中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2011,31(1):40?45 殏檪檪殏技术与方法殏檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏一种多基因串联共表达载体的构建 1,2 何彰华王 2 洋黄赵 1 芬 2 臖尤 2 刘晓杰 1 平 2 张丽华 2

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狷奚
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,011,31(1):40?45 檪檪技术与方法檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪一种多基因串联共表达载体的构建 1, 何彰华王洋黄赵 1 芬臖尤刘晓杰 1 平张丽华赵志虎王东师明磊 (1 陕西师范大学生命科学学院西安军事医学科学院生物工程研究所北京 ) 摘要为了构建一种可用于串联共表达多个基因的原核表达载体, 通过 PCR 引入点突变, 对商业载体 pet b 的酶切位点进行定向改造, 设计独特的 XbaⅠ /SpeⅠ 模块获得改造成功的载体 pet mb, 测序结果显示启动子核糖体结合位点多克隆位点及终止子均位于 XbaⅠ 和 SpeⅠ 两酶切位点间选取不同来源的基因进行串联组合及表达鉴定, 四个基因成功组合于同一载体中, 表达效果良好, 各基因表达效率不受明显影响研究构建的载体 pet mb, 使多基因的共表达更加便捷, 为蛋白复合物的表达与纯化代谢通路的异源重建及其优化等研究奠定了良好的基础关键词表达载体共表达串联组合代谢通路组装中图分类号 Q78 大肠杆菌是最常用的遗传工程宿主, 选用合适的表达载体可实现外源基因在大肠杆菌中的高效表达目前常见的多种不同类型的表达载体, 基本上可以满足科研工作者在大肠杆菌中表达单个外源基因的常规需求, 但随着学科的发展, 很多工作中需要实现多个基因的共表达, 此时使用常规表达载体就不是非常方便目前, 大肠杆菌共表达系统通常包括多质粒共转 [1] 化系统和多顺反子系统 [] 多质粒系统中, 通常将多个外源基因分别克隆至不同抗性的载体中, 共转化后同时添加多种抗生素实现多基因的共表达, 由于受到抗性标记种类及组合方式的限制, 这种系统仅能实现少数几个基因的共表达多顺反子表达系统就是将多个目的基因克隆于同一表达载体, 外源基因含有各自的翻译起始及终止信号, 各基因虽以共同 mrna 进行转录, 却能独立翻译利用这种翻译藕联策略, 成功构建了单一质粒介导的多顺反子表达系统, 实现了相关基因在大肠杆菌中的非融合的可溶性表达 [] 近年收稿日期 : 修回日期 : 国家重大新药创制关键技术平台资助项目 (008ZXJ ) 通讯作者, 电子信箱 :youping@snnu.edu.cn;zhaozh046@gmail. com 来, 国外一些研究者通过利用同尾酶进行多顺反子表达系统的串联组合, 使共表达基因的数量有了较大突 [3] 破如 Salvador 等通过多顺反子串联, 将来源于 Micromonosporamegalomicea 的糖基化基因分两组克隆于两个抗性不同的载体中, 实现了多个基因在大肠杆菌中的共表达但是, 多顺反子系统存在翻译极性效应, 各基因的表达并不趋于平衡, 当串联基因较多时, 这种现象有可能尤为明显, 最终严重影响整个代谢通路的效率 [4] 此外, 应用常规商业载体, 要实现多基因的串联组合, 需要在引物中设计同尾酶, 可选择的酶切位点也受到很大限制研究尝试了一种多基因共表达的新策略, 即每个基因带有独立的启动子核糖体结合位点终止子等表达调控元件, 构成独立的表达盒, 再利用限制性同尾酶实现基因表达盒的串联组装, 各基因的表达相对独立实验中, 利用重叠 PCR 技术, 通过对商业载体 pet b 序列的定向改造, 成功构建了一种新型多基因共表达载体, 利用 XbaⅠ /SpeⅠ 互为同尾酶的特点, 实现了单一质粒介导的多基因的高效共表达

2 011,31(1) 何彰华等 : 一种多基因串联共表达载体的构建 41 1 材料与方法 1.1 材料表达载体 pet b 由本实验室保存 ;T4DNA 连接酶和 DNA marker 购于北京全式金生物公司 ; 蛋白 marker 为 Fermentas 公司产品 ; 限制性内切酶 DNA 聚合酶为 TaKaRa 公司产品 ; 质粒小提试剂盒凝胶回收试剂盒普通产物回收试剂盒大肠杆菌 DH5α 感受态和 BL1 感受态均购于天根公司氨苄青霉素购自 Amresco 公司 ; 其他试剂均为国产分析纯产品用于串联组合及表达鉴定的基因均为本实验室克隆保存 ( 表 1) 表 1 研究中所用基因 Table1 Geneusedinthestudy Genename Length(bp) Proteinmolecularweight(kDa) Function From desⅥ N,N Dimethyltransferase S.venezuelae erybⅣ ketoreductase S.erythraea groel chaperon E.coli groes chaperon E.coli 1. 引物设计与片段的扩增以商业载体 pet b 序列为参考, 结合相应的酶 SpeⅠ F1,SpeⅠ F 中粗体部分为重叠序列以 pet b 为模板,XbaⅠ F/XbaⅠ R 为引物, 切位点, 设计引物同时引入点突变, 引物序列见表在 BglⅡ 和 NdeⅠ 两酶切位点附近设计一对引物 XbaⅠ F/XbaⅠ R,XbaⅠ F 序列中引入突变增加 XbaⅠ 酶切位点,XbaⅠ R 序列中引入突变使 XbaⅠ 酶切位点消失 ; 在 DraⅢ 和 BlpⅠ 两酶切位点间设计引物 SpeⅠ F1/ SpeⅠ F/SpeⅠ R,SpeⅠ F1 序列中引入突变增加 Spe Ⅰ 酶切位点表中下划线部分为对应的酶切位点 ; PCR 扩增获取 XbaⅠ 酶切位点移动的片段 (BglⅡ Xba Ⅰ NdeⅠ);SpeⅠ F1/SpeⅠ F/SpeⅠ R 为引物, 通过重叠 PCR 扩增获取引入 SpeⅠ 酶切位点的片段 (BlpⅠ SpeⅠ DraⅢ) 根据如下程序进行 PCR 扩增 :94 min (94 30s 60 30s 7 30s) 30 个循环 7 5min 表研究中所用引物及其序列 Table Primersandsequenceusedinthestudy Primername Sequence(5 3 ) RestrictionEnzymecutingsite SpeⅠ F1 GGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTAGTGGATCCGGATTGGCGAATGGG SpeⅠ SpeⅠ F CACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTG BlpⅠ SpeⅠ R GGCCCACTACGTGAACCATC DraⅢ XbaⅠ F TCGAGATCTAATCTAGATACCGCGAAATTAATACG BglⅡ XbaⅠ XbaⅠ R TTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTGTAGAGGGGAATTGTTA NdeⅠ 1.3 片段置换及鉴定取 PCR 产物 (BlpⅠ SpeⅠ DraⅢ) 和质粒载体 pet b 分别用 DraⅢ BlpⅠ 双酶切处理, 回收两酶切产物并建立连接体系,16 连接过夜, 然后转化大肠杆菌 DH5α, 用氨苄青霉素筛选阳性克隆, 提取质粒, 酶切鉴定得到含有 SpeⅠ 酶切位点的载体 pet b SpeⅠ 将 PCR 产物 (BglⅡ XbaⅠ NdeⅠ) 和质粒载体 pet b SpeⅠ 分别用 BglⅡ NdeⅠ 双酶切处理, 回收两酶切产物并建立连接体系,16 连接过夜, 然后转化大肠杆菌 DH5α, 用氨苄青霉素筛选阳性克隆, 酶切及测序鉴定, 得到修改成功的载体 pet mb 1.4 多基因串联组合选择实验室保存的四个大小各异的基因 (desⅥ erybⅣ groes groel), 分别克隆至 pet mb 中, 利用 XbaⅠ 和 SpeⅠ 互为同尾酶的特性, 通过酶切连接实现四个基因的串联组合, 获取重组质粒 pet mb desⅥ erybⅣ groes groel 1.5 多基因表达鉴定将构建正确的重组质粒 pet mb desⅥ erybⅣ groes groel 以及四个单基因质粒 pet mb desⅥ, pet mb erybⅣ,pet mb groes,pet mb groel 分别转化大肠杆菌 BL1(DE3) 活化的菌液于 37 培养约 1h, 待 OD 600 值达到 0.4~0.6 之间, 加入 IPTG( 终浓度为 0.5mmol/L), 于 37 诱导 4h, 收集菌体各取 1ml 菌液高速离心 1min, 沉淀悬于 100μl1 SDS 凝胶加样缓冲液, 沸水浴 6min, 离心收集上清, 取小量样品

4 进行 SDS PAGE 鉴定结果中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.31No.1011.

3 4 进行 SDS PAGE 鉴定结果中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.31No 表载体的定点突变常用商业载体 pet b 中包含启动子核糖体结合位点多克隆位点终止子等在内的表达盒前后没有合适的酶切位点可以使用为了便于完整表达盒前后串联重复, 通过定点突变, 将 XbaⅠ 由 T7 启动子下游移到启动子上游, 同时在终止子下游处添加 XbaI 的同尾酶 SpeⅠ 这样 XbaⅠ /SpeⅠ 之间包含完整的表达盒, 利用 XbaⅠ 和 SpeⅠ 同尾酶的特性, 可以便捷实现包含外源基因在内的完整表达盒的串联组合.1.1 目的片段的获取应用设计的引物, 以 pet b 为模板,PCR 分别获取了目的片段 (BglⅡ XbaⅠ NdeⅠ) 和 (BlpⅠ SpeⅠ DraⅢ) 片段(BglⅡ XbaⅠ NdeⅠ) 约 10bp, 片段 (BlpⅠ SpeⅠ DraⅢ) 约 330bp ( 图 1), 与预期一致图 1 目的片段的 PCR 扩增 Fig.1 PCRamplificationoftargetfragment M:DNAMarker;1:XbaⅠ F/XbaⅠ RPCR product;:speⅠ F/SpeⅠ RPCRproduct.1. 目的片段的置换与鉴定通过酶切连接, 分两步置换了两条目的片段, 得到修改成功的质粒 pet mb, 酶切鉴定电泳检测结果见图用 XbaⅠ SpeⅠ 单切质粒分别获得单一的条带, 用 XbaⅠ 和 SpeⅠ 双酶切质粒得 340bp 的小片段, 结果与预期一致将载体 pet mb 分别用引物 T7pro 和 T7ter 双向测序, 结果所示 :363bp 至 368bp 间引入 SpeⅠ 酶切位点 ( 图 3a);XbaⅠ 酶切位点移至 BglⅡ 位点附近 ( 图 3b); 其它酶切位点及功能元件均无碱基突变将 pet mb 两测序结果进行拼接, 载体中启动子核糖体结合位点终止子及多克隆位点均位于 XbaⅠ 和 SpeⅠ 两酶切位点间 ( 图 3c) 图 pet mb 的酶切鉴定 Fig. RestrictiondigestionanalysisofpET mb M:DNAMarker;1:pET mb;:pet mb/xbaⅠ +SpeⅠ; 3:pET mb/speⅠ;4:pet mb/xbaⅠ. 多基因的串联组合利用 XbaⅠ 和 SpeⅠ 互为同尾酶的特性, 选择 Xba Ⅰ 上游的 BglⅡ 酶切位点, 按图 4a 所示组合策略, 完成四个基因的串联组装, 成功构建了重组质粒 pet mb desⅥ erybⅣ groes groel 用 NdeⅠ 和 HindⅢ 双酶切鉴定重组质粒, 电泳结果见图 4b: 得到大小正确, 条带清晰的四个基因片段及 5kb 左右的载体片段 ; 基因间的 Linker 约 70bp, 与基因 groes 片段大小接近, 电泳图中条带重叠.3 组合体的表达鉴定诱导后, 制备蛋白样品进行 SDS PAGE 电泳 ( 图 5) 四个基因分别克隆于载体单独表达, 均有较高的表达量 ; 四个基因组装至同一载体中共表达, 各基因同样有明显的表达, 目的条带均清晰可见 3 讨论研究成功构建了一种可实现多基因串联组合共表达的原核表达载体 pet mb, 在载体中启动子核糖体结合位点多克隆位点及终止子均位于 XbaⅠ /SpeⅠ 表达盒中利用 XbaⅠ /SpeⅠ 互为同尾酶的特性, 成功实现了同一质粒共表达四个不同基因 desⅥ,erybⅣ, groes,groel 的目的 ( 图 5), 表明所构建的多基因串联表达载体是实用的, 通过多个基因表达盒的串联组合, 在同一载体中串联共表达多个基因的策略是可行的这种新型的共表达策略赋予每一基因单独表达盒, 组合后每个基因带有各自独立的启动子核糖体结合位点终止子等表达元件, 基因的表达相对独立研究试探性的选取四个基因进行组合共表达, 结果非常理想, 显然该载体或该策略所能承载的基因数量及基因序列长度远在此四个基因之上图 5 第道中四基

011,31(1) 何彰华等 : 一种多基因串联共表达载体的构建 43 图 3 pet mb 突变区域的序列测定 Fig.

图 4 多基因表达盒的串联组合 Fig.4 Tandem combinationofmulti gene expresioncasete (a)schematicdiagram ofcombinationstrategies(b) Restriction digestionanalysisoftheconstruct.

5 TheSDS PAGEanalysisoftheinducedsingle genesexpresionindividualyandmulti genes expresionsimultaneously M:proteinMarker;1:BL1(DE3)(pET mb desⅥ erybⅣ groes groel)uninduced;:bl1(de3)(pet mb desⅥ eryb Ⅳ

4 011,31(1) 何彰华等 : 一种多基因串联共表达载体的构建 43 图 3 pet mb 突变区域的序列测定 Fig.3 ThesequencingvalidationofmutationareaofpET mb (a)thesequencingresultofmutatedspeⅠsiteregion(b)thesequencingresultofmutatedxbaⅠ siteregion(c)thediagramoftheexpresioncasetecoveredbyxbaⅠ /SpeⅠfragment 图 4 多基因表达盒的串联组合 Fig.4 Tandem combinationofmulti gene expresioncasete (a)schematicdiagram ofcombinationstrategies(b) Restriction digestionanalysisoftheconstruct.m:dnamarker;1:pet mb desⅥ erybⅣ groes groel; :pet mb desⅥ erybⅣ groes groel/ndeⅠ +HindⅢ 因共表达,groEL 的表达量较其它基因高, 这与它们单独表达时的表达差异是一致的, 进一步证实了各基因表达的相对独立如果这种个别基因的高表达量是不图 5 多基因及单基因的诱导表达 Fig.5 TheSDS PAGEanalysisoftheinducedsingle genesexpresionindividualyandmulti genes expresionsimultaneously M:proteinMarker;1:BL1(DE3)(pET mb desⅥ erybⅣ groes groel)uninduced;:bl1(de3)(pet mb desⅥ eryb Ⅳ groes groel)induced;3:bl1(de3)(pet mb desⅥ ) induced;4:bl1(de3)(pet mb erybⅣ)induced;5:bl1 (DE3)(pET mb groes)induced;6:bl1(de3)(pet mb groel)induced;arowshowsinterestprotein 希望的, 给该基因替换一个相对较弱的启动子可以巧妙的避免这一现象近几年, 在大肠杆菌中共表达多个基因的研究取得了较大的进展, 特别是合成生物学领域, 成功实现了在大肠杆菌中共表达整套代谢通路 [5], 其中大部分研究者应用的都是多质粒共转化系统及多顺反子系统 [4] Lee 等应用两个质粒实现了来源于 3 株不同链霉菌的 14 个糖基化基因在大肠杆菌中的共表达, 添加相应的底物和诱导剂, 低温诱导 7 小时后检测到目的产

5 44 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.31No.1011 物, 但是产量很低进一步的研究发现, 多顺反子系统中多基因共表达过程中个别基因被选择性的过表达, 而其它基因表达显著偏低 [4] 实验中构建的载体, 有望避免多顺反子系统中多基因共表达的这种不均一性, 使各基因表达趋于平衡, 大大改善代谢通路的效率, 提高目的产物的产量载体中 XbaⅠ /SpeⅠ 表达盒的组装非常便捷, 只需将目的基因按常规方法分别克隆于表达载体的多克隆位点, 之后就可以应用图 4a 所示的组合策略完成组装研究中使用的是 XbaⅠ /SpeⅠ 同尾酶的组合, 利用其它同尾酶的组合如 XhoⅠ /SalⅠ BamHⅠ /BglⅡ 等, 采用类似的策略, 也可以实现单一质粒共表达多个基因的目的此外, 采用那些不依赖限制性内切酶的重组技术或者使用人造限制性内切酶人工改造可以识别更长 DNA 序列的工程限制性内切酶等, 也能方便地进行独立表达盒的串联组合实现多基因的共表达, 并且可以回避目的基因中存在的常用限制性内切酶所带来的限制 [6 9], 因此这一策略具有较好的通用性研究中载体构建的方案, 特别是利用同尾酶 Xba Ⅰ /SpeⅠ 组合实现表达盒串联组装的策略适用于其它表达载体的构建应用这种方案构建启动子不同的表达载体, 各基因可以选择强弱不同的启动子, 从而特异的调节组合体中各基因的表达水平, 满足特定条件下的特殊需要 ; 构建抗性不同的表达载体, 结合多质粒共转化策略, 可以实现更多基因的共表达总之, 通过表达盒的串联重复, 利用同一质粒介导多个不同基因共表达策略的成功实现, 对于蛋白复合物的表达与纯化及其三维晶体结构的测定 [1] 聚酮类化合物的组合性生物合成与定向进化等, 都具有重要意义参考文献 [1]GraslundS,NordlundP,WeigeltJ,etal.Proteinexpresionand purification.natmeth,008,5(): [] 赵志虎, 张用书, 马清钧, 等. 外源蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的新策略. 生物技术通讯,000,11(3):164. ZhaoZH,ZhangYS,MaQJ,etal.LetBiotech,000,11 (3):164. [3]SalvadorP,HugoG M,EduardoR,etal.Productionofthe PotentAntibacterialPolyketideErythromycin C in Escherichia coli.applenvironmicrobiol,005,71(5): [4]LeeH Y,KhoslaC.Bioasay guidedevolutionofglycosylated macrolideantibioticinescherichiacoli.plosbiol,007,5(): [5]WangH H,IsaacsFJ,CarPA,etal.Programmingcelsby multiplexgenomeengineering and accelerated evolution. Nat Let,009,460(13): [6]ShaoZ,ZhaoH,ZhaoH.DNAAsembler,aninvivoGenetic MethodforRapidConstructionofBiochemicalPathways.Nuc AcidsRes,009,37():e16. [7] 李山虎, 洪鑫, 周建光, 等.Gap Repair 方式建立一种基于 pbr3 Red 的新型重组工程系统. 遗传学报,005,3(5): LiSH,HongX,ZhouJG,etal.GeneticaSinica,005,3 (5): [8]LiM Z,EledgeSJ.Harnesinghomologousrecombinationin vitrotogeneraterecombinantdnaviaslic.natmeth,007,4 (3): [9]KlugA.Thediscoveryofzincfingersandtheirapplicationsin generegulationandgenomemanipulation.annurevbiochem, 010,79: ConstructionofaVectorSuitablefortheTandem Coexpresion ofmultiplegenesbyasingleplasmid HEZhang hua 1, WANGYang ZHAOJun LIUXiao jie ZHANGLi hua WANGDong SHIMing lei HUANGFen 1 YOUPing 1 ZHAOZhi hu (1ColegeofLifeScience,ShaanxiNormalUniversity,Xi an 71006,China BeijingInstituteofBiotechnology,Beijing ,China) Abstract Todevelopanrobuststrategyforthetandem repeatco expresionofmultiplegenesinone plasmid,thepointmutationswereintroducedintocommercialexpresionvectorpet bbytheoverlappcr. Afterthemutation,therestrictionenzymesiteXbaⅠ wasmovedtotheupstreamoft7promoterandaspeⅠ site

6 011,31(1) 何彰华等 : 一种多基因串联共表达载体的构建 45 wasintroducedtothedownstream oft7terminator.thewholeexpresioncaseteincludingthet7promoter, ribosomebindingsites,multiplecloningsite,t7 terminatorwerecoveredbythexbaⅠ SpeⅠ restriction fragment.restrictiondigestionandsequencingindicatethatthemutatedexpresionvectorpet mbwas constructedsuccesfuly.thefourgenesofdiferentsourceswerechooseforthecoepxresionbythepet mb. TheSDS PAGEshownthatthefourgeneswerehighlyco expresedandwithoutanyafectiononeachother.the resultsindicatedaneficientco expresionvectorsuitableforthetandemcombinationexpresionofmultiplegenes insingleplasmidwasconstructed,whichwilmaketheco expresionofmanygenesmoreeasyandwilalso greatlyfacilitatetheexpresionandpurificationofmulti subunitproteincomplex,therapidheterogenesisre constructionandoptimizationofbiochemicalpathwaysetc. Keywords Expresionvector Co expresionofmultiplegenes Tandem combination Asemblyof biochemicalpathway 檪檪姜老师信箱檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪蛋白质研讨班学员问 : 姜老师, 您好! 我想向您请教关于怎样利用双水相萃取重组蛋白的问题我查了些资料, 但对以下问题还不是很清楚 : 1. 应该选取什么浓度范围的体系组合来从发酵的 E.coli 中提取蛋白? 裂解后的细菌细胞不用离心分离上清就可以直接加入双水相体系中吗?. 是否需要确定体系双水相的相图? 若需要, 上下相的各种组分的浓度怎样测定? 3. 环境温度和 ph 有什么要求? 4. 双水相系统可以从总蛋白中分离目的蛋白吗? 或者可以有效除去大量杂蛋白吗?SDS-PAGE 能否检测上下相的分离效果? 5. 萃取结束后若目的蛋白在上相, 可以直接用 SDS-PAGE 上样检测吗? 还是需要反萃取去除 PEG 后才可以进行 PAGE? 希望得到您的解答, 谢谢! 姜老师答 : 学员, 你好! 双水相的注意事项如下 : 1. 双水相用于细胞破碎提取液时, 因为核酸和细胞壁碎片都是分配在下相, 因此就必须让目的蛋白分配在上相跟其他纯化工作一样, 要尽量了解你的目的蛋白的性质, 尤其是疏水性要先选定体系, 比如 : 硫酸铵 -PEG 磷酸钾 -PEG 硫酸钠 -PEG 柠檬酸钠 -PEG, 有的蛋白质甚至可以选用硫酸铵 - 乙醇体系等. 要有选定体系的相图, 有文献参考就更容易选定第一个测定的浓度, 然后在这个相点附近做扫描 3. 要了解目的蛋白在相应盐析时的浓度, 在加入 PEG 分相后, 下相的盐浓度不要高于这个盐浓度双水相对生物大分子的稳定性是有保护作用的, 室温操作即可 ; 同时由于整个体系的盐浓度较高, 因此对等电点不敏感, 选择 ph 时更多可以从抑制蛋白酶和有利于下一步纯化等方面考虑注意选用硫酸铵体系时 ph 不要超过测定上下两相的蛋白浓度和量, 以及目的蛋白的含量 5. 要在细胞碎片和核酸都在下相的情况下, 蛋白质的分配系数与总蛋白的分配取得权衡, 并充分利用杠杆原理选择上下两相的相对大小, 以实现最大的纯化倍数 6. 双水相中的蛋白质电泳需要把高盐和 PEG 浓度大大降低才可以得到可靠结果, 因此建议尽量采用活性测定方法来检测目的蛋白双水相的难点主要是开始的系统选择, 蛋白质在双水相中的行为是不易了解的, 因此参考成功例子, 从实例的数据入手就能简单得多祝实验顺利!

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽