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1 ISSN CN / Q http: / / cjbmb. bjmu. edu. cn Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology 2014 年 9 月 30(9):905 ~ 911 DOI: / j. cnki. cjbmb 沉默胃泌素基因抑制胃癌细胞的增殖迁移和侵袭曾怡 1) 1), 2), 周建奖, 谢渊 1) 1), 赵艳 ( 1) 贵阳医学院分子生物学重点实验室, 贵阳 ; 2) 贵阳医学院附属医院检验系, 贵阳 ) 摘要胃癌细胞分泌的胃泌素与胃癌的发生发展密切相关. 为了探讨胃泌素对胃癌细胞增殖迁移和侵袭的影响, 本文构建靶向胃泌素基因的 sirna 表达载体, 转染胃癌细胞 AGS, 成功获得沉默胃泌素基因的稳转胃癌细胞株 AGS / Gas sirna. 用 MTT 实验软琼脂集落形成实验细胞伤愈实验 Transwell 实验及 ELISA 检测沉默胃泌素基因后细胞的增殖迁移侵袭及转移相关蛋白基质金属蛋白酶 2(MMP 2) 和血管内皮生长因子 (VEGF) 的含量. 结果显示 : 与空载体转染的对照细胞比较, 沉默胃泌素基因的细胞, 其增殖率和克隆形成率显著降低, 迁移和侵袭到 Transwell 下室的细胞数分别降低了 31 6 % 和 34 %. 培养上清液中 MMP 2 和 VEGF 含量也低于对照细胞. 结果提示, 沉默胃泌素基因的胃癌细胞, 通过降低 MMP 2 和 VEGF 分泌, 抑制了细胞的增殖迁移和侵袭, 这可能是胃泌素促进胃癌侵袭转移的机制之一. 关键词中图分类号胃泌素 ; 胃癌 ; 迁移 ; 侵袭 ; RNA 干扰 Q78 Gastrin Silencing Inhibits Cell Proliferation, Migration and Invasion in Cultures ZENG Yi 1), ZHOU Jian Jiang 1), 2), XIE Yuan 1), ZHAO Yan 1) ( 1) Key Laboratory of Molecular Biology of Guiyang Medical College, Guiyang , China; 2) Department of Laboratory, Affiliated Hospital of Guiyang Medical College, Guiyang , China) Abstract Secreted by gastric cancer cells, gastrin was closely related to gastric cancer development and progression. To study the effects of gastrin on cell proliferation, migration and invasion, we constructed a eukaryotic sirna expression vector to knock down gastrin and transfected into AGS cells. A stable gastrin silenced cell line AGS / Gas sirna was obtained. MMT, colony formation, wound healing and Transwell assay were performed. The concentrations of matrix metalloproteinases 2( MMP 2) and vascular endothelial growth factor( VEGF) in culture medium were measured by ELISA. The results showed that the measurements of proliferation and colony formation in soft agar were significantly decreased in AGS / Gas sirna cells as compared to the control cells. The cells in the lower chamber of Transwell were reduced by 31 6 % to 34 %. The medium levels of MMP 2 and VEGF were also reduced. These suggested that the silencing of gastrin reduced the secretion of MMP 2 and VEGF to inhibit cell proliferation, migration and invasion. Key words gastrin; gastric cancer; migration; invasion; RNA interference 收稿日期 : ; 接受日期 : 国家自然科学基金 (No ; ); 贵州省科技攻关计划项目 (No. 黔科合 SY 字 [2011]3067) 联系人 Tel: ; E mail: jianjiangzhou@ sina. cn Received: January 8, 2014; Accepted: May 4, 2014 Supposed by National Natural Science Foundation of China( No ; ), Key Project of Science and Technology of Guizhou Province( No, QianKeHe SY[2011] 3067) Corresponding author Tel: ; E mail: jianjiangzhou@ sina. cn

2 906 第 30 卷胃癌是常见的恶性肿瘤之一, 其致死率在世界范围内居所有肿瘤的第 2 位 [1], 在亚洲也是致死率高的肿瘤之一 [2]. 因此, 研究胃癌发病的分子机制, 寻找有效的治疗方法十分重要. 胃泌素 (gastrin) 是胃窦部和十二指肠 G 细胞分泌的一种多肽类激素, 生理状态下主要促进胃酸胃蛋白酶及胆汁的分泌, 促进胃肠运动. 随后发现, 胃泌素不仅能促进正常胃肠道黏膜的生长, 对细胞恶性转化癌细胞生长也产生影响. 临床数据也证实, 胃癌患者存在一定程度的高胃泌素血症, 并提示血清胃泌素水平的变化与癌肿浸润范围和部位有关 [3]. 近年的研究发现, 多种胃肠道肿瘤均复合表达胃泌素和胃泌素受体, 推测肿瘤细胞能自分泌胃泌素, 与受体结合后构成胃泌素 / 胃泌素受体自分泌 / 旁分泌环, 促进胃肠道肿瘤的发生 [4]. 虽然有研究发现, 胃泌素能促进胃癌结肠癌等细胞的增殖, 但是胃泌素是否参与肿瘤细胞的迁移和侵袭并不清楚. 近年来, 本课题组一直致力于研究胃泌素与胃癌转移及其分子机制. 本文拟通过 RNA 干扰技术构建沉默胃泌素基因的表达载体, 并建立稳转细胞株, 研究沉默胃泌素基因对胃癌细胞增殖迁移和侵袭的影响. 1 材料与方法 1 1 材料 x tremegene HP DNA Transfection Reagent (Roche); DNA 纯化试剂盒质粒小提试剂盒 RT PCR 试剂盒 ( 天根生化科技有限公司 ); T4 DNA 连接酶 (Ferments); BamHⅠ Hind Ⅲ 限制性核酸内切酶 (TaKaRa); G418( Gibco BRL); 改良型 RPMI 1640 培养基双抗 ( HyClone); 胎牛血清 ( Gibco); plasmid Mini Kit( Qiagen); Trizol( Invitrogen ); M MLV 逆转录酶 Taq DNA 聚合酶 ( Promega ); 人胃泌素 ELISA 试剂盒人基质金属蛋白酶 2 ( matrix metalloproteinases 2, MMP 2) ELISA 试剂盒血管内皮生长因子 ( vascular endothelial growth factor, VEGF) ELISA 试剂盒 ( R&D ); (Solarbio); 基质胶 (Metrigel, BD). 低熔点琼脂胃癌细胞 AGS( 中科院上海细胞库 ); 大肠杆菌 DH 5 α Psilencer3 1 H1 / NotⅠ 由本室保存. 1 2 sirna 表达框合成 [5] 根据文献报道, 有效沉默胃泌素基因的 sirna 序列 : 5 UCCAUCCAUAGGCUUCUUCUU 3, 在 Ambion 官网上在线设计 sirna 表达框, 正义链 : 5 GATCCGTCCATCCATAGGCTTCTTCTTCTCAAGA GAAAGAAGAAGCCTATGGATGGATTTTTTGGAAA 3, 反义链 : 5 AGCTTTTCCAAAAAATCCATCCATA GGCTTCTTCTTTCTCTTGAGAAGAAGAAGCCTATGG ATGGACG 3, 退火形成 dsdna, 两端分别带 BamH Ⅰ 和 HindⅢ 酶切位点, 由生物工程有限公司合成. 1 3 Psilencer3 1 / Gas sirna 载体的构建将载体 Psilencer3 1 H1 与构建的 sirna 表达框 16 连接过夜, 连接产物导入感受态细胞 DH 5 α, 挑取阳性菌落培养, 用小提试剂盒提取质粒后测序鉴定, 命名为 Psilencer3 1 / Gas sirna. 1 4 细胞培养与转染人胃癌细胞 AGS 于 37 5% CO 2 含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基中培养. 按 x tremegene HP DNA 转染试剂盒说明书操作, 将重组质粒 Psilencer3 1/ Gas sirna 和空载体 Psilencer3 1 H1 分别转染胃癌细胞 AGS, G418(400 μg / ml) 筛选培养 2 月, 挑取阳性克隆, 以 G μg / ml 浓度扩大培养. 1 5 阳性克隆细胞株的鉴定提取阳性克隆和空载体克隆细胞中 RNA, 用 real time PCR 检测胃泌素 mrna 的相对表达量 2 ( - ΔΔCt), ΔΔCt = 实验组 (Ct Gastrin - Ct β actin ) - 对照组 (Ct Gastrin - Ct β actin ). 将各组细胞于无血清的 RPMI 1640 培养基中过夜培养, 次日收集上清液, 离心后用 ELISA 检测胃泌素浓度. 1 6 MTT 实验取稳定低表达 Gastrin 基因和空载体的细胞, 用含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基将细胞稀释后分别接种于 96 孔培养板, 每孔个细胞, 共设 7 个复孔, 培养 4 d, 每孔加入 MTT 溶液 (5 mg / ml)20 μl, 继续孵育 4 h, 弃上清, 每孔加入 DMSO 150 μl 终止反应. 振荡 10 min, 于酶标仪 A 570 波长处测各孔吸光度 (A) 值, 计算细胞相对增殖率. 细胞相对增殖率 (% ) = A 实验组 / A 对照组 100%. 1 7 细胞伤愈实验 (cell wound healing assay) 12 孔培养板中加入稳转细胞, 细胞数为 / 孔, 过夜培养. 次日待孔内细胞铺满后, 通过孔中心划致伤区, 弃孔内液体, 用 D Hank s 液清洗 2 次, 加 5% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基 1 ml, 于培养 0 h 和 24 h 分别于显微镜下观察拍照, 实验重复 3 次. 1 8 Transwell 实验将 Transwell 小室放置于 24 孔板中, 上室内铺稀释基质胶 40 μl( 基质胶无血清培养基 = 1 6),

3 第 9 期曾怡等 : 沉默胃泌素基因抑制胃癌细胞的增殖迁移和侵袭孵育 7 h, 弃上室内液体, 加入 70 μl 无血清培养基, 孵育 30 min 后弃去, 再接种各组细胞, 细胞数为 / 孔, 加 10% 胎牛血清的培养基至 200 μl, 下室内加入 30% 胎牛血清的培养基 600 μl, 于 37 C 5% CO 2 培养箱培养 24 h, 擦掉上室中未穿过基质胶的细胞,1% PBS 洗 3 遍, 4 % 多聚甲醛固定 20 min,0 1% 结晶紫染色 20 min, 洗涤 3 遍, 倒置显微镜下拍照, 随机选取 10 个视野, 在 400 倍下计数侵袭到下室的细胞数, 计算每个视野的平均侵袭细胞数, 实验重复 3 次. Transwell 迁移实验 : 不需要铺置基质胶, 接种细胞数为 / 孔, 上室内加入 0 1% 胎牛血清的培养基至 200 μl, 其余与侵袭实验相同, 最后计算每个视野的平均迁移细胞数, 实验重复 3 次. 1 9 软琼脂集落形成实验取稳定低表达 Gastrin 基因及空载体的贴壁细胞,0 25% 胰蛋白酶消化使之分散成单个细胞, 细胞数调整到 100 个 / 孔. 取预温新鲜培养液 ( 加入双倍 FBS 和双倍双抗 ) 以 1 1 比例分别与 1 2% 0 7% 低溶点琼脂混合制备培养液, 前者立即浇入 6 孔板铺制下层琼脂, 每孔含 0 6% 软琼脂 1 5 ml, 后者与细胞悬液充分混合后铺板, 每孔含 0 35% 软琼脂 1 ml, 于 37 C 5% CO 2 培养箱培养 3 周, 倒置显微镜下计数 50 个细胞以上的克隆数, 计算相对克隆形成率. 相对克隆形成率 = ( 实验组克隆形成数 / 对照组克隆形成数 ) 100% 上清液中 MMP 2 VEGF 浓度检测取稳定低表达 Gastrin 基因及空载体的贴壁细胞, 于无血清的 RPMI 1640 培养基中过夜培养. 次日收集上清液, 离心后用 ELISA 检测 MMP 2 VEGF 浓度统计学分析计量资料以均数 ± 标准差 ( x ± s) 表示,SPSS 13 0 统计软件进行统计学处理, 组间比较用 student t 检验进行统计分析, P < 0 05 为差异有统计学意义. 2 结果 2 1 沉默胃泌素基因载体的构建将沉默胃泌素基因 sirna 表达框与载体 Psilencer3 1 H1 连接, 获得阳性克隆, 提取质粒 DNA 测序鉴定. 结果 (Fig. 1) 显示,siRNA 与设计序列完全一致, 提示 Psilencer3 1 / Gas sirna 真核表达载体构建成功. Fig. 1 Sequencing map of psilencer3 1 / Gas sirna vector sirna expression cassettes were designed according to the reported sirna for gastrin [5] and ligated to Psilencer3 1 H1 to construct the expression vector Psilencer3 1 / Gas sirna. The vector was subsequently sequenced and the sequences in rectangular box was identified to be the reported sirna sequences 2 2 沉默 Gastrin 基因稳转胃癌细胞株的筛选和鉴定将构建的载体 Psilencer3 1 / Gas sirna 和空载体 Psilencer3 1 分别转染胃癌细胞 AGS,G418 筛选 2 月, 获得阳性细胞株, 用 real time RT PCR 检测 Gastrin mrna 的表达水平,ELISA 检测培养上清液中 Gastrin 浓度. 结果显示, 阳性细胞株中,Gastrin mrna 的表达水平及上清液中 Gastrin 浓度均低于空载体转染的细胞 ( Fig. 2 ), 提示成功建立沉默 Gastrin 基因的稳转胃癌细胞株, 命名为 AGS / Gas sirna, 以 AGS / Psilencer3 1 为空载体稳转对照细胞. 2 3 沉默胃泌素基因抑制胃癌细胞的增殖在成功建立沉默 Gastrin 基因胃癌细胞的基础上, 用 MTT 检测发现, 沉默胃泌素基因能抑制胃癌细胞 AGS 的增殖能力, 其相对细胞增殖率比空载体转染细胞低 58 6%. 软琼脂克隆实验结果显示, AGS / Psilencer3 1 和 AGS / Gas sirna 细胞的克隆形成率分别为 52 89% 和 21 33%, 相对克隆形成率分别为 100% 和 52 89%, 差异均有统计学意义

4 908 第 30 卷 (P < 0 01). 提示沉默 Gastrin 基因可以降低体外细胞的增殖能力和致瘤性 (Fig. 3). Fig. 2 Detection of gastrin mrna and protein in stable gastrin silenced cells ( n = 3 ) ( A ) AGS cells were transfected with the Psilencer3 1 / Gas sirna and Psilencer3 1 vectors to establish the stable trasfected cells, defined as AGS / Gas sirna and AGS / Psilencer3 1 respectively, by G418 screening. The level of gastrin mrna was detected in the stable trasfected cells by real time RT PCR. ( B) The concentration of gastrin in medium was detected in the stable trasfected cells by ELISA. P < 0 05 vs. AGS / Psilencer 沉默胃泌素基因抑制胃癌细胞的迁移和侵袭为了探讨胃泌素是否与细胞的迁移和侵袭有关, 分别用细胞伤愈实验 Transwell 迁移和侵袭实验, 检测胃泌素基因被沉默后细胞的迁移和侵袭能力的变化. 结果显示, 沉默胃泌素基因的细胞不仅迁移入细胞致伤区的能力低于对照组 (Fig. 4A), 而且细胞自 Transwell 上室迁移到下室的细胞数也显著低于对照组 (Fig. 4B, C). 侵袭实验也发现, 胃泌素基因被沉默后, 细胞从 Transwell 上室穿过 Matrigel 基质胶到下室的细胞数显著低于对照组 (Fig. 4B, C). 这些结果提示, 胃泌素在体外能促进细胞的迁移和侵袭. 2 5 沉默胃泌素基因抑制胃癌细胞分泌 MMP 2 和 VEGF Fig. 3 Detection of the proliferation and tumorigenicity of gastrin silenced cells in vitro ( A) The AGS / Gas sirna and AGS / Psilencer3 1 cells were seeded in a 96 well plate in septuplicate and cultured for 4 days, and then each well was supplemented with 20 μl of MTT solution (5 mg / ml). After 4 hours of incubation, the medium was removed and 150 μl of DMSO was added to each well. The absorbance at 570 nm was measured and relative proliferation rate was calculated according to a formula: Relative proliferation rate = ( A 570 in experimental group / A 570 in control group) 100% (n = 7). (B) Soft agar colony forming assay demonstrating a inhibition of colony forming efficiency of gastrin silenced cells. Clones more than 50 of cells were counted at an inverted microscope ( arrow) and the colony formation rate was calculated following the formula: Relative colony formation rate = ( clones in experimental group / clones in control group ) 100%. Images were taken from the soft agar assay at 3 weeks of culturing under an inverted microscope at 40 magnification( n = 3). Images shown are representative of three independent experiments. P < 0 01 vs. AGS / Psilencer3 1 由于 MMP 2 和 VEGF 与癌细胞的转移密切相关, 本文进一步检测了沉默胃泌素基因对胃癌细胞分泌 MMP 2 和 VEGF 的影响. 结果显示,AGS / Gas sirna 细胞培养上清液中,MMP 2 VEGF 的浓度均低于空载体稳转的细胞, 差异有统计学意义 ( Fig. 5).

5 第９期曾怡等沉默胃泌素基因抑制胃癌细胞的增殖迁移和侵袭９０９３讨论胃癌作为常见的恶性肿瘤在中国的发病率和病死率处于所有恶性肿瘤的第２位而胃癌治疗失败的主要原因是胃癌的侵袭和转移故抑制癌细胞的增殖及侵袭转移就成为了目前研究的重点Ｆｉｇ５ＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＭＭＰ２ａｎｄＶＥＧＦｉｎｍｅｄｉｕｍｏｆｇａｓｔｒｉｎｓｉｌｅｎｃｅｄｃｅｌｌｓＴｈｅＡＧＳＧａｓｓｉｒｎａａｎｄＡＧＳＰｓｉｌｅｎｃｅｒ３１ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｓｅｅｄｅｄｉｎａ６ｗｅｌｌｐｌａｔｅｉｎｔｒｉｐｌｅａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒ３ｄａｙｓｔｈｅｎｔｈｅｍｅｄｉｕｍｗａｓｒｅｍｏｖｅｄａｎｄｔｈｅｓｅｒｕｍｆｒｅｅＲＰＭＩ１６４０ｗａｓａｄｄｅｄｔｏｅａｃｈｗｅｌｌｏｖｅｒｎｉｇｈｔＴｈｅｍｅｄｉｕｍｗａｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＭＭＰ２ａｎｄＶＥＧＦｂｙＥＬＩＳＡＰ００１ｖｓＡＧＳＰｓｉｌｅｎｃｅｒ３１研究证明胃泌素在胃癌细胞的增殖过程中发挥重要作用利用胃泌素处理胃癌细胞通过其受体可激活蛋白激酶ＣＰＫＣ磷脂酰肌醇３激酶ＰＩ３Ｋ及丝裂酶原蛋白激酶ＭＥＫ１等肿瘤生长相关蛋白质的信号途径从而促进胃癌细胞的增殖６虽然临床研究发现血清胃泌素浓度与胃癌转移相关但其直接证据和分子机制报道较少本室Ｆｉｇ４ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｇａｓｔｒｉｎｓｉｌｅｎｃｅｄｃｅｌｌｓｂｙｃｅｌｌｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇａｓｓａｙＡａｎｄＴｒａｎｓｗｅｌｌａｓｓａｙＢＡＷｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇａｓｓａｙｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｎｇａｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｍｉｇｒａｔｏｒｙａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｃｅｌｌｓｗｉｔｈｇａｓｔｒｉｎｓｉｌｅｎｃｉｎｇｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌｃｅｌｌｓｗｉｔｈｅｍｐｔｙｖｅｃｔｏｒｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＩｍａｇｅｓｗｅｒｅｔａｋｅｎｆｒｏｍｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇａｓｓａｙａｔ０ａｎｄ２４ｈｏｕｒｓｏｆｃｕｌｔｕｒｉｎｇｕｎｄｅｒａｎｉｎｖｅｒｔｅｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ１００ＲｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｎａｒｅｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｏｆｔｈｒｅｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓＢＴｈｅｃｅｌｌｓｗｅｒｅｓｅｅｄｅｄｏｎｔｈｅｕｐｐｅｒｃｈａｍｂｅｒｓｃｏａｔｅｄｗｉｔｈｉｎｖａｓｉｏｎｏｒｗｉｔｈｏｕｔｍｉｇｒａｔｉｏｎＭａｔｒｉｇｅｌＭａｔｒｉｘｉｎＴｒａｎｓｗｅｌｌＦｏｌｌｏｗｉｎｇｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｆｏｒ２４ｈｏｕｒｓｔｈｅｃｅｌｌｓｗｅｒｅｒｅｍｏｖｅｄｆｒｏｍｔｈｅｕｐｐｅｒｓｕｒｆａｃｅｏｆｔｈｅｗｅｌｌｓａｎｄｔｈｅｃｅｌｌｓｔｈａｔｈａｄｍｉｇｒａｔｅｄｏｒｉｎｖａｄｅｄｔｏｔｈｅｌｏｗｅｒｓｕｒｆａｃｅｏｆｔｈｅｗｅｌｌｓｗｅｒｅｓｔａｉｎｅｄｂｙｃｒｙｓｔａｌｖｉｏｌｅｔａｎｄｔｈｅｉｍａｇｅｓｗｅｒｅｔａｋｅｎｕｎｄｅｒａｎｉｎｖｅｒｔｅｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ４０ＲｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｎａｒｅｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｏｆｔｈｒｅｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓＣＴｈｅｃｅｌｌｓｍｉｇｒａｔｉｎｇａｎｄｉｎｖａｄｉｎｇｔｏｔｈｅｌｏｗｅｒｓｕｒｆａｃｅｏｆＴｒａｎｓｗｅｌｌｗｅｒｅｃｏｕｎｔｅｄｉｎｔｅｎｆｉｅｌｄｓｕｎｄｅｒａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅａｔ４００ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅａｖｅｒａｇｅｎｕｍｂｅｒｏｆｃｅｌｌｓｐｅｒｆｉｅｌｄｗｅｒｅｃａｌｃｕｌａｔｅｄＰ００５ｖｓＡＧＳＰｓｉｌｅｎｃｅｒ３１通过构建高表达胃泌素基因的稳转细胞株发现胃泌素能促进胃癌细胞的迁移和侵袭７本文进一步通过ＲＮＡ干扰技术沉默胃泌素基因抑制胃泌素的表达研究其对胃癌细胞迁移侵袭的影响首先设计靶向胃泌素基因的ｓｉｒｎａ表达框与载体Ｐｓｉｌｅｎｃｅｒ３１Ｈ１连接经测序鉴定成功获得了Ｐｓｉｌｅｎｃｅｒ３１Ｇａｓｓｉｒｎａ真核表达载体将此载体转染胃癌细胞ＡＧＳＧ４１８筛选后获得了稳转胃癌细胞株ＡＧＳＧａｓｓｉｒｎａ与空载体的稳转细胞株ＡＧＳＰｓｉｌｅｎｃｅｒ３１比较ＡＧＳＧａｓｓｉｒｎａ细胞中不仅胃泌素ｍｒｎａ的表达水平显著低于对照细胞而且分泌的胃泌素含量也显著低于对照细胞提示成功建立了沉默Ｇａｓｔｒｉｎ基因的胃癌细胞株胃泌素促进胃肠肿瘤细胞的增殖已有研究证实Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ等８在小鼠模型中发现胃泌素可以

6 910 第 30 卷刺激肠道肌纤维母细胞分泌胰岛素样生长因子 2, 增加肠上皮细胞的增殖, 促进肿瘤形成. 前胃泌素还可通过与胃泌素受体结合抑制骨形态发生蛋白 (BMP) 的表达来促进结肠细胞的增殖和分裂 [9]. 也有研究发现, 胃泌素能诱导 ERK1 和 ERK2 的磷酸化促进胃黏膜细胞的增殖 [10]. 与这些研究结果一致, 本文发现, 沉默胃泌素基因后, 不仅抑制了胃癌细胞的增殖率, 细胞体外集落形成能力也显著降低, 提示细胞的锚定增殖能力及体外成瘤性降低. 虽然已经证实胃泌素能促进癌细胞的增殖, 但胃泌素是否参与癌细胞的迁移和侵袭研究较少. 数篇报 [11 13] 道用外源性胃泌素体外刺激胃癌细胞, 促进了细胞的迁移. 本文 Transwell 实验显示, 沉默胃泌素基因后, 胃癌细胞的迁移能力及体外穿越基质膜的侵袭能力显著降低. 沉默胃泌素基因使胃癌细胞体外侵袭能力降低, 可能与细胞分泌基质金属蛋白酶 ( MMPs ) 有关. MMP 2 是降解血管基底膜和细胞外基质的主要成分, 可促进肿瘤的侵袭和转移 [14 16]. Kamata [17,18] 等研究发现,MMP 2 的表达与直肠腺癌患者有无淋巴结转移浸润深度和肿瘤大小等密切相关, 推测 MMP 2 增强了癌细胞的侵袭和转移能力. 新生血管形成也是肿瘤侵袭和转移的重要因素, 不仅为肿瘤的生长提供养料, 也为肿瘤细胞的转移提供途径. 血管内皮生长因子 ( VEGF) 是促进新生血管形成的重要因子, 它能增加血管通透性, 促进内皮细胞的增殖, 诱导血管形成, 还可以直接作用于肿瘤细胞, 促进肿瘤细胞的生长 [19]. 本文通过 ELISA 法检测沉默胃泌素基因后细胞分泌 MMP 2 VEGF 的能力, 发现与对照细胞比较, 二者的分泌量均显 [20] 著减少. 任伟等利用免疫组化染色与临床病理分析发现, MMP 2 与 VEGF 的表达与肿瘤的浸润深度淋巴远处转移密切相关. 由此本文推测, 抑制胃泌素基因的表达, 可能通过降低细胞释放 MMP 2 和 VEGF, 使胃癌细胞的迁移侵袭能力受抑制, 这可能是胃泌素促进胃癌细胞侵袭转移的机制之一. 总之, 本研究成功获得了沉默胃泌素基因的稳转胃癌细胞株, 并发现沉默胃泌素基因可能通过降低细胞分泌 MMP 2 和 VEGF 的能力, 抑制了细胞的增殖迁移和侵袭, 这可能是胃泌素参与胃癌侵袭转移的分子机制. 参考文献 (References) [ 1 ] Pakin D M, Bray F, Ferlay J, et al. Global cancer statistics [J]. CA Cancer J Clin, 2005, 55(2): [ 2 ] Li W Q, Zhang L, Ma J L, et al. Association between genetic polymorphisms of DNA base excision repair genes and evolution of precancerous gastric lesions in a Chinese population [ J ]. Carcinogenesis, 2009, 30(3): [ 3 ] 程兆明, 李龙, 陈琳娜. 血清胃蛋白酶原 I Ⅱ 与胃泌素联合检测对胃癌的诊断价值 [J]. 中华消化内镜杂志 (Cheng Z M, Li L,Chen L N, et al. Diagnostic value of combined detection of serum pepsinogen I, Ⅱ and gastrin in gastric cancer[j]. Chin J Dig Endosc), 2002, 19(1): [ 4 ] Mishra P, Senthivinayagam S, Rangasamy V, et al. Mixed lineage kinase 3 / JNK1 axis promotes migration of human gastric cancer cells following gastrin stimulation [ J]. Mol Endocrinol, 2010, 24(3): [ 5 ] Grabowska A M, Hughes J, Watson S A. Use of interfering RNA to investigate the role of endogenous gastrin in the survival of gastrointestinal cancer cells [ J]. Br J Cancer, 2007, 96 (3 ): [ 6 ] Mishra P, Senthivinayagam S, Rana A, et al. Glycogen synthase kinase 3beta regulates snail and beta catenin during gastrin induced migration of gastric cancer cells [ J]. J Mol Signal, 2010, 5(1): 1 9 [ 7 ] 刘骏, 周建奖, 谢渊, 等. 过表达胃泌素促进胃癌细胞的增殖迁移和侵袭 [J]. (Liu J, Zhou J J, Xie Y, et al. Overexpression of gastrin promotes the proliferation,migration and invasion of gastric cancer cells[ J]. Chin J Biochem Mol Biol), 2013, 29(4): [ 8 ] Duckworth C A, Clyde D, Worthley D L, et al. Progastrin induced secretion of insulin like growth factor 2 from colonic myofibroblasts stimulates colonic epithelial proliferation in mice [ J]. Gastroenterology, 2013, 145(1): [ 9 ] Jin G, Westphalen C B, Hayakawa Y, et al. Progastrin stimulates colonic cell proliferation via CCK2R and β arrestin dependent suppression of BMP2 [ J]. Gastroenterology, 2013, 145(4): [10] Steigedal T S, Prestvik W S, Selvik L K, et al. Gastrin induced proliferation involves MEK partner 1 ( MP1) [ J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 2013, 49(3): [11] Burkitt M D, Varro A, Pritchard D M, et al. Importance of gastrin in the pathogenesis and treatment of gastric tumors[ J]. World J Gastroenterol, 2009, 15(1):1 16 [12] Misund K, Selvik L K, Rao S, et al. NR4A2 is regulated by gastrin and influences cellular responses of gastric adenocarcinoma cells [ J]. PLoS One, 2013, 8(9): e76234 [13] Mishra P, Senthivinayagam S, Rangasamy V, et al. Mixed lineage kinase 3 / JNK1 axis promotes migration of human gastric cancer cells following gastrin stimulation [ J]. Mol Endocrinol, 2010, 24(3): [14] Sun J, Hemler M E. Regulation of MMP 1 and MMP 2 production through CD147 / extracellular matrix metalloproteinase inducer interactions [ J]. Cancer Res, 2001, 61(5): [15] Wang B, Xu Y F, He B S, et al. RNAi mediated silencing of

7 第 9 期曾怡等 : 沉默胃泌素基因抑制胃癌细胞的增殖迁移和侵袭 911 CD147 inhibits tumor cell proliferation, invasion and increases chemosensitivity to cisplatin in SGC7901 cells in vitro [ J]. J Exp Clin Cancer Res, 2010, 29:61 [16] Zheng H, Takahashi H, Murai Y, et al. Expressions of MMP 2, MMP 9 and VEGF are closely linked to growth, invasion, metastasis and angiogenesis of gastric carcinoma [ J]. Anticancer Res, 2006, 26(5A): [17] Kamata I,Ishikawa Y,Akishima Fukasawa Y,et al. Significance of lymphatic invasion and cancer invasion related proteins on lymph node metastasis in gastric cancer [ J]. J Gastroenterol Hepatol, 2009, 24(9): [18] Ahmed M M,Mohammed S H. Matrix meta11oproteinases 2 and 9 in situ mrna expression in colorectal tumors from Iraqi patients [J]. Indian J Pathol Microbiol, 2011, 54(1): 7 14 [19] 张淑华, 葛银林, 罗达亚, 等. 小干扰 RNA 靶向 VEFG 基因体内外抑制乳腺癌细胞 MCF 7 的增殖 [J]. 中国生物化学与分子生物学报 ( Zhang S H, Ge Y L, Luo D Y, et al. Small interfering RNAs directed against VEGF gene inhibit proliferation of breast cancer cells in vitro and in vivo[ J]. Chin J Biochem Mol Biol), 2007, 23(01): [20] 任伟, 禹立霞, 钱晓萍, 等. 胃癌患者血清 VEGF MMP 2 的表达及其与浸润和转移的关系 [ J]. 肿瘤学杂志 ( Ren W,Yu L X, Qian X P, et al. Expression of serum VEGF and MMP 2 in gastric carcinoma and its relationship with invasion and metastasis [J]. J Oncol), 2008, 14(10):

1 MCF-7 VEGF spss 20 5 ~ 6 h Cck-8 6 h r 2 = Cck-8 6 h 450 nm v Cck-8 v = h 450 nm 3 A = A - A A r 2 Cck -8 Mcf-7 1

1 MCF-7 VEGF spss 20 5 ~ 6 h Cck-8 6 h r 2 = Cck-8 6 h 450 nm v Cck-8 v = h 450 nm 3 A = A - A A r 2 Cck -8 Mcf-7 1 42 1 Vol 42 No 1 2018 1 Journal of Jiangxi Normal University Natural Science Jan 2018 1000-5862 2018 01-0100-06 MCF-7 VEGF 1 2 1 1 1 1* 1 570228 2 70102 Mcf -7 Cck-8 TUNEL- DAPI Cck-8 Cck-8 TUNEL-DAPI