14 吴巍芸, 等. MiR-192 对结直肠癌细胞 ZEB2 表达及迁移和侵袭的影响结直肠癌 (colorectal cancer,crc) 是消化系统常见的恶性肿瘤之一, 其侵袭和转移是导致肿瘤进展及术后复发的重要原因 CRC 的发病机制目前尚未完全明了, 可能与多种因素和多基因参与有关研究

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舟酌苗
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1 肿瘤 2014 年 1 月第 34 卷第 1 期 TUMOR Vol. 34, January 基础研究 Basic Research DOI: /j.issn Copyright 2014 by TUMOR MiR-192 对结直肠癌细胞 ZEB2 表达及迁移和侵袭的影响吴巍芸, 梁坚, 叶石才, 周宇广东医学院附属医院消化内科, 广东湛江 [ 摘要 ] 目的 : 探讨 mir-192 对结直肠癌 SW480 和 SW620 细胞 ZEB2(zinc-finger E-box binding homeobox 2) 表达及迁移和侵袭能力的影响方法 : 将 mir-192 模拟物 (mir-192 mimics) 分别转染 SW480 和 SW620 细胞, 应用实时荧光定量 RT-PCR 和蛋白质印迹法检测转染后 SW480 和 SW620 细胞中 mir-192 ZEB2 mrna 和 ZEB2 蛋白的表达, 细胞划痕实验和 Transwell 侵袭实验检测转染后 SW480 和 SW620 细胞迁移和侵袭能力的改变将重组载体 pmir-zeb2-wt 和 mir-192 mimics 共转染入 SW480 细胞, 应用双荧光素酶报告基因验证 ZEB2 基因 3 端非翻译区 (3 -untranslated region,3 -UTR) 是否有 mir-192 的结合位点结果 : 与转染 mir-192 模拟物阴性对照组比较,miR-192 mimics 转染后 SW480 和 SW620 细胞中 mir-192 的表达水平上调 (P < 0.05),ZEB2 mrna 及其蛋白的表达水平明显下调 (P < 0.05), 细胞的迁移和侵袭能力下降 (P < 0.05) 双荧光素酶报告基因验证结果显示,pmiR-ZEB2-wt 和 mir-192 mimics 共转染后,SW480 细胞中荧光素酶活性下降 (P < 0.05), ZEB2 基因 3 -UTR 存在 mir-192 的结合位点结论 :ZEB2 可能是 mir-192 的靶基因之一, 上调 SW480 和 SW620 细胞中 mir-192 的表达可抑制 ZEB2 的表达, 发挥抑制细胞迁移和侵袭的作用 [ 关键词 ] 结直肠肿瘤 ; 微 RNAs; 肿瘤侵润 ;ZEB2; 细胞,SW480,SW620 [ 中图分类号 ] R735.3 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2014) Effects of mir-192 on the expression of ZEB2 and the abilities of migration and invasion of colorectal cancer cells WU Wei-yun, LIANG Jian, YE Shi-cai, ZHOU Yu Department of Gastroenterology, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang , Guangdong Province, China [ABSTRACT] Objective: To investigate the effects of mir-192 on the expression of zinc-finger E-box binding homeobox 2 (ZEB2) and the abilities of migration and invasion of colorectal cancer (CRC) SW480 and SW620 cells. Methods: After transfection of mir-192 mimics into SW480 and SW620 cells, the expression levels of mir-192 and ZEB2 mrna and ZEB2 protein were detected by real-time fluorescence quantitative RT-PCR and Western blotting, respectively. The abilities of migration and invasion of SW480 and SW620 cells after transfection with mir-192 mimics were determined by wound healing and Transwell assays, respectively. The recombinant vector pmir-zeb2-wt and mir-192 mimics were cotransfected into SW480 cells. The binding site of 3 -untranslated region (3 -UTR) of ZEB 2 gene with mir-192 was verified by Dual Luciferase TM Reporter Gene Assay. Results: As compared with the negative control (NC) group (transfection with mir-192 mimics-nc), the expression levels of mir-192 in SW480 and SW620 cells after transfection with mir-192 mimics were increased (P < 0.05), and the expression levels of ZEB2 mrna and protein were decreased (P < 0.05), as well as the abilities of migration and invasion of SW480 and SW620 cells were inhibited (P < 0.05). The Dual Luciferase TM Reporter Gene Assay revealed that the luciferase activity in SW480 cells after co-transfection with recombinant vector pmir- ZEB2-wt and mir-192 mimics was inhibited (P < 0.05), which indicated that the 3 -UTR of ZEB2 harbored a binding site for mir-192. Conclusion: ZEB2 may be one of the target genes for mir-192. Overexpression of mir-192 may down-regulate the ZEB2 expression and inhibit the migration and invasion of SW480 and SW620 cells. [KEY WORDS] Colorectal neoplasms; MicroRNAs; Neoplasm invasiveness; Zinc-finger E-box binding homeobox 2; Cells, SW480, SW620 [TUMOR, 2014, 34 (01): 13-18] Correspondence to: ZHOU Yu( 周宇 ) ahdg2005@126.com Received Accepted

2 14 吴巍芸, 等. MiR-192 对结直肠癌细胞 ZEB2 表达及迁移和侵袭的影响结直肠癌 (colorectal cancer,crc) 是消化系统常见的恶性肿瘤之一, 其侵袭和转移是导致肿瘤进展及术后复发的重要原因 CRC 的发病机制目前尚未完全明了, 可能与多种因素和多基因参与有关研究发现, 微小 RNA(microRNA, mirna,mir) 通过对其靶基因的调控, 在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用, 其已成为肿瘤干预性治疗的重要靶点 [1] 研究发现,CRC 与多种 mirna 有关,miR-192 在 CRC 组织中的表达明显下调 [1-4] 本研究通过分析 mir-192 对 ZEB2 (zinc-finger E-box binding homeobox 2) 的调控作用及其对 CRC 细胞迁移和侵袭的影响, 为研究肿瘤的发展机制及治疗提供新的思路 1 材料与方法 1.1 主要材料人结直肠癌 SW480 和 SW620 细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库, 胎牛血清 RPMI 1640 培养液和 Opti-MEMⅠ 培养液购自美国 Gibco 公司, 人 mir-192 模拟物 (mir-192 mimics) mir-192 模拟物阴性对照 (negative control,nc)(mir-192 mimics- NC) 含双荧光素酶报告基因和 mir-192 预测结合位点 ZEB2 基因 3 端非翻译区 (3 -untranslated region,3 -UTR) 序列的重组载体 pmir-zeb2- wt 以及含双荧光素酶报告基因和 mir-192 预测结合位点 ZEB2 基因 3 -UTR 突变序列的重组载体 pmir-zeb2-mut 购自广州锐博生物科技有限公司, 转染试剂 LipofectAMINE TM 2000 购自美国 Invitrogen 公司,RNAiso Plus One Step PrimeScript mirna cdna Synthesis Kit PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time) 和 SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ(Perfect Real Time) 均购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司, mir-192 U6 ZEB2 和 β-actin 引物由生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司合成, 细胞裂解液 BCA 蛋白浓度测定试剂盒小鼠抗人 β-actin 单克隆抗体辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或羊抗小鼠 IgG 二抗和增强型化学发光 (enhanced chemiluminescence,ecl) 试剂盒购自碧云天生物技术研究所, 兔抗人 ZEB2 多克隆抗体购自美国 Santa Cruz 公司, 双荧光素酶报告系统检测试剂盒购自美国 Promega 公司,Matrigel 购自美国 BD 公司,Transwell 侵袭小室 (8 μm 孔径 ) 购自美国 Corning 公司 1.2 细胞培养及 mir-192 mimics 转染 SW480 和 SW620 细胞用含 10% 胎牛血清,100 U/mL 青霉素和质量浓度为 100 μg/ml 链霉素的 RPMI 1640 培养液, 置于 37 CO 2 体积分数为 5% 的培养箱中培养, 取对数生长期的细胞进行实验将 SW480 和 SW620 细胞分别以个 / 孔的密度接种于 6 孔板中, 培养 24 h, 细胞约 60% 融合时按转染试剂 LipofectAMINE TM 2000 说明书提供的方法进行转染, 以 Opti-MEMⅠ 作为转染培养液实验分 2 组 :(1)miR-192 mimics 转染组, 将终浓度为 100 nmol/l 的 mir-192 mimics 转染入细胞 ;(2)NC 组, 将 100 nmol/l 的 mir-192 mimics-nc 转染入细胞 1.3 实时荧光定量 RT-PCR 检测 mir-192 mimics 转染后 SW480 和 SW620 细胞中 mir-192 和 ZEB2 mrna 的表达收集转染 48 h 后的各组细胞, 应用 RNAiso Plus 提取细胞总 RNA 应用 One Step PrimeScript mirna cdna Synthesis Kit ( 含 mirna 和 U6 下游引物 ) 将 RNA 反转录成 cdna 以扩增 mir-192 和 U6, 应用 PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time) 将 RNA 反转录成 cdna 以扩增 ZEB2 和 β-actin 以 cdna 为模板按 SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ(Perfect Real Time) 试剂盒说明书提供的方法进行 PCR MiR-192 以 U6 作为内参照,ZEB2 以 β-actin 作为内参照 MiR-192 上游引物序列为 5 -CT- GACCTATGAATTGACAGCC-3, -3,U6 上游引物序列为 5 -CTCGCTTCGGCAGCACA-3-3 ZEB2 上游引物序列为 5 -TCTGCGACAT- AAATACGA-3, -3,ZEB2 下游引物序列为 5 -GAGTGAAGCCTTGAGTGC-3 ; -3 ;β-actin 上游引物序列为 5 -GGCGGCAACACCATG- TACCCT-3, -3,β-actin 下游引物序列为 5 -AG- GGGCCGGACTCGTCATACT-3 PCR 反应条件 :95 预变性 30 s,95 变性 5 s 60 退火延伸 20 s, 共 40 个循环 ZEB2 mrna 和 mir-192 的相对表达水平以 2 - ΔCt 表示实验重复 3 次 1.4 蛋白质印迹法检测 mir-192 mimics 转染后 SW480 和 SW620 细胞中 ZEB2 蛋白的表达收集转染 72 h 后的各组细胞, 应用细胞裂解液裂解细胞, 并提取细胞总蛋白,BCA 法测定蛋白质浓度, 取 30 μg/ 孔蛋白质进行 6% SDS-PAGE, 将电泳分离后的蛋白质电转移至聚偏二氟乙烯膜上 ;5% 脱脂奶粉溶液于室温下封闭 1 h, 加入 1 : 500 稀释的抗 ZEB2 抗体和 1 :1 000 稀释的抗 β-actin 抗体 ( 内参照 ),4 反应过夜 ;TBST 漂洗后, 加入 1 :1 000 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或羊抗小鼠 IgG 二抗于室温下反应 1 h; TBST 漂洗后, 加入 ECL 发光液,X 光压片显

3 吴巍芸, 等. MiR-192 对结直肠癌细胞 ZEB2 表达及迁移和侵袭的影响 15 影应用 Quantity One 软件分析蛋白质条带的灰度值, 以目的蛋白条带的灰度值与内参照 β-actin 蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平实验重复 3 次 1.5 双荧光素酶报告基因验证 ZEB2 基因 3 -UTR 是否有 mir-192 的结合位点收集对数生长期的 SW480 细胞铺于 24 孔细胞培养板中, 按转染试剂 LipofectAMINE TM 2000 说明书提供的方法进行转染, 以 Opti-MEMⅠ 为转染培养液分别将 mir-192 mimics pmir-zeb2- wt mir-192 mimics-nc 和 pmir-zeb2-mut 转染至 SW480 细胞实验分为 4 组 :(1)miR-192 mimics + pmir-zeb2-wt 组 ;(2)miR-192 mimics-nc + pmir-zeb2-wt 组 ;(3)miR-192 mimics + pmir-zeb2-mut 组 ;(4)miR-192 mimics-nc + pmir-zeb2-mut 组收集转染 48 h 后的细胞, 按双荧光素酶报告系统检测试剂盒说明书提供的方法检测各组细胞中的荧光素酶活性, 比较各 mimics 组与对应的 NC 组细胞中海肾荧光素酶活性与萤火虫荧光素酶活性的比值, 以各相应的 NC 组为 1 作图实验重复 3 次 1.6 细胞划痕实验检测 mir-192 mimics 转染后 SW480 和 SW620 细胞的迁移能力实验分组与 1.2 节相同 MiR-192 mimics 和 mir-192 mimics-nc 转染 48 h 后, 用 10 μl 加样器枪尖在每个细胞培养孔内划痕 ( 作为 0 h), 用记号笔在细胞培养板底随机标记 5 个观察点 ;PBS 洗涤细胞 3 次, 去除划下的细胞, 加入无血清的 RPMI 1640 培养液, 继续培养细胞 36 h 后, 在光学显微镜下观察细胞的划痕愈合能力, 应用 Quantity One 软件分析划痕面积, 并计算划痕的愈合率划痕的愈合率 =( 迁移前划痕面积 - 迁移后划痕面积 )/ 迁移前划痕面积 100% 实验重复 3 次 1.7 Transwell 侵袭实验检测 mir-192 mimics 转染后 SW480 和 SW620 细胞的侵袭能力实验分组与 1.2 节相同将 Transwell 小室置于 24 孔细胞培养板中,Matrigel 稀释后包被 8 μm 孔径的 Transwell 上室底部内表面收集转染 48 h 后的各组细胞, 调整细胞密度至个 /ml, 以无血清 RPMI 1640 培养液 200 μl 重悬细胞, 加入小室上层 ; 再向小室下层加入 600 μl 含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养液作为趋化因子 ; 细胞培养 24 h 后, 从细胞培养板中移出小室, 以棉棒拭去 Transwell 上室底部内表面未通过微孔的细胞, 将小室置于 4% 多聚甲醛溶液中固定,0.1% 结晶紫染色在光学显微镜下观察, 每个小室随机选取 5 个视野 ( 100), 计数穿膜细胞数实验重复 3 次 1.8 统计学方法采用 SPSS 19.0 统计软件进行分析计量数据以 ± s 表示, 两组间比较采用两个独立样本 t 检验 P < 0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 MiR-192 mimics 转染后 SW480 和 SW620 细胞中 mir-192 的表达水平上调实时荧光定量 RT-PCR 检测结果 ( 图 1A) 显示, 与转染 mir-192 mimics-nc 组比较,miR-192 mimics 转染组细胞中 mir-192 的表达水平明显上调, 分别是 NC 组的倍 (SW480 细胞 ) 和倍 (SW620 细胞 ), 差异有统计学意义 (P < 0.05) Fig. 1 The expression levels of mir-192 and zinc-finger E-box binding homeobox 2 (ZEB2) mrna and ZEB2 protein in colorectal cancer SW480 and SW620 cells after transfection with mir-192 mimics were detected by real-time fluorescence quantitative RT-PCR (A) and Western blotting (B), respectively (n=3). 1: SW480 or SW620 cells tansfected with mir-192 mimics; 2: SW480 or SW620 cells tansfected with mir-192 mimics-negative control (NC). * P<0.05. 图 1 实时荧光定量 RT-PCR 法 (A) 和蛋白质印迹法 (B) 检测 mir-192 mimics 转染后结直肠癌 SW480 和 SW620 细胞中 mir-192 和 ZEB2 mrna 以及 ZEB2 蛋白的表达

4 16 吴巍芸, 等. MiR-192 对结直肠癌细胞 ZEB2 表达及迁移和侵袭的影响 2.2 MiR-192 mimics 转染后 SW480 和 SW620 细胞中 ZEB2 mrna 和蛋白的表达水平下调实时荧光定量 RT-PCR 检测结果 ( 图 1A) 显示, 与转染 mir-192 mimics-nc 组比较,miR-192 mimics 转染组细胞中 ZEB2 mrna 的表达水平明显下降, 差异有统计学意义 (P < 0.05) 蛋白质印迹法检测结果 ( 图 1B) 显示, 与转染 mir-192 mimics-nc 组比较,miR-192 mimics 转染组细胞中 ZEB2 蛋白的表达水平明显下降, 差异有统计学意义 (P < 0.05) 2.3 MiR-192 可与 SW480 细胞中 ZEB2 基因 3 -UTR 位点结合双荧光素酶报告基因检测结果 ( 图 2) 显示,miR-192 mimics + pmir-zeb2- wt 组 SW480 细胞中海肾荧光素酶活性与萤火虫荧光素酶活性的比值低于 mir-192 mimics-nc + pmir-zeb2-wt 组, 差异有统计学意义 (t = 5.88, P < 0.05);miR-192 mimics + pmir-zeb2-mut 组 SW480 细胞中海肾荧光素酶活性与萤火虫荧光素酶活性的比值与 mir-192 mimics-nc + pmir-zeb2-mut 组之间无明显变化, 差异无统计学意义 (t = ,P > 0.05) 这一结果说明, mir-192 可与 ZEB2 基因 3 -UTR 位点结合, 使海肾荧光素酶基因转录受阻, 海肾荧光素酶活性与萤火虫荧光素酶活性的比值下降 2.4 MiR-192 抑制 SW480 和 SW620 细胞的迁移能力细胞划痕实验检测结果 ( 图 3) 显示, 细胞划痕 36 h 后,miR-192 mimics 转染组 SW480 和 SW620 细胞划痕区的愈合率低于 mir-192 mimics-nc 转染组, 差异有统计学意义 (P < 0.05) 这一结果说明,miR-192 具有抑制 SW480 和 SW620 细胞迁移的能力 2.5 MiR-192 抑制 SW480 和 SW620 细胞的侵袭能力 Transwell 检测结果 ( 图 4) 显示,miR-192 mimics 转染组 SW480 和 SW620 细胞的穿膜细胞数少于 mir-192 mimics-nc 转染组, 差异均有统 Relative luciferase activity Fig. 2 The change of luciferase activity in SW480 cells after transfection with recombinant vector pmir-zeb2-wt containing dual luciferase reporter gene and mir-192 mimics was evaluated by Dual Luciferase TM Reporter Gene Assay. Fold change relative to the corresponding negative control (NC) was used (n=3). 1: SW480 cells were transfected with mir-192 mimics and pmir-zeb2-wt; 2: SW480 cells were transfected with mir-192 mimics-nc and pmir-zeb2- wt; 3: SW480 cells were transfected with mir-192 mimics and pmir-zeb2-mut; 4: SW480 cells were transfected with mir-192 mimics-nc and pmir-zeb2-mut. * P<0.05. 图 2 双荧光素酶报告基因检测转染双荧光素酶报告基因重组载体和 mir-192 mimics 后 SW480 细胞中的荧光素酶活性变化 Fig. 3 The wound healing rates of SW480 and SW620 cells after transfection with mir-192 mimics were evaluated by wound healing assay ( 40) (n=3). 1: SW480 cells were transfected with mir-192 mimics; 2: SW480 cells were transfected with mir-192 mimics-negative control (NC); 3: SW620 cells were transfected with mir-192 mimics; 4: SW620 cells were transfected with mir-192 mimics-nc. * P<0.05. 图 3 细胞划痕实验检测 mir-192 mimics 转染后 SW480 和 SW620 细胞的划痕愈合率

5 吴巍芸, 等. MiR-192 对结直肠癌细胞 ZEB2 表达及迁移和侵袭的影响 17 计学意义 (P < 0.05) 这一结果说明,miR-192 具有抑制 SW480 和 SW620 细胞侵袭的能力 Fig. 4 The invasive abilities of SW480 and SW620 cells after transfection with mir-192 mimics were evaluated by Transwell assay (crystal violet staining, 100) (n =3). 1: SW480 cells were transfected with mir-192 mimics; 2: SW480 cells were transfected with mir-192 mimicsnegative control (NC); 3: SW620 cells were transfected with mir-192 mimics; 4: SW620 cells were transfected with mir-192 mimics-nc. * P<0.05. 图 4 Transwell 侵袭实验检测 mir-192 mimics 转染后 SW480 和 SW620 细胞的侵袭能力 3 讨论 MiRNA 是一类长度约 18 ~ 25 个核苷酸组成的非编码小分子 RNA, 广泛参与生物体内的多种生理过程 ( 如个体发育, 细胞增殖凋亡和分化, 代谢与应激反应的调节, 肿瘤形成等 ) [5] MiRNA 与靶 mrna 的 3 -UTR 完全和部分互补性结合, 从而引起靶 mrna 的降解或者阻遏其转录后翻译 [6] 多项研究显示,miRNA 异常表达与人类多种肿瘤的发病机制有关,miRNA 具有类似原癌基因或抑癌基因的功能, 在肿瘤的发生和发展中发挥作用 [7-9] 在 CRC 的发生和发展过程中亦存在特异性 mirna 的上调或下调 Motoyama 等 [10] 发现,miR-17-5p mir-18a mir-20a 和 mir-92 的表达水平与 CRC 患者的临床分期有关,Ⅳ 期 CRC 患者的表达率明显高于 Ⅱ 期患者, 且 mir-18a 的表达水平可作为预测 CRC 患者术后生存率的指标研究发现,miR-192 在 CRC 组织和 CRC 细胞中表达降低 [1-4], 过表达 mir-192 可能通过 p53 依赖途径抑制 CRC 细胞增殖并诱发细胞周期停滞, 抑制细胞克隆的形成, 说明 mir-192 可能发挥类似抑癌基因的作用而抑制 CRC 的发生和发展 [11, 12] 本研究结果显示, 转染 mir-192 mimics 后 SW480 和 SW620 细胞的迁移及侵袭能力均明显下降这一结果说明,miR-192 可能抑制 CRC 细胞的侵袭和转移, 支持上述 mir-192 抑制 CRC 发生和发展的观点 MiR-192 是否通过某些基因调控 CRC 细胞而发挥上述作用呢? 通过互联网 ( microrna 靶基因预测系统预测发现,ZEB2 基因的 3 -UTR 有 mir-192 结合位点, 推测 mir-192 可能通过与 ZEB2 基因的 3 -UTR 结合, 调控 ZEB2 基因的表达研究发现,ZEB2 通过与 E-cadherin 基因启动子的 E 盒结合, 抑制 E-cadherin 的表达, 诱导细胞发生上皮 - 间质转化, 从而增强细胞的转移和侵袭能力 [13-15] P53 可以通过调控 mir-192 家族, 抑制 ZEB2 的表达, 从而抑制肝癌细胞的上皮 - 间质转化 [16] 在发生肝转移的 CRC 组织中,ZEB2 的表达水平明显升高, 并与肿瘤患者的分期有关, 而且是 CRC 患者生存的独立预后因素 ; 体外实验也显示, 抑制 ZEB2 的表达可降低 CRC 细胞的迁移和侵袭能力 [17] 本研究发现, 与转染 pmir-zeb2-wt + mir-192 mimics-nc 组比较, 转染 pmir-zeb2- wt + mir-192 mimics 的 SW480 细胞中海肾荧光素酶活性与萤火虫荧光素酶活性的比值明显下降 ; 而与转染 pmir-zeb2-mut + mir-192 mimics-nc 组比较, 转染 pmir-zeb2-mut +

6 18 吴巍芸, 等. MiR-192 对结直肠癌细胞 ZEB2 表达及迁移和侵袭的影响 mir-192 mimics 的 SW480 细胞中海肾荧光素酶活性与萤火虫荧光素酶活性的比值变化不大上述结果说明,miR-192 可与 ZEB2 基因 3 -UTR 位点结合, 使海肾荧光素酶基因的转录受阻, 荧光素酶活性比值下降 ; 而 ZEB2 基因 3 -UTR 突变后, 不能与 mir-192 结合, 海肾荧光素酶基因转录正常, 荧光素酶活性比值无明显改变由此提示,ZEB2 基因 3 -UTR 有 mir-192 结合位点本研究还发现,miR-192 mimics 转染后,SW480 和 SW620 细胞中 ZEB2 mrna 及蛋白的表达水平明显下降, 说明在 CRC 细胞中 mir-192 可能通过与 ZEB2 基因 3 -UTR 结合, 调控 ZEB2 的表达 [ 参考文献 ] [1] CORTÉ H, MANCEAU G, BLONS H, et al. MicroRNA and colorectal cancer[j]. Dig Liver Dis, 2012, 44(3): [2] SCHETTER A J, LEUNG S Y, SOHN J J, et al. MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma[j]. JAMA, 2008, 299(4): [3] CHIANG Y, SONG Y, WANG Z, et al. MicroRNA-192, -194 and -215 are frequently downregulated in colorectal cancer[j]. Exp Ther Med, 2012, 3(3): [4] YANTISS R K, GOODARZI M, ZHOU X K, et al. Clinical, pathologic, and molecular features of early-onset colorectal carcinoma[j]. Am J Surg Pathol, 2009, 33(4): [5] BARTEL D P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function[j]. Cell, 2004, 116(2): [6] V A N D E N B E R G A, M O L S J, H A N J. R I S C - target interaction: cleavage and translational suppression[j]. Biochim Biophys Acta, 2008, 1779(11): [7] ESQUELA-KERSCHER A, SLACK F J. OncomirsmicroRNAs with a role in cancer[j]. Nat Rev Cancer, 2006, 6(4): [8] GARTEL A L, KANDEL E S. MiRNAs: little known mediators of oncogenesis[j]. Semin Cancer Biol, 2008, 18(2): [9] 程文捷, 唐健, 黄凤婷, 等. 微小 RNA-143 对人胰腺癌 PANC-1 细胞迁移的抑制作用及其机制的探讨 [J]. 肿瘤, 2012, 32(11): [10] M O T O Y A M A K, I N O U E H, T A K A T S U N O Y, et al. Over- and under-expressed micrornas in human colorectal cancer[j]. Int J Oncol, 2009, 34(4): [11] SONG B, WANG Y, KUDO K, et al. MiR-192 regulates dihydrofolate reductase and cellular proliferation through the p53-microrna circuit[j]. Clin Cancer Res, 2008, 14(24): [12] BRAUN C J, ZHANG X, SAVELYEVA L, et al. p53- responsive micrornas 192 and 215 are capable of inducing cell cycle arrest[j]. Cancer Res, 2008, 68(24): [13] VOULGARI A, PINTZAS A. Epithelial-mesenchymal transition in cancer metastasis: mechanisms, markers and strategies to overcome drug resistance in the clinic[j]. Biochim Biophys Acta, 2009, 1796(2): [14] VANDEWALLE C, VAN ROY F, BERX G. The role of the ZEB family of transcription factors in development and disease[j]. Cell Mol Life Sci, 2009, 66(5): [15] KALLURI R, WEINBERG R A. The basics of epithelialmesenchymal transition[j]. J Clin Invest, 2009, 119(6): [16] KIM T, VERONESE A, PICHIORRI F, et al. P53 regulates epithelial-mesenchymal transition through micrornas targeting ZEB1 and ZEB2[J]. J Exp Med, 2011, 208(5): [17] KAHLERT C, LAHES S, RADHAKRISHNAN P, et al. Overexpression of ZEB2 at the invasion front of colorectal cancer is an independent prognostic marker and regulates tumor invasion in vitro[j]. Clin Cancer Res, 2011, 17(24): [ 本文编辑 ] 张毅

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot