 mir-49-3p 在 CRC 细胞系的表达水平细胞转染 mir-49-3p 以及 shmir-49-3p, 观察 mir-49-3p 的过表达或基因沉默对结肠癌细胞的转移能力是否有影响 mir-49-3p 的分子靶标由双荧光素酶报告基因分析和免疫印迹技术进行实验认定通过划痕实验,Transwel l 小室基质渗透实验对细胞迁移和侵袭能力进行鉴定结果 :mir-49-3p 在 CRC 细胞系中显著低表达 (P<.5,P<.1,P<.1,n>3) 过表达 mir-49-3p 显著降低 CRC 细胞株的细胞迁移和侵袭能力 (P<.1,n>3) mir-49-3p 的基因沉默显著增加 CRC 细胞株的细胞迁移和侵袭能力 (P<.1,n>3) 结肠癌细胞细胞系中过表达 mir-49-3p 显著降低 TGFβR1 的基因表达 (P<.1,n>3),miR-49-3p 基因沉默显著上调 TGFβR1 的基因表达 (P<.1,n>3) 过表达 mir- 49-3p 抑制 TGFβR1 的萤光素酶活性 (P<.1,n>3),miR-49-3p 基因沉默促进 TGFβR1 的萤光素酶活性 (P<.1,n>3) TGFβR1 基因沉默减弱 shmir-49 介导的细胞迁移和侵袭促进效应 (P<.1, n>3) 结论:miR-49-3p 通过抑制 TGFβR1 的基因表达从而抑制 CRC 细胞的转移 [ 关键词 ] mir-49-3p; 结肠癌 ; 转移 ; 侵袭 ;TGFβR1 mir-49-3p inhibits colorectal cancer cell migration and invasion by suppressing TGFβR1 gene expression WANG Xiaofeng, JIN Hongyan (Department of Oncology, Wuhan Puren Hospital Affiliated Wuhan University of Science, Wuhan 4381, China) Abstract Objective: To investigate the potential role of mir-49-3p on the regulation of colorectal cancer cell (CRC) migration and invasion, as well as the regulatory mechanism. Methods: The level of mir-49-3p and TGFβR1 in cells was measured by Real-time PCR. The cell migration and invasion was measured by wound healing experiment and Transwell invasion testing system. The protein level of TGFβR1 was measured by Western blot. The transfection of mir-49-3p mimics was used to make over-expression of mir-49-3p in the CRC cells. The transfection of lent-shmir-49-3p was used to make gene silence of mir-49-3p in the gastric cells. Results: Gene expression of mir-49-3p was significantly inhibited in CRC cells (P<.5, P<.1, P<.1, 收稿日期 (Date of reception): 通信作者 (Corresponding author): 金红艳, zzh216778@sina.com

2 mir-49-3p 通过抑制 TGFβR1 基因表达进而抑制结肠癌细胞的转移和侵袭王晓凤, 等 67 Keywords n>3). Over-expression of mir-49-3p significantly inhibited the CRC cell migration and invasion (P<.1, n>3). Gene silence of mir-49-3p simulated the CRC cell migration and invasion (P<.1, n>3). Real-time PCR and western blot results indicated over-expression of mir-49-3p inhibited TGFβR1 gene expression (P<.1, n>3), and gene silence of mir-49-3p stimulated TGFβR1 gene expression (P<.1, n>3). Over-expression of mir- 49-3p inhibited TGFβR1 derived luciferase activity (P<.1, n>3), and gene silence of mir-49-3p stimulated TGFβR1 derived luciferase activity (P<.1, n>3). The gene silencing of TGFβR1 significantly reduced the shmir-49 induced promotion of CRC cell migration and invasion (P<.1, n>3). Conclusion: MiR-49-3p inhibits colorectal cancer cell migration and invasion by suppressing TGFβR1 gene expression. mir-49-3p; colorectal cancer; migration; invasion; TGFβR1 结肠癌 (colorectal cancer,crc) 是最常见的一种胃肠道恶性肿瘤和全球第三大癌症致死性疾病 [1] 9% 的早期 CRC 可以通过手术治愈然而, 大部分病人往往在肿瘤晚期才确诊, 进而影响预后 [2] 寻找 CRC 治疗新的作用靶点对提高 CRC 治疗效果具有重要的意义 CRC 的发生和进展中涉及多种致癌基因和抑制基因的表达异常 [3] 在过去的研究中, 许多微小 RNA(microRNAs,miRNAs) 已经证明是肿瘤发生和发展过程中的关键调节因子 [4] MiRNAs 是一系列的范围由 18~25 nt 的小非编码单链 RNA, 在后转录水平通过部分互补绑定到靶标 mrna 从而导致 mrna 的降解以及翻译抑制 mirnas 精确调控着广泛的生物学行为, 如细胞增殖凋亡迁移和免疫反应 [5-6] 目前已发现某些 mirna 的表达失调对肿瘤的发生发展起到关键作用 [7] mir-49-3p 已被确证在卵巢癌胃癌肺癌膀胱癌以及肝癌等癌症的发病过程中发挥重要作用 [8-13] 然而, mir-49-3p 对结肠癌的发生发展是否存在调控作用目前尚未明确因此, 本研究着重探讨了 mir-49-3p 对结肠癌细胞的迁移和侵袭能力的调控作用, 以及其具体调控机制 1 材料与方法 1.1 试剂及仪器 DMEM 培养基胎牛血清 (FBS) 以及胰蛋白酶均购自美国 Hyclone 公司 Tr i Z ol 购自美国 Invitrogen 公司蛋白质免疫印迹所用的一抗包括 :anti-tgfβr1 和 anti-gapdh 购自美国 Santa Cruz 公司,HRP 标记的二抗购自英国 Abcam 公司 mir-49-3p mimics,si-tgfβr1, 以及 scrambles 均由上海吉玛公司定制合成, 慢病毒 lenti-shmir49-3p 由美国 GeneCopoeia 公司定制转染试剂 Liposome 2 以及 Polybrene 均购自美国 Invitrogen 公司实验仪器包括美国 Thermo Scientific 公司的 CO 2 恒温细胞培养箱,Bio Rad 公司 Mini Protean 蛋白质电泳仪 1.2 细胞培养和细胞转染人类正常结肠表皮细胞系 NCM46, 结肠癌细胞系 HT29 SW62 SW48 HCT-15 LoVo 以及 DLD-1 均采用 DMEM 培养基 ( 添加 1% 胎牛血清以及抗生素 ) 进行培养细胞培养于 37 5% CO 2 饱和湿度的恒温细胞培养箱中 1.3 RNA 提取和荧光定量 PCR 按照 mirvana mirna Isolation Kit(Ambion, 美国 ) 说明书, 从培养细胞中提取总 mirrna 然后按照 TaqMan mirna reverse transcription kit (ABI, 美国 ) 说明书, 从 5 ng 的总 mirna 逆转录合成 cdna 所得产物按照 mirna-specific TaqMan MiRNA Assay Kit (ABI, 美国 ) 说明书, 在 ABI 75 实时定量 PCR 仪中, 以 U6 小核 RNA 作为内参, 量化 mir-49-3p 的表达水平为测量 TGFβR1 的 mrna 水平, 按照 Trizol reagent(invitrogen, 美国 ) 说明书提取总 RNA, 将所得的 RNA 使用 ImPron-II 反转录系统 (Roche, 美国 ) 逆转录使用 SYBR Green PCR master mix 试剂 (Roche, 美国 ) 在 ABI 75 实时 PCR 仪中进行荧光实时定量 PCR 选取的引物如下 :TGFβR1( 正向引物 :5'-ACGGCGTTACAGTGTTTCTG-3'; 反向引物 :5'-GCACATACAAACGGCCTATCTC-3 ); β - a c t i n 基因作为内参 ( 正向引物 : 5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'; 反向引物 : 3'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGA AGCA-5') 1.4 细胞转染以及细胞分别种植于 12 孔板, 细胞数为细胞 / 孔细胞孵育 12 h 后 ( 细

68 临床与病理杂志, 216, 36(5) http://lcbl.amegroups.

3 68 临床与病理杂志, 216, 36(5) 胞约占培养孔面积 3%~5%) 进行转染 sirna (5 nm) 使用 Lipofectamine 2 试剂 (Invitrogen, 美国 ) 进行转染, 根据试剂使用说明进行具体操作, 最终转染浓度为 2 nm shmir-49-3p 以及对应的病毒空载体均采用 5 µg/ml Polybrene 转染试剂进行转染, 根据试剂使用说明进行具体操作 1.5 划痕实验将细胞用 DMEM( 含有 1%FBS) 培养在六孔板上, 待细胞融合后, 用 sterile pipette 枪头沿直线用力划直线划痕后 ~24 h, 分别在不同时间点用反转的 Olympus IX5 显微镜通过 1 物镜和 Image-Pro Plus 软件捕获和记录细胞迁移的图像 1.6 Transwell 小室基质渗透实验个检测细胞种在 Transwel l 小室的碳酸磷脂表面, 上室 BioCoat TM 包被 Matrigel 基质胶 (BD Biosciences,San Jose, 美国 ),37 培养细胞 24 h, 取出上层小室, 将膜下面的侵袭细胞与 1% 多聚甲醛混合, 用.2%(w/v) 结晶紫溶液染色 15 min 用显微镜计数进入膜下的细胞量, 随机取 1 个视野, 取平均值每组实验重复 3 次 1.7 蛋白质印迹 [14] 蛋白质印迹检测根据以前文献描述进行操作, 使用 anti-tgfβr1 一抗 (Abcam,Cambridge, 美国 ) 以及 anti-gapdh 一抗 (Sigma,Saint Louis, 美国 ) 用软件 ImageJ( 广泛用于对比琼脂凝胶或蛋白质印迹的条带密度 ), 测量蛋白质印迹相关条带密度, 用样本 T1 [15] 进行标准化 1.8 统计学处理采用 Graphpad 6. 统计作图软件, 计量资料用 x± s 表示, 两组均数采用 t 检验, 配对的两组均数采用配对 t 检验, 多组均数比较采用单因素方差分析 (P<.1,n>3),SW48 (P<.1,n>3),HCT- 15 (P<.1,n>3),LoVo (P<.1,n>3), 以及 SW62 (P<.1,n>3) 2.2 过表达 mir-49-3p 抑制 CRC 细胞系的迁移和侵袭 MiR-49-3p mrna 水平通过对两种 CRC 细胞系以及进行 mir-49-3p 过表达, 观察过表达 mir-49-3p 对 CRC 细胞的迁移和侵袭能力的影响如图 2A-B 所示, 划痕实验显示,24 h 的细胞培养后,miR- 49-3p 过表达组表现出显著降低的划痕修复, 相比 scramble 组具有显著性差异 (P<.1,n>3) 如图 2C-D 所示, 通过 Transwell 实验, 我们发现 mir- 49-3p 过表达组的细胞侵袭能力出现显著下降 (P<.1,n>3) Control DLD-1 HT29 SW48 HCT-15 LoVo SW62.5. * * * * * 图 1 mir-49-3p 在结肠癌细胞系中低表达, 包括 HT29 (*P<.5,n>3), (P<.1,n>3), (P<.1, n>3),sw48 (*P<.1,n>3),HCT-15 (*P<.1,n>3), LoVo (*P<.1,n>3), 以及 SW62 (*P<.1,n>3) Figure 1 The decrease of mir-48-3p gene expression in colorectal cancer cells, the gene expressions were measured in cells include: HT29 (*P<.5, n>3), (P<.1, n>3), (P<.1, n>3), SW48 (*P<.1, n>3), HCT-15 (*P<.1, n>3), LoVo (*P<.1, n>3), and SW62 (*P<.1, n>3) 2 结果 2.1 mir-49-3p 在 CRC 细胞系中低表达通过荧光定量 PCR 方法对 mir-49-3p 的 mrna 水平进行定量分析如图 1 所示, 相比于对照组人类正常结肠表皮细胞系 NCM46, 多个结肠癌细胞系中 mir-49-3p 出现低表达具体包括 HT29 (P<.5,n>3), (P<.1,n>3), 2.3 mir-49-3p 基因沉默促进 CRC 细胞的迁移和侵袭通过对两种 CRC 细胞系以及进行 mir-49-3 基因沉默, 观察 mir-49-3p 基因沉默对 CRC 细胞的迁移和侵袭能力的影响如图 3A-B 所示, 划痕实验显示,24 h 的细胞培养后, mir-49-3p 基因沉默组划痕修复能力显著增加, 相比组具有显著性差异 (P<.1,n>3) 如

mir-49-3p 通过抑制 TGFβR1 基因表达进而抑制结肠癌细胞的转移和侵袭王晓凤, 等 69 图 3C-D 所示, 通过 Transwell 实验, 我们发现 mir- 49-3p 基因沉默组的细胞侵袭能力出现显著上升 (P<.1,n>3) 2.

本实验分别在 mir-49-3p 过表达和基因沉默的 CRC 细胞系中验证 TGF-β 信号通路相关基因的表达情况如图 4A 所示, 通过荧光定量 PCR 实验发现, 在 mir-49-3p 过表达的 CRC 细胞系以及中,TGF-β 信号通路的关键因子 TGFβR1 的基因表达显著下调 (P<.

1,n>3) 如图 4B 所示, 通过蛋白质免疫印迹实验, 我们进一步印证了在 mir-49-3p 过表达的 CRC 细胞系以及中,TGFBR1 蛋白表达显著下调在 mir- 49-3p 基因沉默的 CRC 细胞系以及中,TGFBR1 蛋白表达显著上调如图 4C 所示,

1,n>3) 在 mir-49-3p 基因沉默的 CRC 细胞系以及中,TGFβR1 介导的荧光素酶活性显著上调 (P<.

mir-49-3p Scramble mir-49-3p 图 2 过表达 mir-49-3p 抑制 CRC 细胞系的转移和侵袭 Figure 2 The over-expression of mir-49-3p inhibited cell migration and invasion of

4 mir-49-3p 通过抑制 TGFβR1 基因表达进而抑制结肠癌细胞的转移和侵袭王晓凤, 等 69 图 3C-D 所示, 通过 Transwell 实验, 我们发现 mir- 49-3p 基因沉默组的细胞侵袭能力出现显著上升 (P<.1,n>3) 2.4 mir-49-3p 抑制 TGFβR1 基因表达进一步探索 mir-49-3p 对 CRC 细胞的具体调控机制由于 TGF-β 信号通路对 CRC 细胞的迁移和侵袭能力具有重要的促进调控作用 [16] 因此, 假设 mir-49-3p 对 CRC 细胞的 TGF-β 信号通路具有抑制效应本实验分别在 mir-49-3p 过表达和基因沉默的 CRC 细胞系中验证 TGF-β 信号通路相关基因的表达情况如图 4A 所示, 通过荧光定量 PCR 实验发现, 在 mir-49-3p 过表达的 CRC 细胞系以及中,TGF-β 信号通路的关键因子 TGFβR1 的基因表达显著下调 (P<.1,n>3) 在 mir-49-3p 基因沉默的 CRC 细胞系以及中,TGF-β 信号通路的关键因子 TGFβR1 的基因表达显著上调 (P<.1,n>3) 如图 4B 所示, 通过蛋白质免疫印迹实验, 我们进一步印证了在 mir-49-3p 过表达的 CRC 细胞系以及中,TGFBR1 蛋白表达显著下调在 mir- 49-3p 基因沉默的 CRC 细胞系以及中,TGFBR1 蛋白表达显著上调如图 4C 所示, 我们进一步通过荧光素酶报告基因系统探讨 mir-49-3p 是否能直接调控 TGFβR1 的基因表达实验结果显示, 在 mir-49-3p 过表达的 CRC 细胞系以及中,TGFBR1 介导的荧光素酶活性显著下调 (P<.1,n>3) 在 mir-49-3p 基因沉默的 CRC 细胞系以及中,TGFβR1 介导的荧光素酶活性显著上调 (P<.1,n>3) A h 24 h h 24 h B Scramble mir-49-3p 2 μm 2 μm C 相对划痕面积 % h 24 h 相对划痕面积 % h 24 h D 迁移细胞数 Scramble mir-49-3p Scramble mir-49-3p Scramble mir-49-3p 图 2 过表达 mir-49-3p 抑制 CRC 细胞系的转移和侵袭 Figure 2 The over-expression of mir-49-3p inhibited cell migration and invasion of colorectal cancer cells (A-B) 划痕实验显示,miR-49-3p 过表达组表现出显著降低的划痕修复 (P<.1,n>3);(C-D) 通过 Transwell 实验显示,miR- 49-3p 过表达组的细胞侵袭能力出现显著下降 (P<.1,n>3) (A-B) The wound healing experiment indicated that wound healing abilities were reduced by mir-49-3p over-expression (P<.1, n>3); (C-D) the Transwell experiment indicated that the cell invasion abilities were reduced by mir-49-3p over-expression (P<.1, n>3).

61 临床与病理杂志, 216, 36(5) http://lcbl.amegroups.

scramble mir-49-3p-in 2 μm 图 3 mir-49-3p 基因沉默促进 CRC 细胞的迁移和侵袭 Figure 3 The gene silence of mir-49-3p stimulated cell migration and invasion

1,n>3) (A-B) The wound healing experiment indicated that wound healing abilities were stimulated by mir-49-3p over-expression (P<.

5 TGFβR1 基因沉默减弱 shmir-49-3p 介导的 CRC 细胞迁移和侵袭效应在证明了 mir-49-3p 对 TGFβR1 基因的直接抑制作用后, 进一步鉴定该抑制效应是否对 CRC 细胞的迁移和侵袭产出作用首先, 通过 sirna 技术对 TGFβR1

5 61 临床与病理杂志, 216, 36(5) A h 24 h h 24 h shmir-49-3p 2 μm B C 相对划痕面积 % shmir-49-3p h 24 h 相对划痕面积 % D shmir-49-3p h 24 h shmir-49-3p 迁移细胞数 scramble mir-49-3p-in 2 μm 图 3 mir-49-3p 基因沉默促进 CRC 细胞的迁移和侵袭 Figure 3 The gene silence of mir-49-3p stimulated cell migration and invasion of colorectal cancer cells (A-B) 划痕实验显示,miR-49-3p 基因沉默组表现出显著增强的划痕修复 (P<.1,n>3);(C-D) 通过 Transwell 实验显示 mir- 49-3p 基因沉默组的细胞侵袭能力出现显著上升 (P<.1,n>3) (A-B) The wound healing experiment indicated that wound healing abilities were stimulated by mir-49-3p over-expression (P<.1, n>3); (C-D) the Transwell experiment indicated that the cell invasion abilities were stimulated by mir-49-3p over-expression (P<.1, n>3). 2.5 TGFβR1 基因沉默减弱 shmir-49-3p 介导的 CRC 细胞迁移和侵袭效应在证明了 mir-49-3p 对 TGFβR1 基因的直接抑制作用后, 进一步鉴定该抑制效应是否对 CRC 细胞的迁移和侵袭产出作用首先, 通过 sirna 技术对 TGFβR1 基因进行沉默如图 5A 所示, 运用免疫印迹技术, 发现 si-tgfβr1 组细胞其 TGFβR1 蛋白质水平显著下降在此基础上, 对细胞的迁移和侵袭能力进行鉴定如图 5B 所示, 尽管 shmir-49-3p 显著促进细胞的迁移, 然而, 在 si-tgfβr1 处理下, 该效应受到显著减弱 (P<.1,n>3) 如图 5C 所示, 尽管 shmir-49-3p 显著促进细胞的侵袭, 然而, 在 si-tgfβr1 处理下, 该效应同样受到显著减弱 (P<.1,n>3)

mir-49-3p 通过抑制 TGFβR1 基因表达进而抑制结肠癌细胞的转移和侵袭王晓凤, 等 611 A TGFβR1 mrna 水平 1 8 6 4 2 * * * 图 4 mir-49-3p 抑制 TGFβR1 基因表达 Figure 4 MiR-49-3p inhibited the gene expression of TGFβR1 (A) 荧光定量 PCR 实验显示在

1, n>3) (B) 蛋白质免疫印迹实验进一步印证了在 mir-49-3p 过表达的 CRC 细胞系以及中,TGFBR1 蛋白表达显著下调在 mir-49-3p 基因沉默的 CRC 细胞系以及中,TGFBR1 蛋白表达显著上调 (C) 在 mir-49-3p 过表达的 CRC 细胞系以及中,TGFβR1 的 3 UTR 介导的荧光素酶活性显著下调 (*P<.

(B) Western blot results indicated that the over-expression of mir-49-3p decreased protein level of TGFβR1 in and cells; the gene silence of mir-49-3p stimulated gene expression of TGFβR1 in and

the gene silence of mir-49-3p stimulated the TGFβR1 3 UTR induced luciferase activity of TGFβR1 in and cells (*P<.1, n>3).

6 mir-49-3p 通过抑制 TGFβR1 基因表达进而抑制结肠癌细胞的转移和侵袭王晓凤, 等 611 A TGFβR1 mrna 水平 * * * 图 4 mir-49-3p 抑制 TGFβR1 基因表达 Figure 4 MiR-49-3p inhibited the gene expression of TGFβR1 (A) 荧光定量 PCR 实验显示在 mir-49-3p 过表达的 CRC 细胞系以及中,TGFβR1 的基因表达显著下调 (*P<.1,n>3) 在 mir-49-3p 基因沉默的 CRC 细胞系以及中,TGFβR1 的基因表达显著上调 (*P<.1, n>3) (B) 蛋白质免疫印迹实验进一步印证了在 mir-49-3p 过表达的 CRC 细胞系以及中,TGFBR1 蛋白表达显著下调在 mir-49-3p 基因沉默的 CRC 细胞系以及中,TGFBR1 蛋白表达显著上调 (C) 在 mir-49-3p 过表达的 CRC 细胞系以及中,TGFβR1 的 3 UTR 介导的荧光素酶活性显著下调 (*P<.1,n>3) 在 mir-49-3p 基因沉默的 CRC 细胞系以及中,TGFβR1 介导的的 3 UTR 荧光素酶活性显著上调 (*P<.1,n>3) (A) Real-time PCR indicated that the over-expression of mir-49-3p decreased gene expression of TGFβR1 in and cells (*P<.1, n>3); the gene silence of mir-49-3p stimulated gene expression of TGFβR1 in and cells (*P<.1, n>3). (B) Western blot results indicated that the over-expression of mir-49-3p decreased protein level of TGFβR1 in and cells; the gene silence of mir-49-3p stimulated gene expression of TGFβR1 in and cells. (C) Luciferase assay indicated that the over-expression of mir-49-3p decreased the TGFβR1 3 UTR induced luciferase activity in and cells (*P<.1, n>3); the gene silence of mir-49-3p stimulated the TGFβR1 3 UTR induced luciferase activity of TGFβR1 in and cells (*P<.1, n>3). B * scramble scramble mir-49-3p shmir-49-3p 6 mir-49-3p TGFBR1 shmir-49-3p 4 * GAPDH TGFBR1 GAPDH C TGFβR1 3 UTR 荧光素酶活性 2 * * * scramble mir-49-3p shmir-49-3p A B NC si-tgfbr1 TGFBR1 GAPDH NC shmir-49-3p shmir-49-3p+sitgfbr1 相对划痕面积 NC shmir-49-3p shmir-49-3p+sitgfbr1 C NC shmir-49-3p shmir-49-3p+sitgfbr1 2 μm 2 μm 相对迁移细胞数 NC shmir-49-3p shmir-49-3p+sitgfbr1 图 5 TGFβR1 基因沉默减弱 shmir-49-3p 介导的 CRC 细胞迁移和侵袭效应 Figure 5 The gene silencing of TGFβR1 reduced shmir-49-3p induced promotion of CRC cell migration and invasion (A)si-TGFβR1 显著降低 TGFβR1 的蛋白质水平 ;(B)si-TGFβR1 显著减弱 shmir-49-3p 介导的细胞迁移促进效应 (P<.1,n>3);(C)si-TGFβR1 显著减弱 shmir-49-3p 介导的细胞侵袭促进效应 (P<.1,n>3) (A) si-tgfβr1 reduced the protein level of TGFβR1; (B) si-tgfβr1 reduced shmir-49-3p induced promotion of cell migration (P<.1, n>3); (C) si-tgfβr1 reduced shmir-49-3p induced promotion of cell invasion (P<.1, n>3).

7 612 临床与病理杂志, 216, 36(5) 3 讨论人类的 mir-49-3p 基因位于第 17 号染色体 [ (+), GRCh38], 该基因在哺乳动物之间高度保守, 表明它在进化过程中高度保守, 可能在生理活性中具有基本和关键的功能 [15] 然而, 关于 mir-49-3p 的研究目前仍然非常有限近期的研究揭示了 mir-49-3p 与相关疾病, 特别是各种类型的癌症之间的关系 MiR-49-3p 可能是卵巢癌 [8] [9] [1] 胃癌和肺癌细胞的生长抑制基因, 但相反它可能是肝癌的致癌因素 [12] 这样的双面生物功能在许多 mirna 中都有发现, 例如 mir-53-5p [2,17-18] 等在近期的大范围临床样本基因筛选中发现 mir-49-3p 与 CRC 具有一定的相关性 [13], 然而,miR-49-3p 在 CRC 的发生发展过程中的具体作用依然未知本研究着重探讨了 mir-49-3p 对 CRC 细胞的迁移和侵袭能力的调控作用及其作用机制通过对多种 CRC 细胞系, 包括 HT29 SW62 SW48 HCT-15 L ovo 以及 DLD-1 进行研究, 结果显示, 相比于正常的结肠上皮细胞, 在 CRC 细胞系中,miR-49-3p 的基因表达量显著降低该证据预示了 mir-49-3p 与 CRC 之间具有相关性通过对和细胞进行 mir-49-3p 的过表达, 我们发现 mir-49-3p 的过表达的 CRC 细胞, 其迁移能力显著下降同时, 其细胞侵袭能力同样显著降低通过对和细胞进行 mir-49-3p 的基因沉默, 我们发现 mir-49-3p 基因沉默的 CRC 细胞, 其迁移能力显著上升同时, 其细胞侵袭能力同样显著上升综合上述实验证据, 我们认为 mir-49-3p 能显著抑制 CRC 细胞的迁移和侵袭在前人研 [19] 究中发现,miR-49-3p 在子宫内膜癌中为一个抑癌基因, 在内膜癌中下调表达, 其通过靶向抑制 TGFα 引起生物学效应, 过表达 mir-49-3p 可抑制细胞增殖, 诱导 G1 期阻滞, 促进凋亡, 抑制侵袭和迁移在骨肉瘤中,miR-49-3p 下调表达, 外源性上调 mir-49-3p 的表达抑制细胞增殖, 诱导细胞周期 G1 期阻滞, 促进凋亡, 抑制肿瘤发生 [2] 本研究结果与前人类似 [16] 已有研究表明, 在肿瘤发生的早期阶段 TGF-β 信号抑制细胞周期 G1/S 转变, 但在晚期阶段促进细胞迁移和入侵因此,TGF-β 信号对 CRC 细胞的迁移和侵袭功能具有重要促进作用基于这一事实, 推测 mir-49-3p 可能通过调控 TGF-β 信号从而抑制 CRC 细胞的迁移和侵袭 TGFβR1 蛋白质是一种丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶膜当结合到 TGF-β 它形成一个符合 Ⅱ 型 TGF-β 受体的杂聚肽, 从细胞表面转导 TGF-β 信号到细胞质中因此, TGFβR1 蛋白是 TGF-β 信号通路中重要元件通过荧光定量 PCR 实验发现,miR-49-3p 过表达能显著下调 TGFβR1 的 mrna 水平, 与此相反,miR-49-3p 基因沉默能显著上调 TGFβR1 的 mrna 水平蛋白质免疫印迹实验显示,miR-49-3p 过表达能显著下调 TGFβR1 的蛋白质水平, 与此相反,miR-49-3p 基因沉默能显著上调 TGFβR1 的蛋白质水平因此,miR-49-3p 显著抑制 TGFβR1 的基因表达通过荧光素酶实验, 发现 mir-49-3p 能显著抑制 TGFβR1 3 UTR 介导的荧光素酶活性因此, 本研究认为 mir-49-3p 能直接调控 TGFβR1 的基因表达,TGFβR1 是 mir-49-3p 的直接作用靶点通过对 TGFβR1 在细胞进行基因沉默, 我们进一步确证了 TGFβR1 的基因沉默能显著减弱 shmir- 49-3p 所带来的细胞迁移与侵袭促进效应因此,miR-49-3p 对 TGFβR1 的表达抑制作用是它能抑制 CRC 细胞迁移和侵袭的重要原因所以,miR-49-3p 通过抑制 TGFβR1 的基因表达, 从而抑制 CRC 细胞的迁移和侵袭本研究发现了 CRC 细胞迁移与侵袭的调控新机制, 为 CRC 发病机制的研究提供了新的线索, 并加深了对 CRC 发病机制的理解 mir-49-3p 可能成为 CRC 诊断的一种潜在的生物标记物, 并且可能成为 CRC 治疗的新靶标参考文献 1. Purushotham AD, Lewison G, Sullivan R. The state of research and development in global cancer surgery[ J]. Ann Surg, 212, 255(3): Chong Y, Zhang J, Guo X, et al. MicroRNA-53 acts as a tumor suppressor in osteosarcoma by targeting L1CAM[ J]. PLoS One, 214, 9(12): e Agüero F, Murta-Nascimento C, Gallén M, et al. Colorectal cancer survival: results from a hospital-based cancer registry[ J]. Rev Esp Enferm Dig, 212, 14(11): Sameer AS. Colorectal cancer: molecular mutations and polymorphisms[ J]. Front Oncol, 213, 3: Shenouda SK, Alahari SK. MicroRNA function in cancer: oncogene or a tumor suppressor?[j]. Cancer Metastasis Rev, 29, 28(3-4): Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function[ J]. Cell, 24, 116(2):

8 mir-49-3p 通过抑制 TGFβR1 基因表达进而抑制结肠癌细胞的转移和侵袭王晓凤, 等 Ambros V. The functions of animal micrornas[ J]. Nature, 24, 431(76): Xuan Y, Yang H, Zhao L, et al. MicroRNAs in colorectal cancer: small molecules with big functions[ J]. Cancer Lett, 215, 36(2): Chen S, Chen X, Xiu YL, et al. MicroRNA-49-3P targets CDK1 and inhibits ovarian epithelial carcinoma tumorigenesis and progression[ J]. Cancer Lett, 215, 362(1): Shen J, Xiao Z, Wu WK, et al. Epigenetic silencing of mir-49-3p reactivates the chromatin remodeler SMARCD1 to promote Helicobacter pylori-induced gastric carcinogenesis[ J]. Cancer Res, 215, 75(4): Li W, Guo F, Wang P, et al. mir-221/222 confers radioresistance in glioblastoma cells through activating Akt independent of PTEN status[ J]. Curr Mol Med, 214, 14(1): Li S, Xu X, Xu X, et al. MicroRNA-49-5p inhibits proliferation of bladder cancer by targeting c-fos[ J]. Biochem Biophys Res Commun, 213, 441(4): Zhang LY, Liu M, Li X, et al. mir-49-3p modulates cell growth and epithelial to mesenchymal transition of hepatocellular carcinoma cells by targeting endoplasmic reticulum-golgi intermediate compartment protein 3 (ERGIC3)[ J]. J Biol Chem, 213, 288(6): Schindelin J, Rueden CT, Hiner MC, et al. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis[ J]. Mol Reprod Dev, 215, 82(7-8): Altuvia Y, Landgraf P, Lithwick G, et al. Clustering and conservation patterns of human micrornas[ J]. Nucleic Acids Res, 25, 33(8): Papageorgis P. TGFβ signaling in tumor initiation, epithelial-tomesenchymal transition, and metastasis[ J]. J Oncol, 215, 215: Ide S, Toiyama Y, Shimura T, et al. MicroRNA-53 promotes tumor progression and acts as a novel biomarker for prognosis in oesophageal cancer[ J]. Anticancer Res, 215, 35(3): Yang Y, Liu L, Zhang Y, et al. MiR-53 targets PI3K p85 and IKK-β and suppresses progression of non-small cell lung cancer[ J]. Int J Cancer, 214, 135(7): Sun KX, Chen Y, Chen S, et al. The correlation between microrna49-3p and TGFα in endometrial carcinoma tumorigenesis and progression[ J]. Oncotarget, 216, 7(8): Liu W, Xu G, Liu H, et al. MicroRNA-49-3p regulates cell proliferation and apoptosis by targeting HMGA2 in osteosarcoma[ J]. FEBS Lett, 215, 589(2 Pt B): 本文引用 : 王晓凤, 金红艳. mir-49-3p 通过抑制 TGFβR1 基因表达进而抑制结肠癌细胞的转移和侵袭 [ J]. 临床与病理杂志, 216, 36(5): doi: /j.issn Cite this article as: WANG Xiaofeng, JIN Hongyan. mir-49-3p inhibits colorectal cancer cell migration and invasion by suppressing TGFβR1 gene expression[ J]. Journal of Clinical and Pathological Research, 216, 36(5): doi: /j.issn

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot