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1 第 40 卷 01 年月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究 Chinese Journal of Analytical Chemistry 第期 ~ DOI:10.374/SP.J 柱前衍生 - 反相高效液相色谱法测定 - 去氧葡萄糖的含量 尤小云 1, 洪碧红 *,4 谢全灵 易瑞灶 1, 许瑞安 1,3 1 ( 华侨大学分子药物学研究所, 泉州 3601) ( 国家海洋局第三海洋研究所, 厦门 ) 3 ( 分子药物教育部工程研究中心 & 厦门市海洋与基因工程重点实验室, 厦门 36101) 4 ( 厦门大学化学化工学院材料科学与工程系, 厦门 ) 摘要采用对氨基苯甲酸乙酯为衍生化试剂, 建立柱前衍生化反相高效液相色谱法 (RP-HPLC) 测定 - 去氧葡萄糖的含量 结果表明, 最适的衍生化条件为反应温度 85, 反应时间 1.5 h, 衍生化试剂 (ABEE) 和单糖 (-DG/Glu) 的摩尔比为 5 1; 色谱条件为色谱柱 Hypersil ODS (50 mm 4.6 mm,5 mm), 流动相为 0.0% TFA- 乙腈 (80 0,V/V), 流速 1.0 ml/min, 波长 307 nm 本方法在 1~700 mg/l 浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系 (r= ); 定量限 (S/N = 10) 及检出限 (S/N = 3) 分别为 450 和 100 mg/l; 平均加标回收率为 101.7% ;RSD 为 0.7% ; 日内及日间精密度均小于 0.7% 表明本方法灵敏度高, 测定结果准确, 重复性好, 可用于 - 去氧葡萄糖样品的准确定量分析 关键词 - 去氧葡萄糖 ; 柱前衍生 ; 反相高效液相色谱法 ; 对氨基苯甲酸乙酯 1 引言 - 去氧葡萄糖 (-Deoxyglucose,-DG) 是多种天然抗生素及抗肿瘤药物的药效成分, 具有抗肿瘤 抗 [1,] [3,4] 病毒 抗菌 抗衰老 止血及镇痛等多种生理药理效应, 在医药 食品 化妆品及科学研究领域具有 广阔的应用前景 建立 -DG 的快速定量方法, 对糖生物学与糖医学等科学研究及应用具有重要意义 -DG 的检测方法有离子色谱法和柱前衍生高效液相色谱法 [5,6] 前者方便 准确, 但通用性不佳 ; 后 者不仅测定结果准确, 还可以克服其缺点 文献 [6] 曾采用对氨基苯甲酸乙酯 (p-aminobenzoic ethyl ester,abee) 衍生化法分离分析 - 去氧葡萄糖, 但所采用的色谱柱是耐碱性的 C 18 柱, 流动相为 ph 9.0 的 硼酸钾缓冲液, 这对常用的 C 18 柱 (ph=.0~8.0) 几乎不适用 本研究采用 0.0% 三氟乙酸 (ph.65)- 乙 腈为流动相, 适用于几乎所有 C 18 柱, 并以等度洗脱代替梯度洗脱, 缩短分析时间 ; 文献 [7~ 9] 报道过的 ABEE 衍生化法所用的糖浓度都较高 (5.6 mmol/l), 未见采用低浓度糖溶液衍生化的方法 本研究建 立的低浓度 ( mmol/l) 糖溶液衍生化的方法, 为低浓度糖溶液的衍生化提供了参考 本研究采用柱前 衍生 - 反相高效液相色谱法同时分离分析 - 去氧葡萄糖和葡萄糖, 方法具有通用性广 分析时间短 灵敏 度高 测定结果准确 稳定性好等优点 实验部分.1 仪器与试剂 Alliance 695 高效液相色谱仪 ( 配 996 二极管阵列检测器 ), 3100 单级四极杆液质联用仪, MicroMass LCT Premier TM XE 高分辨质谱仪 ( 美国 Waters 公司 );Bruker VERTEX-70 红外光谱仪,Brukeṟ 400 核磁共振仪 ( 德国 Bruker 公司 ) -DG( 自制 ); 葡萄糖 ( 中国药品生物制品检定所 ); 鼠李糖 (99% ), 阿拉伯糖 (98% ), 对氨基苯甲酸乙 酯 (99% ), 氰基硼氢化钠 (95% )( 购自 Aladdin 公司 ); 三氟乙酸 甲醇 乙腈 ( 色谱纯,Tedia 公司 ); 冰醋酸 ( 分析纯, 西陇化工股份有限公司 ); 超纯水 ( 电阻率 18. MΩ cm, 自制 ) 收稿 ; 接受本文系海洋公益性行业科研专项经费基金 (No ), 福建省科技重大专项经费基金 (No.010NZ0001-) 和厦门市海洋与渔业局科技计划项目经费基金 ( 厦海渔合 [009]9 号 ) 资助项目 * bhhong004@ sina.com

2 分析化学 第 40 卷. 色谱及质谱条件色谱条件 :Hypersil ODS (50 mm 4.6 mm,5 mm); 柱温 :5 ; 进样体积 :10 ml; 流动相 :V( 乙腈 ) V(0.0% TFA)=0 80; 流速 :1.0 ml/min; 检测波长 :307 nm 质谱条件 : 电喷雾离子源 (ESI); 电离电压 ( 毛细管电压 )3.5 kv; 一级锥孔电压 35 V; 二级锥孔电压 3.0 V; 六级杆透镜电压 0.1 V; 源温度 (Source temperature)10 ; 脱溶剂温度 350 ; 脱溶剂氮气流速 500 L/h; 锥孔氮气流速 50 L/h; 高 低质量数分辨率均为 15; 质谱扫描范围 m/z 100~400.3 样品处理取 -DG 样品 5 mg, 精确称定, 依次加入 1.0 ml 0.15 mol/l ABEE- 甲醇溶液 1.0 ml 0.08 mol/l NaBH 3 CN- 甲醇溶液和 50 ml 冰醋酸, 于 85 水浴中反应 1.5 h, 取出放冷至室温, 用超纯水定容至 5 ml, 溶液经 0.45 mm 滤膜过滤后直接进样, 进样量 10 ml 3 结果与讨论 3.1 -DG 的结构确证自制的 -DG 经紫外扫描发现, 在 195 nm 处有很弱的紫外吸收 ; 红外光谱 (KBr 压片法 ):341, 3353,358 (υ OH ),95(υ CH ),1461,1411,1366(δ CH ),1119,108,1009(υ C O ); 核磁共振 (400 MHz, DMSO) 氢谱 :6.51 (1H,d,CHO),4.78 (H,m,OH),4.61 (1H,m,OH),4.46 (1H,m,OH),3.66~3.4 (H, m,ch (OH)),3.33 (1H, m, CH),3.01 (1H,m,CH(OH)),.91 (1H,m,CH(OH)),1.89~ 1.5 (H,m, CH ); 碳谱 : 13 C1(93.38), 13 C(76.78), 13 C3(71.60), 13 C4(70.79), 13 C5(61.6), 13 C6(41.5); 高分辨质谱显示的准分子离子峰 m/z [M+Na] + 与 -DG 结构分子量相符 以上数据可以确证 -DG 的结构 3. 衍生化条件的优化衍生化时间 温度及衍生化试剂与单糖的摩尔比均会影响衍生化反应产率 ( 图 1) 本实验确定衍生化反应的最佳条件为反应时间 :1.5 h; 反应温度 :85 ;ABEE 与 -DG/Glu 的摩尔比为 5 1 图 1 反应时间 (a) 反应温度 (b) 和衍生化试剂 (ABEE) 与 -DG/Glu 的摩尔比例 (c) 对衍生化反应产率的影响 Fig.1 Effects of reaction time (a), reaction temperature (b)and molar ratio of p-aminobenzoic ethylester (ABEE)to -deoxyglucose/glucose (-DG/Glu)(c)on derivative reaction ( )-DG;( )Glu. 3.3 LC-MS 结果按.3 节的方法处理样品, 将 -DG 和 Glu 混合, 进行柱前衍生化反应, 反应产物在. 节的色谱及质谱条件下进行 LC-MS 分析, 得到的色谱与质谱图如图 3 所示 其中, 图 3B 中 a 及 b 分别为图 3A 峰 1 及峰 的全扫描质谱图 图 3Ḇ a 的基峰质荷比为 330, 与 Glu 衍生化产物的加氢分子离子峰 ([Glu+ABEE +H] + ) 的质荷比一致 ; 图 3Ḇ b 的基峰质荷比为 314, 与 -DG 衍生化产物的加氢分子离子峰 ([-DG+ABEE +H] + ) 的质荷比一致 此结果表明 :-DG 及 Glu 与衍生化试剂 ABEE 的反应是按照 ( 图 ) 所推断的 1:1 进行的,-DG 和 Glu 的衍生化产物与 H + 结合, 产生稳定的准分子离子峰 m/z 314 和 330 LC-MS 总离子流图 ( 图 3A) 同时显示, 衍生化试剂在单糖衍生产物之后出峰, 无需萃取除去, 不会干扰 -DG 及 Glu 的测定, 简化了衍生化步骤

3 第期尤小云等 : 柱前衍生 - 反相高效液相色谱法测定 - 去氧葡萄糖的含量 图 Fig. -DG 和 ABEE 衍生化的反应式 Reaction course of -DG withp-aminobenzoic ethyl ester 图 3 -DG 及 Glu 衍生物的 LC/MS 色谱图 (A) 及质谱图 (B) Fig.3 Chromatograms of LC/MS (A)and mass spectras(b)of -DG and Glu derivatives 1. Glu(m/z 330);. -DG(m/z 314);a. 峰 1 的质谱图 (Mass spectra of peak 1);b. 峰 的质谱图 (Mass spectra of peak ) 3.4 方法专属性 考察常见单糖对 -DG 测定结果的影响 将鼠李糖 葡萄糖及阿拉伯糖与 -DG 混合, 按最适的衍 生条件与 ABEE 衍生后, 在. 节的色谱条件下进行 HPLC 分析 -DG 的回收率为 % ;RSD 为 0.9% 4 种单糖衍生物的色谱图如图 4 所示, 表明在 其它单糖存在的情况下, 不会影响 -DG 的定性及定 量分析 3.5 线性关系 检出限及定量限 按.3 节配制浓度分别为 1, 10, 0, 40, 100, 00, 300, 400, 500, 600 和 700 mg/l 的样品溶液, 进样量均为 10 ml, 峰面积 (y) 对进样浓度 (x) 的线性回归方程为 y=54533x+6685, 相关系数 r=0.9999, 线性范围 图 4 4 种单糖衍生物的色谱图 为 1 ~ 700 mg/l 逐级稀释样品溶液, 当信噪比 Fig.4 Chromatograms of four derivatized monosaccharides (S/N) 为 3 时, 确定其检出限为 100 mg/l; 信噪比 (S/N) 为 10 时, 确定其定量限为 450 mg/l 1. Glu 衍生物 (Glucose derivative);. 阿拉伯糖衍生物 (Arabinose 3.6 日内及日间精密度 重复性和稳定性按.3 节配制的低 中 高浓度的样品溶液, 测定 derivative); 3. 鼠李糖衍生物 (Rhamnose derivative); 4. -DG 衍生物 (-DG derivative); 5. 对氨基苯甲酸乙酯 其日内及日间精密度, 结果见表 1 3 种浓度的日内 (p-aminobenzoic ethyl ester)

4 分析化学 第 40 卷 和日间 RSD 均小于 0.7%, 日内和日间精密度良好 配制 3 个不同浓度的 -DG 溶液, 按.3 节进行 衍生化反应 (n= 3), 测得平均含量为 10.0%,RSD 为 0.4%, 表明方法的重复性良好 样品溶液于 5 放置, 分别在 0, 1,, 4, 6, 8, 10, 1 和 4 h 进样, 考 察衍生产物稳定性,9 个时间段峰面积的 RSD 为 0.3%, 表明样品在 4 h 内稳定性良好 3.7 实际样品的检测结果 表 1 -DG 衍生物的日内及日间精密度 Table 1 Inteṟ day and intra-day precision of -DGderivative -DG 衍生物的浓度 Concentration of -DG derivative(mg/l) 日内 Inteṟ day RSD(% ) 日间 Intra-day 对 -DG 样品进行 3 种不同浓度水平的加标回收实验 (n=3), 结果见表 平均回收率为 101.7% ; RSD 为 0.7%, 说明本方法的检测结果准确度良好 实际样品的检测结果见表 3 表 -DG 样品的加标回收率 Table Average recovery of -DG sample 加入量 Added(mg) 测得量 Obtained (mg,n=3) 回收率 Recovery (%,n=3) RSD (% ) 表 3 样品分析及结果 Table 3 Analytical results of samples 组分 Component (% ) 样品 Samples S1 S S3 S4 S5 -DG Glu 结果表明, 本方法可同时测定 - 去氧葡萄糖和葡萄糖含量, 敏度高 线性范围宽以及稳定性好 References 1 HyunT K,EunSH.LifeSci.,006,78 :139~1399 GeorgeEP.MedicalHypotheses,008,70:776~78 3 RobertA G,RobertJG.Int.J.Biochem.CelBiol.,007,39:1358~ ZHAO Hua-Dong,SUNJi-Lin.JMEP,004,11(4):~4 赵华东, 孙吉林. 现代电生理学杂志,004,11(4):~4 5 HONG Bi-Hong,YIRui-Zao,FANG Hua,DAILi-Zong.Journalof Xiamen University (NaturalScience), 010,49(6):886~888 洪碧红, 易瑞灶, 方华, 戴李宗. 厦门大学学报 ( 自然科学版 ),010,49(6):886~888 6 ShoichiY,TakeomiM,KazukoK,TakashiY,MasuguK.Biosci.Biotech.Biochem.,1997,61(11):1944~ DomingoBG,DaysiM T,Juan M A.Anal.Chim.Acta,001,436:173~180 8 WeiT W,NormanCL,JrBradA,CharlesCS.Anal.Biochem.,1984,141():366~381 9 MasashiH,YukaK,HideoD,TatsuyaM,TakeomiM,TaichiU,SachikoNT,MasuguK,JunH,MasanoriM, MinaY,YokoS,KimikoH,MasayaN,HirokazuK.Phytochemistry,010,71:648~657 Detectionof-DeoxyglucosebyPre-columnDerivationReversed PhaseHighPerformanceLiquidChromatography YOU Xiao-Yun 1,,HONGBi-Hong *,4,XIE QuaṉLing,YIRui-Zao 1,,XU Rui-An 1,3 1 (Instituteof MolecularMedicine,HuaqiaoUniversity,Quanzhou3601,China) (TheThirdInstituteofOceanographyStateOceanicAdministration,Xiamen361005,China) 3 (XiamenKeyLabof Marine& GeneEngineeringDrugs& EngineeringResearchCenterof MolecularMedicine, MinistryofEducation,Xiamen36101,China) 4 (Departmentof MaterialsScienceandTechnology,ColegeofChemistryandChemicalEngineering, XiamenUniversity,Xiamen361005,China)

5 第期尤小云等 : 柱前衍生 - 反相高效液相色谱法测定 - 去氧葡萄糖的含量 Abstract A methodwasdevelopedforthedeterminationof-deoxyglucose(-dg)byreversedphase highperformanceliquidchromatography(rp-hplc)afterpre-columnderivatedwithp-aminobenzoic ethylester(abee).theresultsshowedthattheoptimumderivationconditionswereasfolows:reactiontemperaturewas85,reactiontimewas1.5handmolarratioofderivativereagent(abee) tomonosaccharide(-dg/glu)was5 1.ThederivativewasanalyzedonaHypersilODS(50mm 4.6 mm,5 mm)columnwithacetonitrileto0.0% trifluoroaceticacid (TFA)( 80,V/V)asthe mobilephase,attheflowrateof1.0 ml/minandthedetectionwavelengthat307nm.thismethod hasagoodlinearityattheconcentrationfrom1 mg/lto700 mg/l (r=0.9999).thelimitofdetectionwas100 mg/l whilethequantitativelimitwas450 mg/l.theaveragerecoveryof-dg was 101.7% andtherelativestandarddeviation (RSD)was0.7%.Theinteṟdayandintraḏayprecision wasbothlessthan0.7%,thismethodisofhighsensitivity,precisionandrepetition,indicatingthat itissuitableforprecisequantitativedeterminationof-dg. Keywords -Deoxyglucose;Pre-columnderivatization;Reversedphasehighperformanceliquidchromatography;p-Aminobenzoicethylester (Received1July011;accepted3November011)

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