RM5 基因表达载体构建稳定转染 549 细胞系的建立及功能的初步研究肖锏, 等 995 STRCT Objective: To establish a stable 549 cell line transfected by RN binding motif 5 (RM5) expression

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994 中南大学学报 ( 医学版 ) J Cent South Univ (Med Sci) 2014, 39(10) http://www.csumed.org DOI:10.11817/j.issn.1672-7347.2014.10.002 www.csumed.org/xbwk/fileup/pdf/201410994.

1 994 中南大学学报 ( 医学版 ) J Cent South Univ (Med Sci) 2014, 39(10) DOI: /j.issn RM5 基因表达载体构建稳定转染 549 细胞系的建立及功能的初步研究肖锏 1, 李念 1, 邢晓为 2 1, 何碧秀 ( 中南大学 1. 湘雅医院老年病科, 长沙 ;2. 湘雅三医院医学科研中心, 长沙 ) [ 摘要 ] 目的 : 通过构建表达载体建立稳定转染 RN 结合基序 5(RN binding motif 5,RM5) 的 549 细胞系, 初步研究 RM5 基因过表达对 549 细胞增殖以及天冬 - 谷 - 丙 - 组氨酸盒多肽 15[DEH box polypeptide 15,DHX15] 表达的影响方法 : 应用分段克隆法构建 pcdn3.1(+)/rm5 真核表达载体 ; 将测序验证后的重组质粒 pcdn3.1(+)/ RM5 转染肺腺癌 549 细胞并以 G418 进行筛选, 采用 Western 印迹鉴定 RM5 基因过表达阳性细胞, 流式细胞仪分别检测经 pcdn3.1(+)/rm5 稳定转染的 549 细胞 [pcdn3.1(+)/rm5-549] 及 pcdn3.1(+) 空白质粒转染的 549 细胞 [pcdn3.1(+)-549] 的周期分布 ; 运用 RT-PCR 技术分别检测 pcdn3.1(+)/rm5-549 和 pcdn3.1(+)-549 细胞中剪接相关因子 DHX15 的表达情况结果 : 成功构建出 pcdn3.1(+)/rm5 真核表达载体, 筛选出 RM5 基因稳定转染过表达阳性细胞株 ;pcdn3.1(+)/rm5-549 较 pcdn3.1(+)-549 细胞处于 G 1 期细胞比例增大 S 期细胞比例减小 ( 均 P<0.01);cDN3.1(+)/RM5-549 较 pcdn3.1(+)-549 细胞的 DHX15 表达上调 (P<0.01) 结论: 成功构建重组质粒 pcdn3.1(+)/rm5, 并建立了 RM5 稳定转染的 549 细胞系 ; 初步证实 RM5 基因过表达可抑制肺腺癌 549 细胞的细胞周期, 并使 DHX15 表达上调 [ 关键词 ] RN 结合基序 5;549 细胞系 ; 天冬 - 谷 - 丙 - 组氨酸盒多肽 15; 基因克隆 ; 质粒构建 ; 肿瘤抑制 ; 细胞周期 Construction of RM5 vector, establishment of stably transfected 549 cell line and preliminary research on the function of RM5 gene XIO Jian 1, LI Nian 1, XING Xiaowei 2, HE ixiu 1 (1. Department of Geriatrics, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha ; 2. Department of Medical Research Center, Third Xiangya Hospital, Central South University, Changsha , China) 收稿日期 (Date of reception): 作者简介 (iography): 肖锏, 硕士, 医师, 主要从事肺癌防治方面的研究通信作者 (Corresponding author): 何碧秀, hebixiu000@tom.com 基金项目 (Foundation item): 湖南省科技计划项目 (06SK3029-7) This work was supported by the Science and Technology Planned Project of Hunan Province, P. R. China (06SK3029-7).

2 RM5 基因表达载体构建稳定转染 549 细胞系的建立及功能的初步研究肖锏, 等 995 STRCT Objective: To establish a stable 549 cell line transfected by RN binding motif 5 (RM5) expression vector, and to investigate the effect of RM5 gene on proliferation of 549 cell line and the expression of DEH box polypeptide 15 (DHX15). Methods: The eukaryotic expression vector pcdn3.1 (+)/RM5 was constructed by a twostep PCR technique. Then, the recombinant plasmid pcdn3.1 (+)/RM5 was verified by DN sequencing and transfected into the lung adenocarcinoma cell 549. The positive cells with overexpression of RM5 gene were identified by Western blotting. Flow cytometry was used to analyze the cell cycles of the positive 549 cells [pcdn3.1 (+)/RM5-549] and the negative controls [pcdn3.1 (+)- 549]. Finally, RT-PCR was used to detect the expression of DHX15, a splicing-related factor, in the positively transfected 549 cells and the negative controls. Results: pcdn3.1 (+)/RM5 eukaryotic expression vector has been constructed successfully, and the 549 cell line that stably transfected with RM5 gene has been established. Compared with negative control cells, the percentage of G1 phase cells in the positive cells was increased, while the percentage of S phase was decreased (both P<0.01), and the expression of DHX15 is upregulated (P<0.01). Conclusion: RM5 gene can inhibit the cell cycle and upregulate the expression of DHX15 in 549 cells. KEY WORDS RN binding motif 5; 549 cell line; DEH box polypeptide 15; gene cloning; plasmid construction; tumor suppression; cell cycle 肺癌是威胁着人类健康和生命的主要恶性肿瘤之一肿瘤抑制基因功能的缺失是肺癌的发病机制之一 3 号染色体短臂 2 区 1 带 3 亚带 (3p21.3) 缺失是肺癌最常见的基因改变, 已证实在 95% 的小细胞肺癌和 50%~80% 的非小细胞肺 [ 1 癌的细胞中存在该区域基因的杂合性缺失 ] RN 结合基序 5(RN binding motif 5,RM5) 基 [2] 因 (Genank accession No.F091263) 由 Timmer 等 [3] 分离自前细胞 cdn 文库不同肺癌细胞系的研究发现 : 肺癌常见缺失区 3p21.3 长 370 kb, 含有 19 个基 [4-6] 因, 其中就包括 RM5 另有研究表明 RM5 基因在 [7-8] 肺癌等肿瘤组织中较正常组织表达下降体外实验证明 :RM5 基因的表达具有抑制癌细胞增殖及促进凋亡作用, 表明 RM5 是一种潜在的肿瘤抑制基因天冬 - 谷 - 丙 - 组氨酸盒多肽 15[DEH(sp-Glu- la-his)box polypeptide 15,DHX15] 是一种在剪接体中发现的 DExD/H-box 蛋白 [9] DExD/H-box 蛋白在 pre-mrn 剪接中可调控 RN-RN 之间和 RN- 蛋白之间的相互作用, 并且 DExD/H-box RN 解旋酶也在 pre-mrn 剪接过程的多个步骤中发挥着重要作用 [10] [11-12] 同时,RM5 也参与剪接调控, 有研究证实 RM5 存在于前剪接体复合物中, 并且 RM5 参与 3' 端剪接位点识别和调控凋亡相关基因的选择性剪接, 可抑制前剪接体复合物向成熟剪接体转变 [13] 最近有研究指出 RM5 在体外可直接与 DHX15 相互作用并促进 DHX15 的解旋酶活性尽管目前针对 RM5 基因肿瘤抑制作用的研究已较为深入, 但其具体分子机制仍不清楚, 有待进一步研究本研究拟构建 RM5 基因真核表达载体, 转染肺腺癌 549 细胞以建立稳定转染 RM5 基因的 549 细胞系, 观察 RM5 基因过表达对肺腺癌细胞 549 周期的影响同时, 由于 RM5 与 DHX15 均参与 pre-mrn 的剪接调控, 且两者可相互作用, 推测 RM5 基因过表达可能相应地影响 DHX15 的表达水平本研究旨在进一步探讨 RM5 基因的肿瘤抑制作用机制, 为肺癌的基因治疗提供新的理论依据 1 材料与方法 1.1 材料 549 细胞购自中南大学湘雅中心实验室细胞库 ;RPMI-1640 培养基胎牛血清购自美国 Gibco 公司 ; 感受态细菌 JM109 和人睾丸组织 cdn 由湘雅三医院医学实验中心留存 ;pucm-t 载体购自上海生工生物工程公司 ;pcdn3.1(+) 载体 Lipofectamine TM 2000 购自美国 Invitrogen 公司 ;RN 提取试剂盒购自德国 Qiagen 公司 ; 连接胶回收试剂盒购自大连宝生物工程公司 ; 质粒提取试剂

3 996 中南大学学报 ( 医学版 ), 2014, 39(10) 盒购自美国 xgen 公司 ;Easy- 高保真酶购自美国 gilent 公司 ; 限制性内切酶第一链 cdn 合成试剂盒购自加拿大 Fermentas 公司 ; 碘化丙啶购自美国 D 公司 ; 抗 RM5 抗体 ( 鼠抗人 ) 购自英国 bcam 公司 ; 兔抗鼠二抗购自中国艾杰生物公司 1.2 方法引物设计参考 Genank 中 RM5 基因序列 (F091263), 将其从中间单酶切位点处 (Kpn I: GGTCC) 分成两个片段分别进行扩增 PCR 扩增引物 :1) 上游引物序列 1(F1) 为 5'-CGGCTTCTGGG- TTCGCGG-3', 下游引物序列 1(R1) 为 5'-CGGTTCGGTCCGGCTCCC G-3'; 2) 上游引物序列 2(F2) 为 5'-CGGGTCC TTG- CGTCCTG-3', 下游引物序列 2(R2) 为 5'-CCCT- CGGCTCCTCTCGTGCCGGG-3'( 划横线处分别为 Hind III, Kpn I 和 Xho I 酶切位点, 并在 5' 端加入 2 个保护碱基, 分别为 CG, CG, CC) DHX15 基因 PCR 扩增引物 :DHX15-F 为 5'-GTTCTGGGGTTGTGC-3';DHX15-R 为 5'-GCTTTTTCTCTTCGGCT TC-3' PCR 扩增目的基因以人睾丸 cdn( 由中南大学湘雅三医院医学实验中心邢晓为博士提供 ) 为模板对目的片段分别进行 PCR 扩增 10 μl PCR 反应体系如下 : 焦磷酸二乙酯处理过的双蒸水 6.8 μl,dntp 1.0 μl,pcr 高保真反应缓冲液 1.0 μl,easy- 高保真聚合酶 0.2 μl, 上下游引物各 0.1 μl,cdn 模板 0.8 μl RM5N( 以 F1 和 R1 为引物扩增的 RM5 N 端, 长度为 bp)/ RM5C( 以 F2 和 R2 为引物扩增的 RM5 C 端, 长度为 bp)pcr 扩增条件 :94 预变性 3 min,94 变性 30 s,62 退火 40 s,72 延伸 90 s(rm5 N)/60 s(rm5 C), 完成 35 个循环后再延伸 5 min 扩增完成后, 分别取 3.5 μl PCR 扩增产物进行琼脂糖 (1.5%) 凝胶电泳鉴定 pucm-t-rm5n 与 pucm-t-rm5c 重组质粒的构建与鉴定参考 T 克隆技术 [14-15], 根据连接试剂盒产品说明步骤将鉴定后的 RM5N 和 RM5C 分别克隆至 pucm-t 载体中, 转化大肠杆菌 JM109, 挑选单克隆, 接种至氨苄青霉素选择性 L 液体培养基中培养, 以菌液作为模板按照中条件进行 PCR 扩增并鉴定出阳性克隆, 测序验证 pcdn3.1(+)/rm5 重组质粒的构建与鉴定将阳性克隆小量扩增后按照质粒提取试剂盒标准步骤抽提 pucm-t-rm5n 和 pucm-t-rm5c 质粒, 同时与 pcdn3.1(+) 空白质粒分别进行双酶切, 限制性内切酶依次为 Hind III 与 Kpn I,Kpn I 与 Xho I,Hind III 与 Xho I, 胶回收目的基因片段和载体根据连接试剂盒说明将酶切后的 RM5N,RM5C 和 pcdn3.1(+) 进行连接, 转化感受态大肠杆菌 JM109, 挑取阳性克隆, 按所述条件进行 PCR 扩增, 只有 RM5N 和 RM5C 均能扩增出来的菌液才被认为是阳性菌液, 并进行 Hind III 和 Xho I 双酶切测序鉴定建立稳定转染 RM5 的肺腺癌 549 细胞系肺腺癌细胞 549 培养于含 10% 胎牛血清的 RPMI 培养基中, 放置在 37 CO 2 体积分数为 5% 的 CO 2 培养箱中培养细胞转染前 1 d 将培养瓶中细胞转种至 6 孔板, 当细胞融合到 80% 左右时, 按照脂质体 (Lipofectamine TM 2000) 标准操作流程将重组质粒 pcdn3.1(+)/rm5 和空白质粒 pcdn3.1(+) 分别转染肺腺癌细胞 549 转染 48 h 后, 用胰酶消化转染细胞, 转移至细胞培养瓶中继续培养, 更换为筛选培养基 (G418 浓度为 800 mg/l) 筛选 30~35 d 后, 获得 G418 抗性细胞克隆采用有限稀释法进行亚克隆, 用含 G418 的培养基进行培养, 观察克隆形成情况, 待克隆形成后挑单克隆进行扩大培养,Western 印迹检测阳性细胞克隆中 RM5 的表达, 最终获得单克隆阳性表达 RM5 的转染细胞系流式细胞仪检测 RM5 基因过表达对 549 细胞周期的影响将重组质粒 pcdn3.1(+)/rm5 稳定转染的 549 细胞 [pcdn3.1(+)/rm5-549] 和空白质粒 pcdn3.1(+) 稳定转染的 549 细胞 [pcdn3.1(+)-549] 进行常规培养, 经消化洗涤固定后予以碘化丙碇 (50 mg/l) 避光孵育 30 min 处理, 流式细胞仪进行 DN 检测, 以 Modifit 软件分析各时相细胞周期的比例 RT-PCR 检测 pcdn3.1(+)/rm5-549 与 pcdn 3.1(+)-549 细胞中 DHX15 基因的表达将 pcdn3.1(+)/rm5-549 和 pcdn3.1(+)-549 细胞持续传代, 分别提取其细胞总 RN, 合成第一链 cdn, 然后以此为模板进行 20 μl PCR 反应体系扩增 :94 预变性 3 min, 94 变性 30 s, 62 退火 40 s, 72 延伸 40 s, 完成 30 个循环后再延伸 5 min( 预实验表明 30 个循环 PCR 产物尚未达到平台期 ) 反应结束后, 取少量 PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析 1.3 统计学处理本研究的实验数据运用 SPSS18.0 统计软件进行统计学分析数据结果采用均数 ± 标准差 (x±s) 表示, 各项指标的两样本均数的比较采用独立样本的 t 检验 P<0.05 为差异有统计学意义

RM5 基因表达载体构建稳定转染 549 细胞系的建立及功能的初步研究肖锏, 等 997 2 结果 2.1 RM5N 与 RM5C PCR 扩增结果以人睾丸 cdn 为模板扩增 RM5N 和 RM5C,PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后, 发现 RM5N( 图 1) 和 RM5C( 图 1) 均有特异性扩增条带, 大小分别约为 1.3 和 1.

mplification result of RM5C; M: 100 bp DN ladder; 2: RM5C 2.

RM5C 双酶切结果 Figure 3 Double enzyme digestion results of RM5N and RM5C : Double enzyme digestion result of pucm-t-rm5n; M: 100 bp DN ladder; 1: pucm-t and RM5N; : Double enzyme digestion result of

2 重组质粒 pucm-t-rm5n 和 pucm-t-rm5c 阳性克隆的筛选与鉴定分别挑取 pucm-t-rm5n 和 pucm-t-rm5c 单克隆在含氨苄青霉素的液体 L 培养基中培养约 7 h 后, 以菌液为模板进行 PCR 扩增, 扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测结果发现 : 前者 1~5 号克隆为阳性 ( 图 2), 后者 1~7 号克隆均为阳性 ( 图 2)

4 RM5 基因表达载体构建稳定转染 549 细胞系的建立及功能的初步研究肖锏, 等结果 2.1 RM5N 与 RM5C PCR 扩增结果以人睾丸 cdn 为模板扩增 RM5N 和 RM5C,PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后, 发现 RM5N( 图 1) 和 RM5C( 图 1) 均有特异性扩增条带, 大小分别约为 1.3 和 1.1 kb, 与实验预期扩增片段大小相符合 M 1 M 2 RM5N RM5C 500 bp 500 bp 图 1 RM5N 与 RM5C PCR 扩增结果 Figure 1 mplification results of RM5N and RM5C PCR : mplification result of RM5N; M: 100 bp DN ladder; 1: RM5N; : mplification result of RM5C; M: 100 bp DN ladder; 2: RM5C 2.3 RM5N 与 RM5C 双酶切结果分别用 Hind III 和 Kpn I 与 Kpn I 和 Xho I 对 pucm- T-RM5N 和 pucm-t-rm5c 进行双酶切, 结果发现, 两者能够被双酶切, 片段大小与预期相符 ( 图 3) 将 RM5N 和 RM5C 片段进行胶回收 M 1 M 2 pucm-t RM5N 500 bp pucm-t RM5C 图 3 RM5N 与 RM5C 双酶切结果 Figure 3 Double enzyme digestion results of RM5N and RM5C : Double enzyme digestion result of pucm-t-rm5n; M: 100 bp DN ladder; 1: pucm-t and RM5N; : Double enzyme digestion result of pucm-t-rm5c; M: 100 bp DN ladder; 2: pucm-t and RM5C 2.2 重组质粒 pucm-t-rm5n 和 pucm-t-rm5c 阳性克隆的筛选与鉴定分别挑取 pucm-t-rm5n 和 pucm-t-rm5c 单克隆在含氨苄青霉素的液体 L 培养基中培养约 7 h 后, 以菌液为模板进行 PCR 扩增, 扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测结果发现 : 前者 1~5 号克隆为阳性 ( 图 2), 后者 1~7 号克隆均为阳性 ( 图 2) 随机取二者中阳性克隆送上海生工生物工程公司进行测序验证 M pcdn3.1(+)/rm5 重组质粒的鉴定将双酶切回收的 RM5N, RM5C 和 pcdn3.1(+) 空白质粒进行连接, 筛选阳性克隆将所筛选的阳性克隆用 Hind III 和 Xho I 进行双酶切鉴定, 结果阳性克隆能够切下大小约为 2.4 kb 的条带 ( 图 4), 与 RM5 基因开放阅读框长度相符将所筛选到的阳性克隆送至上海生工生物工程公司测序鉴定, 结果显示 RM5 基因能够正确插入到 pcdn3.1(+) 表达载体中, 没有移码和碱基突变 ( 图 5), 说明 pcdn3.1(+)/rm5 真核表达载体构建成功 bp RM5N M 1 M RM5C 5.0 kb 3.0 kb 2.0 kb 1.5 kb pcdn3.1(+) RM5 图 2 重组质粒 pucm-t-rm5n 和 pucm-t-rm5c 阳性克隆的筛选与鉴定 Figure 2 Screening and identification of the recombinant plasmid pucm-t-rm5n and pucm-t-rm5c : pucm-t-rm5n positive clones by PCR identification; : pucm-t-rm5c positive clones by PCR identification. M1: pucmix8 DN ladder; M2: 100 bp DN ladder; 1 7: DN ladder of different clones 图 4 pcdn3.1(+)/rm5 双酶切结果 Figure 4 Double digestion result of pcdn3.1(+)/ RM5 M: 1 kb DN ladder; 1: pcdn3.1(+) and the full length of the open reading frame of the RM5

998 中南大学学报 ( 医学版 ), 2014, 39(10) http://www.csumed.org 90 100 110 120 130 140 图 5 pcdn3.1(+)/rm5 质粒测序结果 Figure 5 Result of pcdn3.

1(+) 分别转染肺腺癌细胞 549 后, 经 G418 筛选得到抗性细胞克隆, 然后挑取经有限稀释法亚克隆后形成的单克隆扩大培养, 分别提取细胞总蛋白行 Western 印迹检测, 以 GPDH 为内参结果实验组细胞中 RM5 蛋白 ( 约 90 kd) 表达明显高于对照组 ( 图 6), 表明 549/RM5 稳转细胞系构建成功 1 2 RM5 90 kd GPDH 37 kd 图 6

5 998 中南大学学报 ( 医学版 ), 2014, 39(10) 图 5 pcdn3.1(+)/rm5 质粒测序结果 Figure 5 Result of pcdn3.1 (+)/RM5 plasmid sequencing The underlined GCTT is restriction enzyme cutting site of Hind III. TG is initiation codon 2.5 Western 印迹检测鉴定 RM5 基因过表达结果将重组质粒 pcdn3.1(+)/rm5 和空白质粒 pcdn3.1(+) 分别转染肺腺癌细胞 549 后, 经 G418 筛选得到抗性细胞克隆, 然后挑取经有限稀释法亚克隆后形成的单克隆扩大培养, 分别提取细胞总蛋白行 Western 印迹检测, 以 GPDH 为内参结果实验组细胞中 RM5 蛋白 ( 约 90 kd) 表达明显高于对照组 ( 图 6), 表明 549/RM5 稳转细胞系构建成功 1 2 RM5 90 kd GPDH 37 kd 图 6 Western 印迹检测 RM5 蛋白表达 Figure 6 RM5 protein expression detected by Western blot 1: pcdn3.1 (+) transfected cells; 2: pcdn3.1 (+)/RM5 transfected cells 2.6 流式细胞检测结果分别将重组质粒 pcdn3.1(+)/rm5 稳定转染的 549 细胞 [pcdn3.1(+)/rm5-549] 和空白质粒 pcdn3.1(+) 稳定转染的 549 细胞 [pcdn3.1(+)-549] 应用流式细胞技术进行检测结果显示 : 与 pcdn3.1(+)-549 相比, pcdn3.1(+)/rm5-549 处于 G 1 期细胞比例增大,S 期细胞比例减小 ( 均 P<0.01, 表 1) 2.7 pcdn3.1(+)/rm5-549 和 pcdn3.1(+)-549 细胞的 DHX15 基因 RT-PCR 扩增结果分别以 pcdn3.1(+)/rm5-549 和 pcdn3.1(+)-549 细胞总 RN 为模板进行 RT- PCR 检测,GPDH 为内参, 结果显示两种细胞均可见大小为 289 bp 的目的条带和 496 bp 内参条带 ( 图 7), 且 pcdn3.1(+)/rm5-549 细胞的条带亮度较 pcdn3.1(+)-549 细胞高利用 Quantity One 软件对两组电泳条带进行光密度分析, 并计算目的条带与内参条带光密度相对值, 结果表明 pcdn3.1(+)/rm5-549 细胞 DHX15 的条带相对值明显高于 pcdn3.1(+)-549 细胞 ( 图 7, P<0.01), 表明 DHX15 在 cdn3.1(+)/rm5-549 细胞内的表达上调表 1 pcdn3.1(+)/rm5-549 和 pcdn3.1(+)-549 细胞周期分布百分比 (n=5,x±s) Table 1 Percentage of cell cycle in pcdn3.1(+)/rm5-549 and pcdn3.1(+)-549 cells (n=5, x±s) 细胞类型 G 1 期 /% S 期 /% G 2 /M 期 /% pcdn3.1(+)/rm ±3.22** 16.83± ±1.08 pcdn3.1(+) ± ± ±2.14 与 pcdn3.1(+)-549 比较,G 1 期细胞比例增大,**P<0.01;S 期细胞比例减小, P<0.01

RM5 基因表达载体构建稳定转染 549 细胞系的建立及功能的初步研究肖锏, 等 999 1.5 489 501 bp 331 bp 242 bp M 1 2 3 4 GPDH DHX15 相对灰度值 1.0 0.5 0.0 ** pcdn3.1(+)/ RM5-549 pcdn3.1(+)- 549 图 7 pcdn3.1(+)/rm5-549 和 pcdn3.

1(+)-549 cells : Electrophoresis of RT-PCR amplification; M: pucmix8 DN ladder; 1 2: pcdn3.1(+)/rm5-549 cells; 3 4: pcdn3.1(+)-549 cells; : Histogram of RT-PCR amplification, **P<0.01 vs pcdn3.

6 RM5 基因表达载体构建稳定转染 549 细胞系的建立及功能的初步研究肖锏, 等 bp 331 bp 242 bp M GPDH DHX15 相对灰度值 ** pcdn3.1(+)/ RM5-549 pcdn3.1(+)- 549 图 7 pcdn3.1(+)/rm5-549 和 pcdn3.1(+)-549 细胞的 DHX15 基因 RT-PCR 扩增结果 Figure 7 RT-PCR amplification of DHX15 gene in pcdn3.1(+)/rm5-549 and pcdn3.1(+)-549 cells : Electrophoresis of RT-PCR amplification; M: pucmix8 DN ladder; 1 2: pcdn3.1(+)/rm5-549 cells; 3 4: pcdn3.1(+)-549 cells; : Histogram of RT-PCR amplification, **P<0.01 vs pcdn3.1(+)-549 cells 3 讨论 RM5 基因是位于人类染色体 3p21.3 杂合性缺 [4] 失区的多个基因之一, 大量研究证实 RM5 基因在多种肿瘤组织中表达均不同程度下降, 尤其是在肺 [6] 癌组织中表现明显且动物实验发现将 RM5 基因过表达的小鼠纤维肉瘤细胞接种至裸鼠体内后可显著抑制肿瘤的生长, 表明 RM5 基因具有潜在肿瘤抑制作用本研究以人睾丸 cdn 为模板对 RM5 基因进行扩增 RM5 基因开放阅读框全长 bp, 预实验时应用 Easy- 高保真酶扩增 RM5 全长时出现了不同程度碱基错配现象, 于是将 RM5 基因从单酶切位点 Kpn I(GGTCC, 始于 bp) 处分成两段分别进行 PCR 扩增, 然后分别克隆至 pucm-t 载体中, 经转化筛选阳性克隆酶切胶回收以及反复验证, 成功将全长 RM5 基因克隆至真核表达载体 pcdn3.1(+) 中, 表明选择的分段克隆法不失为长片段基因克隆的一种可行方法本研究借助脂质体成功将重组质粒 pcdn3.1(+)/rm5 转染肺腺癌细胞 549, 并用 Western 印迹鉴定出 RM5 基因过表达 549 细胞株 RM5 基因过表达 549 细胞经流式细胞检测显示重组质粒 pcdn3.1(+)/rm5 转染组处于 G 1 期细胞比例增大,S 期细胞比例减小, 提示 RM5 基因过表达可使细胞周期停滞于 G 1 期, 表明 RM5 基因过表达可通过抑制细胞周期进程而抑制细胞增殖, 进一步证实了 RM5 基因的肿瘤抑制功能, 这 [7] 与国外相关研究结果一致 DHX15 属于 DExD/H-box 蛋白家族一员, 是 [ 9 剪接体的组分之一 ], DExD/H-box 蛋白在 premrn 剪接中调控 RN-RN 之间和 RN- 蛋白之间的相互作用, 并且 DExD/H-box RN 解旋酶也在 pre-mrn 剪接过程的多个步骤中发挥着重要作用 [10] 目前已有诸多研究表明 RM5 基因在剪接调控中也发挥着重要作用 [13,16-17], 且研究发现 RM5 可直接与 DHX15 剪接体成份相互作用, 并且可有效促进 DHX15 的解旋酶活性 [13] 由此可知 RM5 与 DHX15 之间存在分子机制联系本研究分别检测了重组质粒 pcdn3.1(+)/rm5 转染组和空白质粒 pcdn3.1(+) 转染组肺腺癌细胞 549 中 DHX15 的表达水平, 结果显示前者细胞中 DHX15 的表达较后者明显上调, 表明 RM5 基因可能通过影响 premrn 的剪接对 DHX15 的表达进行调控综上分析, 本研究成功构建重组质粒 pcdn3.1(+)/rm5, 并建立了 RM5 稳转的 549 细胞系, 为进一步研究 RM5 基因在肺腺癌中的作用打下了基础初步证实 RM5 基因过表达可抑制肺腺癌细胞 549 周期, 并发现 RM5 基因表达可使 DHX15 表达上调, 这可能是 RM5 基因对 premrn 剪接调控的机制之一参考文献 1. Ji L, Minna JD, Roth J. 3p21.3 tumor suppressor cluster: prospects for translational applications[ J]. Future Oncol, 2005, 1(1): Timmer T, Terpstra P, van den erg, et al. comparison of genomic structures and expression patterns of two closely related flanking genes in a critical lung cancer region at 3p21.3[ J]. Eur J Hum Genet, 1999, 7(4): Wei MH, Latif F, ader S, et al. Construction of a 600-kilobase cosmid clone contig and generation of a transcriptional map surrounding the lung cancer tumor suppressor gene (TSG) locus on human chromosome 3p21.3: progress toward the isolation of a lung cancer

7 1000 中南大学学报 ( 医学版 ), 2014, 39(10) TSG[ J]. Cancer Res, 1996, 56(7): Liang H, Zhang J, Shao C, et al. Differential expression of RM5, EGFR and KRS mrn and protein in non-small cell lung cancer tissues[ J]. J Exp Clin Cancer Res, 2012, 31(1): Kim YS, Hwan JD, ae S, et al. Identification of differentially expressed genes using an annealing control primer system in stage III serous ovarian carcinoma[ J]. MC Cancer, 2010, 10: Oh JJ, West R, Fishbein MC, et al. candidate tumor suppressor gene, H37, from the human lung cancer tumor suppressor locus 3p21.3[ J]. Cancer Res, 2002, 62(11): Oh JJ, Razfar, Delgado I, et al. 3p21.3 tumor suppressor gene H37/ Luca15/RM5 inhibits growth of human lung cancer cells through cell cycle arrest and apoptosis[ J]. Cancer Res, 2006, 66(7): Zhao L, Li R, Shao C, et al. 3p21.3 tumor suppressor gene RM5 inhibits growth of human prostate cancer PC-3 cells through apoptosis[ J]. World J Surg Oncol, 2012, 10: Fouraux M, Kolkman MJ, van der Heijden, et al. The human La (SS-) autoantigen interacts with DDX15/hPrp43, a putative DEHbox RN helicase[ J]. RN, 2002, 8(11): Cordin O, anroques J, Tanner NK, et al. The DED-box protein family of RN helicases[ J]. Gene, 2006, 367: Deckert J, Hartmuth K, oehringer D, et al. Protein composition and electron microscopy structure of affinity-purified human spliceosomal complexes isolated under physiological conditions[ J]. Mol Cell iol, 2006, 26(14): onnal S, Martinez C, Forch P, et al. RM5/Luca-15/H37 regulates Fas alternative splice site pairing after exon definition[ J]. Mol Cell, 2008, 32(1): Niu Z, Jin W, Zhang L, et al. Tumor suppressor RM5 directly interacts with the DExD/H-box protein DHX15 and stimulates its helicase activity[ J]. FES Lett, 2012, 586(7): 杨幼波, 向红, 邢晓为. 人 TSRG4 真核表达载体的构建及稳定转染 HeLa 细胞系的建立 [ J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2009, 25(8): YNG Youbo, XING Hong, XING Xiaowei. Construction of eukaryotic expression vector of human TSRG4 and establishment of its stable transfected HeLa cell line[ J]. Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology, 2009, 25(8): 邢晓为, 袁洪, 王维. 小鼠睾丸生精新基因 SRG4 原核表达与纯化 [ J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2007, 23(8): XING Xiaowei, YUN Hong, WNG Wei. Prokaryotic expression and purification of SRG4, a novel mouse spermatogenesis gene[ J]. Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology, 2007, 23(8): Kotlajich MV, Hertel KJ. Death by splicing: tumor suppressor RM5 freezes splice-site pairing[ J]. Mol Cell, 2008, 32(2): Fushimi K, Ray P, Kar, et al. Up-regulation of the proapoptotic caspase 2 splicing isoform by a candidate tumor suppressor, RM5[ J]. Proc Natl cad Sci US, 2008, 105(41): ( 本文编辑傅希文 ) 本文引用 : 肖锏, 李念, 邢晓为, 何碧秀. RM5 基因表达载体构建稳定转染 549 细胞系的建立及功能的初步研究 [ J]. 中南大学学报 : 医学版, 2014, 39(10): DOI: / j.issn Cite this article as: XIO Jian, LI Nian, XING Xiaowei, HE ixiu. Construction of RM5 vector, establishment of stably transfected 549 cell line and preliminary research on the function of RM5 gene[ J]. Journal of Central South University. Medical Science, 2014, 39(10): DOI: /j.issn

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽

RM5 基因表达载体构建 稳定转染 549 细胞系的建立及功能的初步研究肖锏, 等 995 STRCT Objective: To establish a stable 549 cell line transfected by RN binding motif 5 (RM5) expression

RM5 基因表达载体构建稳定转染 549 细胞系的建立及功能的初步研究肖锏, 等 995 STRCT Objective: To establish a stable 549 cell line transfected by RN binding motif 5 (RM5) expression