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1 第 卷第 期 年 月 江苏大学学报 医学版! "# %&#' # ' 外源性 ( 基因在胃癌 B=( 细胞株中的表达及鉴定 张玲 高硕 张斌 王梅 许潇 钱晖 许文荣 江苏大学基础医学与医学技术学院 江苏镇江 江苏大学附属医院医学检验科 江苏镇江 摘要 目的 建立 ( 稳定转染的 B=( 细胞株 为 ( 基因在胃癌发生发展中的作用研究奠定基础 方法 采用脂质体介导法将 (& # % ( 及 (& # % 质粒转染至 B=( 细胞. 后加入终质量浓度 -18 的 = 抗生素进行药物加压筛选 获得阳性单克隆细胞株 通过 ( 和蛋白质印迹检测细胞中 ( 的表达情况 结果 成功构建了稳定过表达 ( 的 B=( 细胞株 稳定转染细胞株中 ( 的 - + 和蛋白水平明显高于未转染组及转染空载体组 结论 本实验成功筛选出 ( 基因过表达的稳定转染胃癌细胞系 关键词 胃癌 ( = 筛选 过表达 中图分类号 4 文献标志码 + 文章编号 * +! %" 5!"/ 8 " # 8!"9 8!"0' 8 8 &! 8 '. 8 /. &#' / # # ' 8 %&#' #! "# %.# F # -# ( 8 %.#+ #' B! "# %.# F (. # % #..# # ("# # # B=( # # % ' #.# # (.#'#"# -# # & ' (& # % ( ' (& # % -' # # # #' B=( # " 8 # - # +. # # # # #.# #'. = # -18 % % # #' # B=( # # # #'.## # ( # # # '## - #' % ( ' ##.#B=( ( # # #'.## # #"# /+88 B=( ( # %..#. # #' B=( # ' B=("# # 0# # % ## #'.# # ("# # # B=( # # # ( = # # "# # # 胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一 病死率 居全球恶性肿瘤第 位 我国胃癌发病率较高 患者发病早期手术切除生存率较高 但对于晚期 手术及放化疗效果均不理想 胃癌的发生发展和预后是多基因 多因素及多阶段改变的结果 研究相关基因在癌变过程中的作用可以从分子水平上了解胃癌发生的本质 进而揭示胃癌发生发展的分子机制 同源异型基因 ( 是一种 ( B 型锌指蛋白转录因子 位于人类染色体 包括 (+ 和 ( 两种亚型 含有 个外显子 研究显示 ( 在急性白血病中异常表达 发挥癌基因作 用 * 此外 ( 在多种实体肿瘤中 如睾丸生 殖细胞肿瘤 乳腺癌 肝癌等 也呈异常表达 我们研究发现 ( 基因在胃癌组织中表达显著升高 且在胃癌细胞株中呈不同程度的表达 本研究将 ( 基因成功转染至低表达 ( 的人胃癌 B=( 细胞株 获得了稳定高效表达 ( 的 B=( 细胞 为进一步研究 ( 在胃癌发生发展中的相关作用及机制奠定了一定的基础 ( 材料与方法 仪器和试剂脂质体 转染试剂盒 美国 3 " # 基金项目 国家自然科学基金资助项目 44 教育部博士点基金资助项目 江苏省自然科学基金资助项目 A4 江苏省科技创新与成果转化专项基金资助项目 8** 江苏省博士研究生创新基金资助项目 (8 作者简介 张玲 4 女 硕士研究生 许文荣 通讯作者 教授 博士生导师 - F #'

2 第 期 张玲 等 外源性 ( 基因在胃癌 B=( 细胞株中的表达及鉴定 公司 B=( 胃癌细胞株 中国科学院上海细胞库 胎牛血清 高糖 & & 美国 = 公司 胰蛋白酶 美国 /- 公司 (& # % ( 及 ( & # % 质粒 美国 5 =# # 公司 抗生素 = 美国 +- # 公司 反转录试剂盒 美国 # -# 公司 /+88 抗体 美国 + - 公司 =+ B 抗体 上海康成生物公司 B 化学发光底物 美国 & # 公司 质粒提取试剂盒 美国 + %# 公司 荧光定量 ( 试剂盒 杭州博日科技有限公司 (4 荧光定量 ( 仪 美国 ' 公司 二氧化碳培养箱 / # 公司 超净工作台 苏州仪器设备厂 ( 仪 美国 + #' %#- 公司 抗生素 = 筛选质量浓度的确定将处于对数生长期的 B=( 细胞用胰蛋白酶消化 吹打成细胞悬液后计数 按照每孔 个细胞接种于 孔板 加入含有不同质量浓度 = 的完全细胞培养液 梯度为 * 4-18 各做 个复孔 每天观察 根据培养基的颜色和细胞生长情况 每 天更换 次筛选培养基 培养约 ' 后可见各组均有细胞死亡 培养 ' 后可见 -18= 及更高质量浓度组细胞均死亡 而其他组虽也有细胞死亡但未完全死亡 因此 确定 = 筛选质量浓度为 -18 细胞培养及转染将 B=( 细胞株置于含 9 胎牛血清的高糖 & & 中 在 C *9 (5 饱和湿度的细胞培养箱中培养 期间 于显微镜下观察细胞生长状况 转染前. 接种细胞至 孔板 每孔 * 个细胞 转染时细胞融合度达到 9 > 9 转染按照脂质体 说明书操作 将 (& # % ( 及 (& # % 质粒转染至 B=( 细胞中 继续培养. 后换液 = 筛选 转染的细胞培养. 后加入含 -18= 的筛选培养基继续培养 将同步培养的未经转染的 B=( 细胞作为阴性对照 * 稳定转染细胞的单克隆化 加压筛选后 每 天更换 次培养液 培养 周后 可见阳性细胞在培养孔中分散生长 为混合克隆 随后按照有限稀释法进行单克隆化 预先对 4 孔板除第 排之外的所有孔加入 8 培养液 接着将混合克隆稀释至 18 按 81 孔接种于 4 孔板的第 排 从中吸取 8 细胞液接种于第 排 混匀后 从第 排中吸取 8 接种于第 排 直到第 排 最后 排均丢弃 8 细胞液 待细胞贴壁生长后 倒置显微镜下观察 标志只含有 个细胞的培养孔 每天记录细胞生长情况 约 * ' 后 挑选单克隆阳性细胞接种于 孔培养板 待细胞 9 > 9 融合时 扩大培养并接种于 孔板 分别标志为 B=( ( 细胞 B=( 空载体细胞 稳定转染的细胞可在 -18= 工作液条件下反复传代 ( 检测 ( 转录水平的表达 法提取细胞总 + 溶解于 * 8 ( 水 分光光度计测定 + 浓度 用反转录试剂盒以 5 ' 为引物 合成 + ( 体系 缓冲液 日本 A 公司 * 8 * -- 18' 日本 A 公司 * 8-18 的上下游引物各 * 8 *!18 的 酶 日本 A 公司 8 + 模板 8 加水定容至 * 8 引物设计采用 -# 软件 并经基因库比对进行同源检索后合成 上海生物工程技术服务有限公司 见表 表 ( 基因引物序列 * 8 + 基因名称引物序列 * 扩增长度 1 退火温度 1C ( 肌动蛋白 上游 ++= (=+(+ = === =+((+++( (( 下游 (( ( +=+( + =+( = == +(( 上游 (+(=+++( +(( (++( (( 下游 (+ +( (( =( =( =+ ( * * ( 和 肌动蛋白标准质粒制备及 ( 采用 ( 扩增 ( 和 肌动蛋白基因 胶回收纯化 ( 产物 将胶回收产物连接到 载体上 转化 B* 感受态大肠埃希菌 制备 > 4 拷贝 18 的 ( 基因和 肌动蛋白基因标准品 按照试剂盒操作说明进行 ( 检测 B=( 细胞 株中 ( 的表达量 ( - + 相对表达水平 ( + 拷贝数 1 肌动蛋白 + 拷贝数 蛋白质印迹检测 /+88 蛋白水平的表达收集细胞 加入蛋白裂解液 含蛋白酶抑制剂 置于冰上 每隔 - 剧烈震荡 次 共计 次 C 1- 离心 - 取上清

3 ''''''''''''江苏大学学报! 医学版" '''''''''''''''''第!" 卷 "!! LC法测定蛋白浓 度 # 再 加 入 B U上 样 缓 冲 液 煮 N+ 0 2 EB= 软件进行统计学分析#多组间比较采用单 # 离 心 后 Y& g 冻 存 备 用 %! W GJGD 沸 B E0 6 6检验# 因素方差分析#各组间两两比较采用 J*5 NCa电泳 #"B EC! F 转膜 # 含 B W 脱脂牛奶的 以 n= B 为差异有统计学意义?LG?室温封闭 % F 抗体孵育参照抗体说明书 # 按一 定 的 比 例 稀 释 一 抗! GCVV# # % hm % acnd Jf#% h% " ## g 摇 床 过 夜 # 辣 根 过 氧 化 物 酶 标记的相应 二 抗 进 行 免 疫 反 应 使 用 fon化 学 A结果 肌动蛋白和 %'"D # 标准质粒的构建 # 基因标准品#"D 制备了 "D 肌动蛋白基因和. D N+. Z 5 +软 件 对 条 带 发光底物显影 # 并 用 a5 # 基因的标准曲线及熔解曲线 肌动蛋白基因和 进行灰度扫描分析?8 由 _O?D 绘制# 扩增效 NO附带软件 Ad %= R'数据处理及统计 率分别为 RM=BW 和 RR=W# 相关系数分别为%= 所有数据均以均数 m标准差表示#用 a+ FN9 和 = RR&#见图 % 3 4 的标准曲线及熔解曲线 图?"G 肌动蛋白基因和 3 1?29 % *#+*& +( '& 0 *#+. %( '& 0 "-"G *( % #*#+ 3 4!'细胞形态学变化 # 表达载体的 fa!& 细胞的 # 表达 比#转染 显 微 镜 下 观 察 并 比 较 fa!&d # 细胞和 水平明显升高! 图 "" _O?D NO结果与 NO结果 空载体细胞#未发现两者存在明显细胞形态 fa!&d 一致! 图 #" 显示#fa!&D # 细胞株中 # 表达 学差异#如图! 所示 水平显著高于未转染组! Jl!"= %B#n= %" 和 %% #l 转染空 载 体 组 细 胞! Jl!"=%# n= %" 而未转染组与转染空载体组 "BX= B#n= B% "B#t= B" 比较#差异无统计学意义! Jl= 3 4 稳定表达的 SY!AO 细胞株镜下形态% \?RR& 图 A 3 1 A29."& C9" "1= "- 3 4G "0 & NC& #1 SY!AO ( # "'各组细胞中 # EO>C的表达 NO结果显示#与未转染组及转染空载体组相 3 4 表达 图 FI!检测稳定细胞株中 3 1 FI!*#* = "- 3 4 NC& "# #SY!AOG 3 4( #'GCVV# 蛋白的表达 蛋 白 质 印 迹 结 果 表 明# fa!&d # 细胞的 GCVV# 蛋白水平明显高于未转染组! Jl!R= B&#n

4 第 期 张玲 等 外源性 ( 基因在胃癌 B=( 细胞株中的表达及鉴定 和 B=( 空载体组 4 * 而未转染组和转染空载体组比较 差异无统计学意义 * J * 见图 * 未转染组 B=( 空载体组 B=( ( 图 "( 荧光定量 1 检测稳定细胞株中! %" 表达! "(8 /1! %" + 5 /! %" 未转染组 B=( 空载体 B=( ( 图 ( 蛋白质印迹检测稳定细胞株中 *#66" 表达! (3 *#66" + +! %"/ + 5.( 讨论 胃癌是一种分子疾病 其中涉及. % '.+ 等癌基因和 * * 等抑癌基因的改变 这些基因表达的改变影响着胃癌的生物学行为和预后发 4 展 随着分子生物学的发展 胃癌的基因治疗 越来越受到关注 8 等用靶向 9( + 作用于胃癌 =( 细胞后 促进了细胞的凋亡并增 强了细胞的放射敏感性. 等研究发现 抑制胃癌 &A * 细胞中 ( 基因的表达后 细胞增殖和迁移能力降低 近几年的研究表明 ( 与肿瘤的关系非常密 切 ( 等发现 ( 是一种新的诊断睾丸生殖细 胞肿瘤敏感和相对特异的标志物 A %. 等研 究发现 ( 在乳腺癌早期过表达 ( 经 + 作用后 乳腺癌 &( 细胞株的增殖受到完全抑制 细 胞周期阻滞于 = 期 5< 等发现 ( 在肝癌中高表达 且促进肝癌细胞生长 关于 ( 在胃癌 中的研究较少!.< 等发现 ( 是针对产生甲胎蛋白的胃癌的一种新型和敏感的指标 本研究结果显示 稳定转染 B=( ( 细胞株中的 ( 基因在 - + 和蛋白水平均明显高于未转染组及转染空载体组 且细胞生长形态及状态未受明显影响 成功获得了稳定表达 ( 的 B=( 细胞 有报道指出 /+88 15( 1 的转录网络对于维持胚胎干细胞的 干性 至关重要 且在这个调节网络中 /+88 作为一个核心因子起着主要作用 * /+88 亚型能活化 5( 5( 同样也活化 /+88 本课题组之前的研究表明 5( 在人胃癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织 且与胃癌的分化程度有关 因此 我们推测 /+88 很可能也在胃癌中扮演着重要的角色 对胃癌组织中 ( 基因进行检测并分析其与临床病理因素的相关性 使本身高表达或低表达 ( 的胃癌细胞株中 ( 的表达降低或升高 并研究其对细胞生物学特性的影响 将有助于进一步了解 ( 在胃癌发生发展中的作用 综上所述 本实验建立了稳定高效表达 ( 基因的 B=( 细胞 在此基础上 可深入探讨 ( 增高在体外对胃癌细胞生物学特性的影响以及体内肿瘤生长的作用 同时研究其在胃癌发生发展中的具体作用机制 如信号通路 下游靶基因的定位等 参考文献 # +& ##< &. # = # 3- " -# # "# %# = ( # 4 ( # A # +3 '#- % # 0 ' = # # * A.. # B#. & /. # 8 # 5<. % ' -# #' %/+88 - B -& =# # 44 4 &? ( 0? # /+88 "# # # "# %# # #'. - #-%# ' # <#- +&8 ' ' # +&8 # - # ' * * ( 0 A &? # # # # #.# "# # # /+88 %-.- - # -%# - ' # %-. # <#-

5 江苏大学学报 医学版 第 卷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收稿日期 编辑 刘星星 上接第 4 页 4 罗丹 谢曙光 缺血修饰白蛋白 肌红蛋白和肌钙蛋白联合检测诊断早期急性心肌梗死 江西医学检验 44 + '#& -#(8 < + - ' % # # % % ' -# + ( 8 / ** /. &A % = # ( # # 3.#- &' #' + - #.#- - <# -% '. #-.## %' # % % ' -# -# &#' 4 = '3 % ( " # (-.#- -' #' - #"# # '# # # % # "# # #. "#. % # +- ( ' 4 4 丁士芳 张运 张梅 等 斑块稳定性与炎症反应在急性冠状动脉综合症中作用的研究 中华心血管病杂志 * * + +& (. 3 ##' '.# " # # # # '.#-< #((8 # # #.# # ( * *4 *0 # &. /.#< #? # ((8 1/ /5 # # -- # #'.#-< # ' "# # # # # # #'.# # # + # #. - * ** 收稿日期 编辑 何承志

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