期 木哈买提江 " 铁格斯等 基因在新疆褐牛不同组织中的表达研究 外 (% 还是许多病毒和细菌的细胞受体 +. 3 等和 3- 等研究发现 抗 (% 单抗和 (% 分子封闭均能有效抑制牛病毒性腹泻病毒 =<%< 感染细胞 说明 (% 是 =<%< 的细胞膜 受体 一些麻疹病毒和腺病毒就是通过 (%

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1 中国畜牧兽医! " # 基因在新疆褐牛不同组织中的表达研究 木哈买提江 铁格斯 张慧敏 宋焕堂 加尔肯 苏战强 冉多良 刘建华 新疆农业大学动物医学学院 乌鲁木齐 摘 要 为了探究 基因在新疆褐牛不同组织中的表达丰度差异 初步掌握 基因在新疆褐牛不同组织中的表达规律 试验设计了特异性引物 应用实时荧光定量 #(& 技术分析新疆褐牛心脏 肝脏 脾脏 肺脏 肾脏 小肠 大肠 胃 肌肉 卵巢和乳腺中的 基因表达情况 结果表明 新疆褐牛 基因在所检测的 种组织中均有表达 不同组织部位的表达存在差异 其中肝脏 (% 表达丰度最高 其表达丰度显著高于肺脏 脾脏 肾脏 胃 小肠 大肠 卵巢和乳腺 - 本研究对新疆褐牛各组织 基因的表达规律进行初步分析 为 基因表达规律与其生物功能研究的开展提供了参考依据 关键词 基因 新疆褐牛 组织 表达丰度中图分类号 文献标识码 $ 文章编号 8"%*!1$!!$!$!"$$!>$! 4+!0"&.1+*+7+4"34385$.*'" '251+>+4&$%., $% $&!" # :%%#!!5 ("" !3338!4333/;388! !+4 =0+7,3+;3,*+,-* /;38834.,+;+73! ;3! ;* &3+,7*3> #(&731> , /;388!433! !+4=0+7,3,313+7,938;,33,.43-8*+,73873, *+1*.8,39+++:3+8738;3793, , /;3883+,8+*;,38!+4=0+7, /;388713, !+7, ,.48;, *+18*+,73873, :3+87-=-++, ,78!4333/; !+4=0+7,3.,;93!*+7! /;38834.,+7;+73+:,4+,!.7 )*+%433+4=0+7, /;388+:.+3 哺乳动物 (% 受体 又叫膜辅助蛋白 *3* :+3!+7;73 (# 是一类表达于所有 有核细胞的 型跨膜糖蛋白 属于补体激活调节因 子 &($ 蛋白家族中的一员 它的主要功能是 结合 (: 和 (: 并允许它们被丝氨酸蛋白酶因子 裂解 这种作用能够使自身细胞免于被补体系统组分袭击和裂解 从而保护自体细胞免受补体系统 的破坏 近年来的研究发现 (% 是一种新的 细胞活化刺激辅助因子 在与 (% 单克隆抗体共同作用的情况下可激活 (& 它还可以调节炎症反应 使 (% 在免疫系统中的作用研究扩展到了 天然免疫系统之外 此外 生殖过程 多发性硬 化 大脑中的免疫应答都与 (% 有关 除了在补体激活和适应性免疫应答中的作用 收稿日期 基金项目 新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目 $ 作者简介 木哈买提江 " 铁格斯 男 新疆阿勒泰人 硕士 研究方向 分子病毒学 )*+,>>* 通信作者 刘建华 男 副教授 硕士生导师 研究方向 动物病毒感染与免疫调控 )*+,,.+1.+*

2 期 木哈买提江 " 铁格斯等 基因在新疆褐牛不同组织中的表达研究 外 (% 还是许多病毒和细菌的细胞受体 +. 3 等和 3- 等研究发现 抗 (% 单抗和 (% 分子封闭均能有效抑制牛病毒性腹泻病毒 =<%< 感染细胞 说明 (% 是 =<%< 的细胞膜 受体 一些麻疹病毒和腺病毒就是通过 (% 依附 在细胞表面 另外 $ 组链球菌属和一些奈瑟氏 菌属菌株都是利用 (% 作为受体 目前 利用 (% 作为受体侵染细胞的病原体数目还未有完全 统计 一般把 (% 描述为 病原体磁铁 最 新的一项研究证实了 (% 能够引发细胞自噬 (% 识别病原体后会引发宿主细胞的自噬 这是 控制感染的关键步骤 (% 分子无论是对正常细胞的功能维持还是 在病原的入侵过程中都起到了至关重要的作用 目 前 国内外针对 基因的研究报道较多 但对于 该基因在哺乳动物各种组织器官中的转录表达差异鲜有系统报道 由于基因的时空表达及其调控可能与机体的生长 发育及对环境因子刺激的应答密切相关 所以定量检测 *&$ 表达水平对任何涉及基 因功能的研究至关重要 因此 本试验采用实时荧光定量 #(& 技术 通过对新疆褐牛不同组织的 基因表达差异进行比较研究 探讨该基因在牛不同组织中的表达规律 对深入研究 (% 的生 物学功能及其作用机制具有重要意义 材料与方法, 材料新疆褐牛组织样品采自新疆华凌畜牧产业开发公司 乌鲁木齐 分别采集新疆褐牛母牛 头 种组织样本 心脏 肝脏 脾脏 肺脏 肾脏 小肠 大肠 胃 肌肉 卵巢和乳腺 大肠杆菌 % 感受态细胞 ; % 载体均由新疆农学大学动物医学学院传染病实验室保存 % %$ +3A)' / 均购自康为世纪生物科技有限公司 %$ 第一条链合成试剂盒 A+8'7+7; 33>#(& '.;3 / 均购自北京全式金生物技术有限公司 %$ 凝胶回收试剂盒 小提质粒试剂盒均购自 #*34+ 公司 &6, 购自 公司, 引物设计与合成根据 3=+ 数据库中牛 登录号 和 #! 登录号 基因序列 使用 #*3#3*3 设计实时荧光定量 #(& 引物 引物序列见表 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 表 引物信息 (&$.$!."$! 基因 引物序列 片段长度 退火温度 338 #*383>.338DD #.7,3471:; $3+,473*;3+7.3C $$($$($ &$($((($ #! $($$$($(((((( &$($(((($$$($,- 目的片段的克隆及测序将组织在液氮中磨碎 然后用, 试剂抽提总 &$ 使用核酸定量仪检测 &$ 的浓度及纯度 使用 %$ 第一条链合成试剂盒将总 &$ 反转录成 %$ 以 %$ 为模板进行 #(& 扩增 #(& 反应体系为 A)' / 上 下游引物 *, 各 %$ 模板 " #(& 反应条件 C 预变性 * C 变性 8 退火 退火温度见表 8 C 延伸 8 共 个循环 C 延伸 *#(& 扩增产物经 琼脂糖凝胶电泳检测 并使用 %$ 凝胶回收试剂盒回收目 的基因 回收产物与 ; % 载体进行连接 并转化 大肠杆菌 % 感受态细胞 均匀涂布至含有氨苄 青霉素抗性的固体培养板中 于 C 培养箱静置 1 测序鉴定阳性单克隆菌落, 熔解曲线和标准曲线制备 使用小提质粒试剂盒提取质粒 ; % (% +7 并将其浓度稀释成 4 并连 续 倍稀释测序阳性质粒 采用实时荧光定量 #(& 制备目的基因和内参基因标准曲线和熔解曲 线 #(& 反应体系 A +8'7+7 ; 33 >#(& '.;3 / 上 下游引物

3 中 国 畜 牧 兽 医 卷 *, 各 质粒模板 " 使用 =&+(&3+,7*3#(&'-873* 两步法程序扩增 反应条件为 C 预变性 * C 变性 8 C 退火 8 个循环, 基因在新疆褐牛不同组织中的表达分析使用 %$ 第一条链合成试剂盒将由不同组织提取的 4 总 &$ 反转录成 %$ 按照 中步骤进行实时荧光定量 #(& 检测新疆褐牛不同组织中 (% *&$ 水平 采用 B (7 法计算目的基因拷贝数 每个时间点各样品进行 次重复, 统计分析 利用 '#'' 统计学软件对数据进行单因素! 检验 以 - 为差异显著性判断标准 结 果, 目的片段的克隆及测序结果用特异性引物进行 #(& 扩增 产物经 琼 脂糖凝胶电泳 结果得到与预期大小一致的条带 图 测序结果显示 克隆得到的目的片段序列和 3=+ 上已发表的目的基因序列核苷酸同源性为 说明扩增得到的 &#(& 产物是目的 基因 % %$ +3 阴性对照 基因 #(& 扩增产物 #! 基因 #(& 扩增产物 % %$ ,13#(& +*;,!+7;.7!43313#(&+*;,! +7;.7!#!433 图 重组质粒的 0 鉴定 '$,%!"$$"$!.($!!"1&.$%(*0, 目的基因熔解曲线和标准曲线 目的基因实时荧光定量 #(& 产物熔解曲线呈 现单一主峰 表明引物特异性良好 图 目的 基因标准曲线方程为 - B/ 相 关系数 & 为 内参基因标准曲线方程为 -B/& 为 表明引物扩增效率很高 图 图 基因熔解曲线 '$,.&"2!,- 基因在新疆褐牛不同组织中的表达水平利用 =&+ ( &3+,7*3#(& 仪检测 基因 *&$ 在新疆褐牛心脏 肺脏 肝脏 脾脏 肾脏 胃 小肠 大肠 卵巢 肌肉 乳腺等组织中 的表达丰度 并采用 B (7 法计算目的基因拷贝数 结果见图 由图 可知 新疆褐牛 基因 *&$ 在所检测的 种组织中均有表达 其中肝脏 基因 *&$ 表达量最高 显著高于肺脏 脾脏 肾脏 胃 小肠 大肠 卵巢和乳腺 -

4 期 木哈买提江 " 铁格斯等 基因在新疆褐牛不同组织中的表达研究 图 -6(, 基因熔解曲线 '$,-.&"26(,! 图 $ 和 6(,= 基因标准曲线 '$,"!%%2$!%6(,=! 心脏 肺脏 肝脏 脾脏 肾脏 胃 小肠 大肠 卵巢 乳腺 肌肉 肩标不同字母表示差异显著 - 肩标相同字母表示差异不显著 ';,333-'7*+1'*+, "9++ =3+87.8, *309+, !337,3738.;38;78 *3+84!+7!333-1, *3,3738.;38;78*3+84!+7!333- 图 新疆褐牛不同组织 基因./ 相对表达量 '$,&"$21$!&2&!./$!%$!""$$!>$! 4+!"&

5 中 国 畜 牧 兽 医 卷 果为 基因表达规律与其生物功能研究的开展 - 讨 论 补体系统是先天性免疫的重要组成部分 是存 在于动物血清和组织液中的一组被激活后具有酶活性的蛋白质 补体广泛存在于血清 组织液和细胞膜 表面 补体激活调节是通过炎症反应产生过敏毒素来实现的 一旦补体被激活后 将不再辨别自身 和病原 因此 补体必须被严格地调节来保护宿主免受其害 这一调节是通过补体调节蛋白来实现 的 牛 (% 受体在补体反应中起重要作用 目前 (% 被认为是抑制补体旁路激活的最有效的因子 它可以整合不同的危险信号或刺激广泛调节细胞内反应 参与免疫稳态 保护 细胞 免疫 (% 分子在机体内参与很多生物功能 它不仅是对机体维持正常细胞功能 而且在病原微生物入侵的过程中也起到了至关重要的作用 目前 (% 的生物功能已成为近年来分子生物学的研究热点 人们对很多物种 (% 进行了研究 但是关于定量检测哺乳动物不同组织 (% *&$ 表达水平的研究鲜有报道 因此 本试验首次采用实时荧光定量 #(& 方法较系统地研究了 基因在新疆褐牛各种组织器官中的转录表达差异 研究发现 基因在所检测的新疆褐牛各组织中均有表达 且不同组织中的表达存在差异 其中肝脏 基因 *&$ 表达量最高 这一结果可能与肝脏的生物功能有关 近年来 越来越多的研究证实 了肝脏也是一个免疫器官 它含有丰富的细胞成分 如窦内皮细胞 星状细胞 树突状细胞及淋巴细 胞 而 (% 在这些细胞表面大量表达 $7+,N9 等利用针对牛 (% 蛋白的单克隆抗体 6<$ 检测暴露在卵子表面和精子顶体的膜抗原 本试验结果发现 基因在新疆褐牛卵巢中也有较高的表达量 表明 基因可能在褐牛生殖过程中具有重要的作用 这与 +-, 等推测 (% 可能在受精过程中扮演重要角色的结论相一致 结 论本试验对新疆褐牛各组织 基因的表达规律进行了初步的研究 对其在各组织中的表达量进行了比较 结果表明 基因在所检测的 种组织中均有表达 不同组织部位的表达存在差异 其中肝脏 基因 *&$ 表达量最高 这一试验结 提供了参考依据 参考文献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

6 期 木哈买提江 " 铁格斯等 基因在新疆褐牛不同组织中的表达研究 !.# 阮姝楠 卢 燕 陈道峰 等 广藿香的抗补体活性成分 中国中药杂志 宋伟华 丹皮和毛七公的抗补体活性成分研究 % 上海 复旦大学 +*+*7++$ %+84.;7+#37+,(% 13*.,77+83!*;,3*37;7386!*!$0$$& $#! +,;7 (*;,3*3787!70;+78 + /,%0$$& " # +,;7 (*;,3*37'3!70;+78 + /,%0$$& " # 闫 蕾 赵彩彦 肝脏 一个新的免疫器官 国际内科学杂志 3+&-3$+%3;7.+=%3; ,6**.7-!713,93'3, !*,$ 0$ $& 6$$% 1.,3'&+$7813$37+, /;388++,-88!<3,33;7(% 3,8!1.*+:,;3;13+,:,+ (' *:,3,3.+; ,8 $$% 0$ $7+,N9'* ,637!+ 7! (#(% ++,4.3 : *,+,+7:-6<$!* 6$$% 6$!$$% +-,(=,+ 48,+(&37+,61 :7!1.*+8;3* :- *,+,+7:387 (% *3*:+3!+7;73. $#!$ 责任编辑 晋大鹏

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