2 mir-615-5p TRAF4 185 NCI-H460 5 Corning 16% non-small cell lung Quick Cell Proliferation Assay Kit K cancer NSCLC 80% CCK-8 Cell Counting Ki
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1 ISSN CN / Q http / /cjbmb. bjmu. edu. cn Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology ~ 190 DOI /j. cnki. cjbmb mir-615-5p TRAF4 * mir-615-5p mir p TRAF4 NSCLC PCR NSCLC HBE 3 NSCLC mir p mir-615-5p NSCLC Western HBE NSCLC TRAF4 TRAF4 NSCLC MTT CCK-8 mir-615-5p mimic NSCLC mir-615-5p TRAF4 mrna TRAF4 pcdna-traf4 TRAF4 mir-615-5p mir-615-5p TRAF4 mrna TRAF4 NSCLC mir-615-5p 4 Q752 Q291 R mir-615-5p Inhibits the Proliferation of NSCLC Cells by Targeting the Oncogene TRAF4 CHEN Gang WANG Guo-Dong * WANG Nai-Hui Department of Respiratory Medicine PLA 425 Hospital Sanya Hainan China Abstract The mechanism for mir-615-5p to inhibit the proliferation of cancer cells is not clear. Here in non-small cell lung cancer NSCLC cells we demonstrated that mir-615-5p was able to negatively regulate an oncogene of TNF-receptor associated factor 4 TRAF4. Real-time quantitative PCR assay was used to detect the mir-615-5p expression in human NSCLC and surrounding tissues then compared with normal lung cell line HBE and three NSCLC cell lines. The results showed that mir-615-5p was markedly downregulated in both NSCLC tissues and cell lines. Western blotting was used to detect the expression of TRAF4 protein in HBE cells and NSCLC cells which significantly increased. MTT and CCK-8 analyses revealed that the mir-615-5p mimic transfection significantly reduced the proliferation of NSCLC cells. Luciferase assay verified the bioinformatic prediction that mir-615-5p targeted the TRAF4 mrna to suppress the expression of TRAF4 protein. When pcdna-traf4 was applied to A549 cells the cell proliferation assay was rescued upon TRAF4 overexpression to counteract the inhibition by mir p. Collectively mir-615-5p targeted to TRAF4 mrna to reduce its protein level thereby inhibited the proliferation of NSCLC cells. Key words non-small cell lung cancer mir-615-5p TNF receptor-associated factor 4 cell proliferation * Tel huanghai598@ 163. com submission029@ gmail. com Received August Accepted November * Corresponding author Tel huanghai598@ 163. com submission029@ gmail. com
2 2 mir-615-5p TRAF4 185 NCI-H460 5 Corning 16% non-small cell lung Quick Cell Proliferation Assay Kit K cancer NSCLC 80% CCK-8 Cell Counting Kit-8 1 Luciferase Reporter Gene Assay Kit Sigma PBS ph % NSCLC 1 g /L DMEM 4 TNFreceptor associated factor 4 TRAF4 TRAF RNA PCR TNF PVDF ECL Millipore TRAF4 β-actin HRP mitogen-activated protein kinases MAPK β transforming growth factor beta TGF-β kappab nuclear factor kappa-lightchain-enhancer of activated B cells NF-κBmimic NC 4 5 TRAF4 mir-615-5p Akt mimic NC mimic RNA pcdna- 6-8 TRAF4 Mir-615-5p RNA microrna mirna 9 DNA mir-615-5p / mir p 80 mir-615-5p mirna ~ mir-615-5p ± mir-615-5p NSCLC 80 NSCLC 1. 3 mir-615-5p HBE SK-MES-1 A549 NCI- mir-615-5p H NSCLC mir-615-5p NSCLC g 5 min NSCLC Invitrogen RNA IgG Abcam has-mir p PCR U6 RNA mir-615-5p has-mir-615-5p 100 ml /L DMEM ml /L CO 2 1 g /L 3 d 1 HBE 1. 4 Has-miR-615-5p SK-MES-1 A549 RNA
3 RNA TRAF4 cdna PCR real-time qpcr has-mir-615-5p 25 μl untranslated region 3' UTR 1 μl cdna 250 ng cdna 0. 5 μl 0. 5 μmol /L μl SYBR Green Master Mix PCR A h Luciferase μl 95 Reporter Gene Assay Kit 2 min s s 40 Bio-Rad PCR 1. 8 IQ5 C t 2 -ΔΔCt x 珋 ± s SPSS 1. 5 Has-miR-615-5p mimic pcdna-traf4 ANOVA P < has-mir-615-5p A Has-mir-615-5p NSCLC 60 pmol NC mimic 60 nmol /L PCR pmol mir-615-5p mimic nmol /L mir-615-5p 3 NSCLC TRAF4 A549 6 has-mir-615-5p P < has-mir-615-5p 45% 80 nmol /L mir-615-5p mimic 80 50% 30% nmol /L mir-615-5p mimic 2 mg pcdna3. 1 Fig. 1A-C 80 nmol /L mir-615-5p mimic 2 mg pcdna-traf μl /mg PCR SK-MES-1 2 μl /40 pmol mimics 48 h A549 NCI-H460 TRAF4 HBE has-mir-615-5p Quick Cell Proliferation Assay Kit / CCK-8 HBE 3 NSCLC has-mir-615-5p P 1. 6 Western TRAF4 mir-615-5p 40% A μg SDS- 50% Fig. 1D Western blotting PAGE 80 V 2. 5 h TRAF4 HBE PVDF 50 mg /ml Tris TRAF h Fig. 1E 1F mir-615-5p TBST 4 8 minhrp IgG has-mir-615-5p mimic NSCLC h TBST 4 8 min ECL SK-MES-1 A549 NCI-H460 Quantity One mir-615-5p mimic 48 h MTT CCK-8 3 PCR TRAF4 mrna 3' 3' pgl3 mir-615-5p mimic One-way 20 has-mir-615-5p 2. 2 Has-mir-615-5p NSCLC < SK-MES-1 NCI-H460 has- 3 NSCLC TRAF4 MTT mir mir-615-5p 615-5p mimic 3 NSCLC
4 2 mir-615-5p TRAF4 187 Fig. 1 Has-mir-615-5p is downregulated in the NSCLC tussues and cell lines A Has-mir-615-5p was downregulated in the squamous cell lung carcinoma n = 30. B Has-mir-615-5p was downregulated in the lung adenocarcinoma n = 30. C Has-mir-615-5p was downregulated in the large cell lung carcinoma n = 20. a P < vs Adjacent non-cancerous tissue. D Has-mir-615-5p was downregulated in NSCLC cell lines SK-MES-1 A549 and NCI-H460. E TRAF4 protein was upregulated in NSCLC cell lines. a P < vs HBE. Each point represents an individual P < vs Control Fig. 2A-C 80 nmol /L 100 nmol /L mir-615-5p mimic P < vs both control and 40 nmol /L group Fig. 2A-C CCK-8 80 nmol /L mir-615-5p mimic 3. P < A mir-615-5p mimic pcdna- A549 21% Fig. 2D 2. 4 TRAF4 mir-615-5p TargetScan mirdb 3 mir-615-5p TRAF4 mrna 3' UTR Fig. 3A 3B 2007 Landgraf 16 mir-615-5p mimic mirna mir-615 P < TRAF4 mir-615-5p mir-615-5p Fig. 3C A549 mir-615- mir-615-5p 5p TRAF4 Fig. 3D 2. 5 TRAF4 mir-615-5p mimic A549 Fig. 4 A549 mir-615-5p mimic MTT CCK-8 P < pcdna-traf4 TRAF4 P > NSCLC NSCLC mir-615-5p
5 mir-615-5p NSCLC mir-615-5p TRAF4 NSCLC NSCLC SK-MES-1 A549 NCI-H460 mir-615-5p mir-615-5p mimic mirna mir-615-5p NSCLC 23 TRAF4 Akt mir-21 let-7 mirnas 18 p mir-615-5p 3 NSCLC TRAF4 22 mirnas TRAF4 mir-615-5p mir-615-5p mir-615-5p 26 mir-615-5p TRAF4 27 TargetScan mirdb TRAF4 28 Fig. 2 Has-mir-615-5p mimic transfection reduces the proliferation of SK-MES-1 A549 and NCI-H460 cells A SK- MES-1 cell proliferation was reduced by the has-mir-615-5p mimic transfection determined by MTT assay. B A549 cell proliferation was reduced by the has-mir-615-5p mimic transfection determined by MTT assay. C NCI-H460 cell proliferation was reduced by the has-mir-615-5p mimic transfection determined by MTT assay. D Proliferation of the cell was reduced by the has-mir-615-5p mimic transfection determined by CCK-8 assay /cm 2 cells were grown into each well on the 6-well plates. On reaching to 30% confluence the cells were transfected with 60 nmol /L negative control NC mimic or mir-615-5p mimic of different concentration arranging from 40 to 100 nmol /L or nonthing. After incubation for 48 hours proliferation of the SK-MES-1 A549 and NCI-H460 cells were determined with MTT. The proliferation of the cells transfected with 80 nmol / L mir-615-5p mimic were detected with CCK-8. n = 6 a P < vs Control b P < vs both control and 40 nmol /L group 12 mir-615-5p 20 mir- NSCLC 615-5p Akt mir-615-5p mir-615-5p mir p mir-615-5p IGF2 mir-615-5p NSCLC
6 2 mir-615-5p TRAF4 189 Fig. 3 Bioinformatics and luciferase reporter gene assays for the targeting relationship between mir-615-5p and TRAF4 A The targeting relationship between mir-615-5p and TRAF4 predicted with Targetscan online server. B The targeting relationship between mir-615-5p and TRAF4 predicted with MiRDB online server. C Luciferase reporter gene assay verified the targeting relationship between mir-615-5p and TRAF4. D Overexpression of mir-615-5p sharply reduced the expression of the TRAF4 protein. On reaching to 70% confluence the A549 cells were transfected with pgl-traf4-3'utr or pgl-traf4-3'utr + 60 nmol /L NC mimic or pgl-traf4-3'utr + 80 nmol /L mir-615-5p mimic. After incubation for 48 hours the luciferase intensity was detected with Microplate Reader. The expression of the TRAF4 protein was detected with Western blotting. n = 6 a P < vs control Fig. 4 The pcdna-traf4 transfection rescues the cell proliferation inhibition by mir-615-5p mimic A The pcdna- TRAF4 transfection rescued the cell proliferation inhibition by mir-615-5p mimic determined by MTT. B The pcdna-traf4 transfection rescued the cell proliferation inhibition by mir-615-5p mimic determined by CCK-8. On reaching to 70% confluence 2 mg of pcdna-traf4 or 80 nmol /L mir-615-5p mimic were used to treat alone or co-treat the A549 cells. After incubation for 48 hours proliferation of the cells were determined with MTT and CCK-8 assayes. n = 6 a P < vs control mir-615-5p References NSCLC TRAF4 1 Ettinger DS Akerley W Borghaei H et al. Non-small cell lung cancer J. J Natl Compr Cancer Netw
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