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1 第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!"#$## %&'& & 技术方法研究 携带 基因的重组水痘带状疱疹病毒的构建 张 科 王立新 于 魁 张 放 李 冀 刘爱华 李淑英 华北理工大学 河北省慢性疾病重点实验室 唐山市慢性病临床基础研究重点实验室 河北唐山 $ 唐山市丰润区市场监督管理局 唐山市丰润区食品监督管理所 河北唐山 $ 摘要 目的 利用 %&' 为基础的同源重组方法 将 '& 添加到水痘带状疱疹病毒 &" '&()*++,-, 开放读码框 *#&!#&. /01 构建携带 '& 与,-,/01 融合基因的重组水痘带状疱疹病毒 方法 0 扩增带有,-,/01 左右同源臂的 %&' 及 '& 基因片段 将所得片段纯化后电转到,-, 细菌人工染色体 (,-, 23 感受态细胞 通过同源重组 %&' 筛选及脱 %&' 筛选 获得带有 '& 的,-,/01 细菌人工染色体 (,-, /01('&(23 克隆 将所得克隆进行质粒提取后 转染到 304( 细胞 观察带有 '& 基因的,-, 对 304( 细胞的影响 结果 获得了,-,/01 带有 '& 的细菌人工染色体克隆 (,-,/01('&(23 将该质粒转染 3304( 细胞! 后 转染 (,-, 23 及 (,-, /01( '&(23 的细胞可见带有绿色荧光的病毒斑块 +#'* 检测结果显示 '& 时 /01 的表达水平有效增强 结论 获得了携带 '& 基因的重组,-, 表明通过 %&' 为基础的同源重组 可方便 快捷并准确地对感兴趣的病毒基因进行操作 关键词 水痘带状疱疹病毒,-, 同源重组 细菌人工染色体 '& 基因中图分类号 0 文献标志码 3 $!!""#$%"&"%'"" -536% 36%7(# %1&# 7:; 7:9 3(& 7:(# "**'*2&+"!"&'"#"+6*#&9#+*"#" &#!"#*'* 5 7&*&***#"+&++&#+&# 7&*&**"'#"&'&#! 2&+"0+&"*#*#"+&++&#+&#$&#+&#1## +"&+*#&#!3!.#+&*#2&&#+&# 1##+"1**!+*#&#! &#&. #&#+&#$#& ####%%#(( )""" %% *" +,-./0"#&./"()* %% +,-)*" 1,&" )*"""#*#%% ### $0 %% & # %% +,- ) ( $0%% +,-0(0) " # "# " #./ "*#"./&# *")(#""#",10#&#%% +,-0(,10#) "&#%% +,-)( $0%% +,-0(0)"& *#)##)""$0%% "$0%% +,-0 (0 )#",10 #& )" +,- (* )# #")(& #%%#()")#./0"###"##*& () * #0 #### ( 收稿日期 ($( 修回日期 (( 基金项目 河北省留学人员科技活动资助项目 6*8$ *! "#"&#!"#*'*"&'0+&"*"+*"*'&+#5 *#" 6*8$ 通信作者 李淑英 教授 4(.&''++#&"*. 优先出版 #+"##".+!&'$0$.'($(!"#

2 期 张 科 王立新 于 魁 等 携带 '& 基因的重组水痘带状疱疹病毒的构建 细菌人工染色体 &"&'&"&'"*.*( +*. 23 的发展是病毒突变领域的一项重大突 ( 破 为克隆大段 63 病毒提供了极大方便 以 %&' 为基础的选择与反选构建重组病毒 为病毒基 因突变提供了便利方法 '& 标记含 个氨基酸残基 具有高度免疫灵敏性 通常位于融合蛋白的外表面 便于目的蛋白的检测和纯化 含有 '& 融 ( 合蛋白的检测灵敏度高于其他系统 本研究利用 %&' 为基础的同源重组方法 将 '& 添加到水痘带状疱疹病毒 &" '&()*++,-, 开放读码框 *#&!#&. /01 构建携带 '& 基因的重组,-, + 材料与方法 ++ 材料 菌株及其电转化感受态细胞 质粒 %&'%&' 质粒 '&'& 野生型 '!,-, 23 63,-, 含有,-, 全部基因组 荧光标记及氯霉素抗性 均为美国罗格斯大学新泽西医学院朱桦教授惠赠 +,- 制备含有./. * 的 *+0- 细胞 将,-, 2363 电转到 7 电感受态细胞 转移到.772 培养液 孵育 离心 用 液 洗涤沉淀 次 涂布于 72 琼脂培养基 含有..7 的氯霉素 培养! 后有克隆形成 挑选 个克隆 提取质粒 63 用,-, /01 引物检测 " 1*&!<(%3%3( 3%%%(<"0 + <(%%( %%3%%33%(< 并将其命名为 (,-, 23 制备 (,-, 23 电感受态细胞 保存备用 +,1 扩增带有./. 左右同源臂的 0 扩增 %&' 片段 反应体系 70..*'7 '.*'7! 聚合酶 引物.*'71*&!<(%3( 3%%%%%3%%3333%( 333%%%333%3%333%( %%333333%%3(< 0 + <(%3%%%3%3%333( 333%%%333%%3%3( %%(<# 质粒 %&'630 循环反应如下.# 然后 个循环 + +.# 延伸.# 保温 0 产物用 7 琼脂糖凝胶电泳检测 切胶纯化 +, 基因插入./. 将已纯化带有,-(,/01 左右同源臂的 %&' 电转到 (,-, 23 感受态细胞 然后转移到含有.772 培养液 在 摇床孵育 离心 用 液洗涤沉淀 次 取沉淀涂布于 $ 配制的 %&' 培养板 培养! 后有克隆形成 挑选 个克隆 提取质粒 630 所用引物 "1*&!<(%3%( 33%%%(<" 0 + <( %%%%3%%33%(< 产物 检测 %&' 将其命名为 (,-,/01(%&'( 23 制备其感受态细胞 = 储存备用 +, 代替 基因 首先用带有,-(,/01 左右同源臂的 '& 引物 1*&!<( %33%%%%%3%%3333%( 333%%%333%3%333%( 3%%33333%33%3(<0 + <( %3%%%3%3%3333( 33%%%333%%%3%( 3%(< 产物大小为 $ 质粒 '& 模板 0 扩增 '& 产物经 7 琼脂糖凝胶电泳后 切胶 回收纯化 取约 # 已纯化的,-,/01('&0 产物 电转到 (,-,/01(%&'(23 感受态细胞转移至.772 培养液 振摇 离心 用 液洗涤沉淀 次 将沉淀混悬于.7 培养液中 再分别进行 倍及 倍稀释后涂布于 $ 配制脱 %&' 培养板 培养! 有克隆形成 挑选 个克隆 提取质粒 630 所用引物 " 1*&!<(%3%33%%( %(<" 0 + <(%%%%3%%( 33%(< 产物 将其正确克隆命名为 (,-,/01('&(23 + 转染 304( 细胞接种于 $ 孔反应板 置于.77/ 温箱中培养 待其汇合度生长为 $> 时 分别用 (,-, 23 和 (,-(,/01('&(23 质粒转染 分别取 (,-, 23 和 (,-,/01('&(23 质粒置于 个.7 4 管中 做好标记 用无血清的 4 稀释至 7 取 7 转染试剂 用无血清的 4 稀释至 7 平均分装到上述 个 4 管中 混合均匀 室温放置.# 将上述 (,-, 23 的混合物添加到 $ 孔板 分别标记 $ 的第 孔 第 孔添加 (,-, /01('&(23 混合物 第 $ 孔作为对照 后更换细胞培养液 然后每! 换液 显微镜下观察细胞生长状况 待细胞长满 $ 孔板后 转移到 ".!"#

3 $ 西安交通大学学报 医学版 第 卷 培养皿培养 继续观察 +, 转染细胞中 的表达 待 ". 培养皿细胞长满后 收集转染与未转染组细胞 分别提取细胞 063 及蛋白 用逆转录 0 和 +#'* 检测 '& 的表达状况 - 结 果 -,+1 扩增检测 *+0-2./. * 将所选克隆提取质粒 63 经 0 扩增后 得到产物大小为 $ 图 与预期结果相一致 说明所选克隆是正确的 将其命名为 (,-, 23 图 +./. * 电转到 *+0- 所选克隆进行 1 扩增后的电泳结果 的病毒斑块! 带有绿色荧光的病毒越来越多 图 将重组病毒命名为,-,/01('& 图 电转至 *+0-2./.22 后所选克隆及转染细胞中./. * 与./.22 的 1 扩增产物的电泳结果 1 '"**+++'+*0*!"+*( "&*#*'&*. +'"!"'*#+* '"**&! * (,-,/01(%&'(23 &#! "&*# *,-, 23&#!,-,/01('&(23*.,-, 23 &#!,-,/01('&(23&#+"!304(" '+ '+63'&!!,-, 23 转染 304( 细胞,-,/01('&(23 转染 304( 细胞 '& 电转至 (,-,/01(%&'(23 感受态细胞后 阴性对照 1 '"**+++'+*.'!*( "&*#*,-,23"'*#!* '+63'&!!,-, 23 克隆到 后 以所挑选的 个克隆的质粒为模板 0 扩增 /01 产物的电泳结果 阴性对照 -,- 插入./.%&' 培养板筛选! 后 将所选克隆提取质粒 63 电泳检测到约 的产物 图 所得片段大小与预期的结果相一致 表明 %&' 已克隆至,-,/01 将其命名为 (,-,/01(%&'(23 图 - 电转到 *+0-2./. * 所选克隆进行 1 扩增后的电泳结果 1 '"**+++'+*.'"&*#* "&*#*%&' '"**&!*(,-, 23 '+63'&!! 以 %&' 电转到 (,-, 23 后 所选 个克隆的质粒为模板 0 扩增产物的电泳结果 阴性对照 -, 替代 基因 从脱 %&' 平板所选择的 个克隆 检测到大约 的产物 图 所得片段大小与预期的结果相一致 表明 '& 已克隆至,-,/01 将其命名为 (,-,/01( '&(23 - 转染结果 分别将 (,-, 23 和 (,-,/01('&(23 转染 304( 细胞 荧光显微镜下观察显示! 后可见带有绿色荧光 图 荧光显微镜观察 *+0-2./. * 和 *+0-2./2.22 转染 1(2+3 细胞的生长状况 1%*#+&(,-, 23&#!(,-,/01('&(23&#+"!*304( 3(,-, (23 转染至 304( 细胞中,-, 增殖所发出的绿色荧光嗜斑 2(,-,/01('&(23 转染至 304( 细胞中,-,/01('& 增殖所发出的绿色荧光嗜斑 -,./.2 的表达情况 将转染细胞培养大约! 收集细胞 分别提取转染和未转染细胞 063 和蛋白 逆转录和 +#'* 检测 '& 表达状况 逆转录 0 产物约 和 分别为 (,-, (23 和 (,-,/01('&(2363 转染结果 图 +#'* 用抗 /01 鼠单克隆抗体检测 (,-, (23 和 (,-,/01( '&(23 转染细胞 得到大约 和 蛋白 图 3'& 表达系统是 个氨基酸组成的亲水性肽 '& 肽位于融合蛋白的表面 '& 系统是通过融合 个串联 '& 表位 个氨基酸 对原始系统的改进 当与抗 '& 抗体结合时 个抗体结合 个 '& 表位得到约 条带 个抗体结合 个 '& 表位得到约 条带 个抗体结合 个 '& 表位得到约 条带 因此 用抗 '& 鼠单克隆抗体检测 (,-, (23 和 (,-,/01('&( 23 转染的细胞得到大约 蛋白 图 2!"#

4 期 张 科 王立新 于 魁 等 携带 '& 基因的重组水痘带状疱疹病毒的构建 对进行同源重组 另外 改良的温度敏感的 噬菌体要求的同源重组发生在同源序列相对较窄的一个区域内 因为 23 突变体的建立通常是使用 0 扩增 图 *""$ 检测./. * 和./. 2 感染 1(2+3 细胞中 及 的表达状况 1 "*# /01 &#!'&*.,-, &#!,-, /01('&#"!304(" '+ +#'* 3 用抗 /01 抗体检测,-, 感染 304( 细胞中 /01 表达状况?( 用抗 /01 抗体检测,-,(/01('& 感染 304( 细胞中 /01 表达状况 2 用抗 '& 抗体检测,-, 感染 304( 细胞中 '& 表达状况?( 用抗 '& 抗体检测,-,(/01('& 感染 304( 细胞中 '& 表达状况 讨 论实验诱变方法的进步为蛋白质结构 功能 发病机制 生物工程 疫苗的开发等提供了极大的方 ( 便 传统的实验突变方法包括 插入突变 位点定向诱变及转座子突变等 这些传统的突变方法涉及到分子克隆所依赖的载体准备 待插入的 63 片段及连接等过程 用这些传统方法进行突变的程序不仅浪费了大量的时间 而且消耗了大量的体力劳动 细菌人工染色体 &"&'&"&'"*.*( +*. 23 克隆技术在病毒突变方面是一项重大突破 这种技术克服了传统突变方法的缺点 病毒 23 克隆的病毒可在细菌细胞内保持稳定及传播 可容易地进行病毒基因组的操作 任何要求的病毒基因突变都可容易地利用病毒 23 克隆而取得 这种突变还可以在获得重组病毒之前加以验证 这种新方法对于重组病毒的结构及功能的研究提供了极大 ( 的方便 同源重组是基因重组的一种类型 是 个相同序列的 63 核苷酸之间进行交换 野生型大肠杆菌对诱导外源 63 的同源重组是无效的 因为线性 63 通常被 0"2 核酸外切酶降解 菌株包含 个温度敏感的 噬菌体编码的 个暂时抑制 0"2&. 的基因 以及 个基因 * 和 ( & 在同源重组过程中进行双链的损伤修复 噬菌体对温度敏感 由于 个温度敏感 ": 抑制子的表达 当细胞培养温度从 增加到 时 线性 63 的摄取和重组可以在几分钟内完成 这样 当细菌细胞在 正常生长时 可以有几千个碱基 的基因序列 其两侧应为约 个碱基对与病毒 序列同源 为进一步探讨 %&' 为基础的基因重组突变方法 本实验将 '& 作为融合表达目标蛋白添加到,-, /01 构建重组病毒的方法 结果显示 使用 '& 作为标签 与靶蛋白 /01 融合表达具有以下优点 首先 '& 通常不与靶蛋白 /01 相互作用 也不影响 /01 的功能或性质 因此 可以通过融合蛋白探讨靶蛋白 /01 的功能 第二 '& 融合靶蛋白可以非变性纯化 有效纯化活性融合蛋白 第三 '& 标签蛋白可以被抗 '& 抗体识别 并且容易通过 +# 印迹方法检测或鉴定 将 '& 与 /01 融合表达 可以有效地增强 /01 的表达水平 为进一步探讨 /01 功能研究奠定基础 同时利用细菌人工人染色体作为载体 通过 %&' 选择 反向选择及同源重组方法 构建了携带 '& 基因的重组,-, 表明通过 %&' 为基础的同源重组 可方便 快捷并准确地对感兴趣的病毒基因进行操作 参考文献,' '. 23 3&3*1 *"& " # & 3'. 3'. 43 3& #*# "%% +,-" " ) "*"#%% &%!"0 54!,6'%5$+&0 ####0"#0 "*"##"# '&.#$0$& '. 2$65%,3 3&1##0 )*#### 1,0"0"0 #"!'6/.&**"#0 0*#*"*##&,786#$ &#*###0 ## 61 #( '0"*&!! $& $,66%56,!16+/ 5&,)## (*!,(**#0" 5*&# $ $0$& $!+!$5',1&$#0""0 # (&!!#& 3156'1.,,$3'&0!"#

5 西安交通大学学报 医学版 第 卷 *%#"-5.050%1$ #(4., #&.$$$0$&!65+!56!.!!5--%&310+0 *"0* #"0"#"&*$ +.,5/ $'. 43$166!&6"#0 0*###16/ *"*0 * &#,0 & 3%56$!3'.3+$3$&1#0!+56'$/6$%3!6$3'.!&-# #0#"-, ")0 ## "## & $# 6./6!$+55.3' &* ### #*#0 "./0", "*"&%!"00$& 6$$/$--,$$3,'$/&#0 *./0"*0 #"&!"! 4 556$ 3!5 &##0 ###"0 ####& )# &# *,0 1#'#"$#$ $ 编辑 国 荣 上接第 页 ## "7"#* &#0.'',6$+,!'6!11,+'+ 1&3, "## "7## 1,6!!,6'$%+-& ##*"""&'# )/$"#"##* 6 ")**#* &1##0 4+$3634$36'$/6/&3, 1 "7#* "*#*# 余海云 李文萍 郜红艺 等 & 新辅助化疗疗效与乳腺癌 /$ *)* ##&$+#$ 1 表达的关系 & 中华乳腺病杂志 电子版 0 &,$!4 + 5$!'4$& 巩福玉 王本忠 &/$ 在乳腺癌新辅助化疗中的疗效评价和预 **/$" &)# 测价值 & 中华内分泌外科杂志 ## 0" &1# $ 刘新杰 罗民 麦惠清 等 & 乳腺癌 /0$ * 0, 及 #1$0$& 1, 的表达预测新辅助化疗效果的研究 & 中国普通外科杂志 '/ /+/'. 4!$36 '& $ *)(*-+"." 编辑 张 敏 上接第 页.6,,%65!13'$5/,,$& 唐成芳 朱勇 阮建平 等 & 马尾松树皮提取物预处理对根面牙本 "#*"*"**#& 质耐酸蚀和脱矿能力的影响 & 山西医科大学学报 $, 0$& 56,-'.!6+4&#*0 李雪英 林敏 从丛 等 &'"4. 激光作用下牙本质脱敏机制 #"*#" #08 " 0 的研究 & 西安交通大学学报 医学版 ##**"" "&!$# 孔亚阁 宋永青 胥光辉 等 &9 戊二醛液治疗牙本质过敏症的!!" 临床应用 & 实用诊断与治疗杂志 $,'0,$$+/1$354 3./& 熊筱艳 吴方丽 郭芮 等 & 极固宁!. 与 '- 治疗牙本 """)**## 质过敏症的临床疗效观察 & 中华老年口腔医学杂志 #8&"!,**$ $ 6' '..3&"""0 '. --'.!56,,&*" "*#0#"" ## * (#"""!0 ".""" *0 #*#" *#&# + &0 $0$& $ 朱虹倩 喻洁 刘兴容 等 & 三种脱敏剂治疗牙本质过敏的临床观 编辑 卓选鹏 察 & 川北医学院学报!"#

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