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婚怀
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1 第 40 卷 0 年月分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究 Chinese Journal of Analytical Chemistry 第期 ~ DOI:0.374/SP.J LTQ-Orbitrap 组合式高分辨质谱法快速筛查毛发中 7 种毒品及代谢物叶海英郑水庆梁晨汪蓉张玉荣张凌怡张维冰张润生 * ( 上海市公安局物证鉴定中心, 上海市现场物证重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地, 上海 00083) ( 华东理工大学上海市功能性材料化学重点实验室, 上海 0037) 摘要采用超高压液相色谱 - 二维线性离子阱结合静电场轨道阱组合式高分辨质谱联用技术 (Accela U-HPLC/LTQ Orbitrap XL), 建立了人毛发中吗啡 O 6 - 单乙酰吗啡可待因乙酰可待因氯胺酮去甲氯胺酮和美沙酮毒品及代谢物快速筛查方法取毛发样品经表层清洗后冷冻研磨粉碎, 置于硼酸盐缓冲液 (ph 9.) 中超声 90 min, 离心取上清液, 用 Oasis HLB 柱固相萃取制备通过静电场轨道阱全扫描得到毒品及其代谢物的精确相对分子质量, 同时进行 7 种毒品及其代谢物的快速筛查高分辨率质谱可有效去除毛发基质干扰, 毒品及其代谢物筛查检出限在 0.00~0.0 ng/mg, 在 0.05~ 50 ng/mg 范围内存在良好线性关系 (r> ); 本方法平均加标回收率为 76.% ~09.6% ; 日内及日间精密度 4.9% 本方法灵敏度高, 样品制备简便, 适用于常见毒品的快速筛查关键词 LTQ-Orbitrap 组合式高分辨质谱 ; 阿片类毒品 ; 氯胺酮 ; 美沙酮 ; 固相萃取 ; 超高压液相色谱 ; 毛发引言毒品犯罪危害全球的社会安定和经济发展, 已成为当今世界最严重的社会问题之一为了有效遏制各类毒品犯罪, 研究生物样品中毒品及代谢物准确快速灵敏有效的快速筛查方法是非常重要的最常用的生物样品是血液尿液和唾液, 通常以尿液为最佳检材, 但中毒或死亡者以血液和尿液为最合适检材对于某些毒品滥用者需要判断是否存在吸毒史, 或者无法取到血液尿液或唾液样品情况下, 就难以解决毒品滥用问题鉴于毒品进入生物机体后由于体内血液循环的作用, 毛发中可以积蓄毒品及其代谢物组分的特点, 且毛发样品稳定, 易保存 ( 只需置常温下贮存 ), 不易污染, 不能人为改变或控制样品及其结果 [], 毛发已经成为解决毒品滥用问题的有效样品近些年来, 分析仪器的飞速发展使毛发中毒物的检测成为可能 [~ 4], 甚至能够对单次给药后的痕量毛发样品进行检测 [5] 对于生物样品中毒品及其代谢物的筛查, 常用气相色谱 - 质谱联用法 (GC/MS) [6~ 8] 液相色谱 - 质谱联用法 (HPLC-MS/MS) [9,0] 和毛细管电泳法 (CE) [,] 等特别是液相色谱 - 质谱联用技术以其分析专一性强和灵敏度高的特点在毛发分析中发挥优势 [3] 但是由于毛发中其含量相对低微, 需要采用具有更高灵敏度和抗毛发基质干扰强的准确和先进的快速筛查方法高分辨率的飞行时间质谱仪因为质量分辨率高, 可以获得化合物的精确分子量和可能的化学分子式, 尤其适用于痕量成分在复杂背景中的筛选和确证, 而受到关注 LTQ-Orbitrap 组合式高分辨质谱仪是一种杂交型质谱仪, 前面是二维线性离子阱质谱仪 (LTQ), 后面是静电场轨道阱傅里叶变换飞行时间回旋共振 (Orbitrap) 高分辨率质谱仪, 兼有离子阱多级全扫描和高分辨质谱平行检测的能力, 可为同类危害因子的非目标化合物甚至未知物的分析提供全面的数据 LTQ-Orbitrap 组合式高分辨质谱仪通过离子的旋转振荡产生的镜像电流, 经微分放大后由 FT 变换器测定各离子的振荡频率, 最后计算出分子离子的质核比 (m/z) 这种通过频率测量质核比的方式, 可以得到超高的分辨率, 已经在农药残留筛查和食品包装材料等领域有应用报道 [4,5] 收稿 ; 接受本文系公安部应用创新计划 (No. 009YYCXSHSJ033) 资助项目 * zhangrs@ sh63.net

2 分析化学第 40 卷本研究采用 LTQ-Orbitrap 组合式高分辨质谱仪建立毛发中 7 种毒品及代谢物的快速筛查方法, 并采用相应的毒品及代谢物的氘代化合物作内标物, 获得良好的线性关系和较低的检出限, 方法灵敏可靠, 毛发样品制备简便, 已成功用于人毛发实际样品中毒品及代谢物的快速筛查实验部分. 仪器与试剂 Accela U-HPLC 液相色谱仪和 Thermo Scientific LTQ-Orbitrap XL 组合型高分辨质谱仪 ( 美国 Theṟ mofisher 公司 ) 系统 ;6770 型冷冻研磨机 ( 美国 SPEX 公司 );MSA 型电子天平 ( 德国 Sartorius 公司 ); SK50LHC 型超声仪 ( 上海科导超声仪器有限公司 );G-560E 旋涡混合器 ( 美国 Scientific Industries 公司 ) 吗啡 O 6 - 单乙酰吗啡可待因乙酰可待因氯胺酮去甲氯胺酮和美沙酮毒品及其代谢物标准物质和吗啡 -D 3 O 6 - 单乙酰吗啡 -D 6 可待因 -D 3 氯胺酮 -D 4 去甲氯胺酮 -D 4 和美沙酮 -D 3 内标物 ( 中国药品生物制品检定所和 Cerilliant 公司 ), 均配制成 0. g/l 的甲醇溶液, 使用时用甲醇稀释成 0.0 g/l 的工作液 Oasis HLB( ml/30 mg) 固相萃取柱 ( 美国 Waters 公司 ); 甲醇乙腈 ( 色谱纯, 德国 Merck 公司 ); 甲酸甲酸铵 ( 色谱纯, 德国 CNW Technologies GmbH 公司 ); 十二烷基磺酸钠丙酮 ( 分析纯, 上海凌峰化学试剂有限公司 ); 水为去离子水 ( 自制 ) 某品牌洗洁精 ( 市售 ); 液氮 ( 上海成功气体公司 ) 0.% 十二烷基磺酸钠和 0.% 洗洁精清洗液 : 用去离子水配制 ; 流动相 A( mmol/l 甲酸铵和 0.05% 甲酸溶液 ): 取 0.6 g 甲酸铵和 500 ml 甲酸, 溶于 000 ml 水中 ; 流动相 B( mmol/l 甲酸铵和 0.05% 甲酸 - 乙腈 ): 取 0.6 g 甲酸铵和 500 ml 甲酸, 溶于 40 ml 水中, 加乙腈 960 ml; 硼酸盐缓冲液 (ph 9.0~ 9.): 将 ph 9.8 的四硼酸钠缓冲剂按说明书配制空白毛发样品由无滥用药物记录的健康成年男性自愿提供 ; 实际毛发样品由毒品滥用强制戒毒者自愿提供 ; 质控毛发样品为已知浓度的人毛发美沙酮阳性对照品 DHF /0(50 mg, 德国 LGC 公司 ). 样品前处理取毛发样品, 依次用 0.% 十二烷基磺酸钠 0.% 洗洁精去离子水和丙酮洗涤, 晾干后剪成约 mm 长的毛发段, 用冷冻研磨机磨成粉末准确称取磨碎的毛发样品 0 mg 移入 0 ml 玻璃具塞试管中, 加入 ml 硼酸盐缓冲液 (ph 9.), 室温下超声 90 min, 取出后以 3500 r/min 离心 3 min 依次用 ml 甲醇, ml 去离子水活化 Oasis HLB 柱, 然后取 ml 离心后的上清液上柱, 用 ml 含 5% 甲醇的水淋洗柱子, 最后用 ml 甲醇洗脱, 洗脱液在 60 水浴中空气流下吹干, 残渣用 00 ml 初始流动相溶解, 转移至自动进样小瓶中备检.3 色谱质谱条件 Hypersil Gold C 8 色谱柱 (50 mm. mm.9 mm); 流动相 A: mmol/l 甲酸铵和 0.05% 甲酸溶液 ; 流动相 B: mmol/l 甲酸铵和 0.05% 甲酸 - 乙腈 ; 进样量 :0 ml 梯度洗脱 :0~ 8 min,95% ~ 30% A; 8~0 min,30% ~0% A;0~3 min,0% ~95% A 质量分析器 :FT Orbitrap; 离子化方式 :ESI+; 喷雾电压 :4.0 kv; 管状透镜电压 :0 V; 鞘气压力 : Pa; 辅助气流量 :60 L/h; 质量范围 (m/z):50~500 静电场轨道阱的高分辨扫描( 分辨率 R =30000) 归一化能量:35% 采用平行模式扫描: 静电场轨道阱的高分辨扫描 (R=30000); 再将其中最强离子强度的二级碎片离子的线性离子阱扫描.4 实验方法吸取 0 ml 制备好的各毛发样品溶液, 按照上述仪器条件下进行测定, 记录总离子流色谱图和各标准品保留时间质谱图和精确分子量通过离子阱的二级质谱图对化合物进行进一步确认, 通过采用峰面积内标法对各毒品及其代谢物组分进行定量计算 3 结果与讨论 3. 色谱条件和质谱条件的优化针对分析目标物的不同特性, 进行了色谱质谱分析条件的优化在选定的仪器分析条件下, 吗啡

3 第期叶海英等 :LTQ-Orbitrap 组合式高分辨质谱法快速筛查毛发中 7 种毒品及代谢物可待因 O 6 - 单乙酰吗啡去甲氯胺酮氯胺酮乙酰可待因和美沙酮 7 种已知毒品组分标准品的选择离子色谱图能够很好地基线分离, 仪器信噪比高 ( 图 ), 其相应的 6 种已知毒品组分氘代内标物的选择离子色谱图也可很好地基线分离 ( 图 ) 图 Fig. Orbitrap 精确质量数提取出的离子色谱图 Extraction ion chromatograms of analytes. 吗啡 (Morphine);. 可待因 (Codeine);3. O 6 - 单乙酰吗啡 (O 6 - monoacetylmorphine);4. 去甲氯胺酮 (Norketamine);5. 氯胺酮 (Ketamine);6. 乙酰可待因 (Acetylcodeine);7. 美沙酮 (Methadone) 考察空白毛发的干扰情况, 取空白毛发平行操图 Fig. Orbitrap 精确质量数提取出的离子色谱图 Extraction ion chromatograms of IS. 吗啡 -D 3 (Morphine-D 3 );. 可待因 -D 3 (Codeine-D 3 );3. O 6 - 单乙酰吗啡 -D 6 (O 6 -Monoacetylmorphine-D 6 );4. 去甲氯胺酮 -D 4 (Norketamine-D 4 );5. 氯胺酮 -D 4 (Ketamine-D 4 );6. 美沙酮 -D 3 (Methadone-D 3 ) 作, 在选定的仪器分析条件下, 其在已知 7 种毒品组分目标物及其相应的 6 种已知毒品组分氘代内标物的保留时间处无杂峰干扰 3. 精确质量数及保留时间在选定的仪器分析条件下, 吗啡可待因 O 6 - 单乙酰吗啡去甲氯胺酮氯胺酮乙酰可待因和美沙酮 7 种毒品标准品及其相应的 6 种氘代内标, 其相关的分析质量精度保留时间及二级碎片离子见表表检测药物定量分析的精确质量数及保留时间 Table Accurate molecular weights and retention times of analytes 药物分子式 Molecular formula [M+H] 理论分子量 Theoretical M W [M+H] 实测分子量 Detected M W 质量精度 Mass accuracy ( 0-6 ) 保留时间 Retention times (min) 二级碎片离子 Daughter ions(m/z) 氯胺酮 Ketamine C 3H 6ClNO 氯胺酮 -D 4 Ketamine-D 4 C 3H D 4ClNO O 6 - 单乙酰吗啡 O 6 -monoacetyḻ morphine C 9H NO O 6 - 单乙酰吗啡 -D 6 O 6 -monoacetyḻ C 9H 5D 6NO morphine-d 6 乙酰可待因 Acetylcodeine C 0H 3NO 美沙酮 Methadone C H 7NO 美沙酮 -D 3 Methadone-D 3 C H 4D 3NO 去甲氯胺酮 Norketamine C H 4ClNO 去甲氯胺酮 -D 4 Norketamine-D 4 C H 0D 4ClNO 吗啡 Morphine C 7H 9NO 吗啡 -D 3 Morphine-D 3 C 7H 6D 3NO 可待因 Codeine C 8H NO 可待因 -D 3 Codeine-D 3 C 8H 8D 3NO

4 分析化学第 40 卷 3.3 线性关系与定性筛查检出限取吗啡可待因 O 6 - 单乙酰吗啡去甲氯胺酮氯胺酮乙酰可待因和美沙酮及其氘代内标适量于具塞尖底试管中, 吹干后加入磨碎的空白毛发 0 mg, 配成系列浓度的样品 (0.05,0.,0.,0.5,,,5, 0,0 和 50 mg/g) 按照.3 节的方法处理并测定以仪器检测信噪比 S/N= 3 时计算各化合物的定性筛查检出限 ; 以目标化合物及其内标物的峰面积比 (y) 对样品浓度 (x) 作线性回归得回归方程, 结果见表, 表明 7 种毒品及代谢物的定量线性良好表检测药物的线性及检出限 Table LOD and linear formulation of analytes 药物线性方程 Linear Formulation 相关系数 Correlation coefficient (r) 线性范围 Linear range 检出限 LOD 吗啡 Morphine Y=0.850X ~ 可待因 Codeine Y=0.4X ~ O 6 - 单乙酰吗啡 O 6 -monoacetyḻ morphine Y=0.33X ~ 去甲氯胺酮 Norketamine Y=0.7746X ~ 氯胺酮 Ketamine Y=0.478X ~ 乙酰可待因 Acetylcodeine Y=0.3874X ~ 美沙酮 Methadone Y=0.859X ~ 加标实际样品测定的精密度和回收率按照 3.3 节方法配制高中低浓度的加标实际样品, 日内重复测定 6 次得日内精密度 ; 连续测定 3 d 得日间精密度另取相应浓度的标准品, 吹干后, 残渣用 00 ml 初始流动相溶解, 进样后以此为标准, 将两组峰面积进行比较, 计算得回收率 ( 见表 3) 表 3 加标实际样品测定的精密度与回收率 Table 3 Recoveries andintra-and inteṟ day in hair samples 药物名称吗啡 Morphine 可待因 Codeine O 6 - 单乙酰吗啡 O 6 -monoacetyḻ morphine 去甲氯胺酮 Norketamine 添加浓度 Added 回收率 Recovery (% ) 日内精密度 Intra-day (%,n=6) 日间精密度 Inteṟ day (%,n=3) 药物名称氯胺酮 Ketamine 乙酰可待因 Acetylcodeine 美沙酮 Methadone 添加浓度 Added 回收率 Recovery (% ) 日内精密度 Intra-day (%,n=6) 日间精密度 Inteṟ day (%,n=3) 实际应用用本方法对 3 例毒品滥用强制戒毒者的毛发进行了相关毒品组分的快速筛查检测, 结果在其实际毛发样品中均检出了吗啡 O 6 - 单乙酰吗啡可待因和乙酰可待因成分对已知浓度美沙酮质控毛发对照品进行含量检测, 其实测结果在该产品提供的确信范围 (Confidence Range,.6~3.38 mg/g) 之内, 实测值与标示值的相对偏差在 0% 以内 4 结论采用 LTQ-Orbitrap 高分辨组合质谱仪建立了人毛发中 7 种毒品及代谢物组分的快速定性筛查方法, 并同时考察了采用毒品氘代化合物进行相关毒品组分定量分析的线性范围及定量下限得到了毛

5 第期叶海英等 :LTQ-Orbitrap 组合式高分辨质谱法快速筛查毛发中 7 种毒品及代谢物发中 7 种毒品及代谢物和 6 个相应氘代内标物的精确质量数和部分化合物的多级碎片方法的检出限可达到 0.00~0.0 mg/g,7 种毒品及代谢物的线性良好在实验中, 还进行了离子阱的扫描, 通过离子阱和高分辨的二级质谱图对未知化合物进行了进一步确证 LTQ-Orbitrap 具有高分辨多级质谱性能, 功能灵活多样, 运行稳定可靠, 是一种可被用于常规分析检测的高端质谱仪器, 是复杂样品多残留物筛查化合物结构确证的最先进工具, 在法医学领域应用前景十分广阔 References SHEN Min,XIANGPing.FundamentalsandApplicationsof HairAnalysis.Beijing:SciencePress,00:3-9 沈敏, 向平. 毛发分析基础及应用. 北京 : 科学出版社,00:3-9 XIANGPing,SHEN Min,SHEN Bao-Hua,BOJun,LIU Xiao-Qian,JIANG Yan,ZHUO XiaṉYi.J.Forensic Med.,005,(4):90-93 向平, 沈敏, 沈保华, 卜俊, 刘晓茜, 姜宴, 卓先义. 法医学杂志,005,(4): JanickaM,KoṯWasikA,NamiesnikJ.TrendsAnalyticalChem.,00,9(3): JoakimJS,FredrikCK,KanarA,AnnaG,KolbjørnZ,OlavS,HenrikD.Toxicol.Leters,006,66:-8 5 SUN Qi-Ran,XIANGPing,YAN Hui,SHEN Min.ActaPharm.Sin.,008,43():7-3 孙其然, 向平, 严慧, 沈敏. 药学学报,008,43():7-3 6 MusshofF,LachenmeierK,WolersenH,LichtermannD,MadeaB.J.Anal.Toxicol,005,(9): SHEN Min,SHENBao-Hua.J.Chin.MasSpec.Society,00,():-6 沈敏, 沈保华. 质谱学报,00,():-6 8 GUO Fei,WANG YaṉYan,MENG PiṉJia,ZHANG Liang,YANG Yong,WANGJi-Fen.ChineseJ.Anal. Chem.,009,37(9):63-68 国菲, 王燕燕, 孟品佳, 张亮, 杨勇, 王继芬. 分析化学,009,37(9): KlysM,RojekS,KulikowskaJ,BozekE,ScislowskiM.J.Chromatogr.B,007,(854): ScheidweilerKB,HuestisM A.Anal.Chem.,004,(6): MENGLiang,WANGYaṉYan,MENGPiṉJia,WANGYaṉJi,ZHANGQiang.ChineseJ.Anal.Chem.,0, 39(7): 孟梁, 王燕燕, 孟品佳, 王彦吉, 张强. 分析化学,0,39(7): MENG Liang,ZANG Xiang-Ri,SHEN Gui-Juan,WANG Zheng-Qiao,WANG Li-Li,ZHU Ling.ChineseJ. Anal.Chem.,00,38(0): 孟梁, 臧祥日, 申贵隽, 王正巧, 王莉莉, 祝玲. 分析化学,00,38(0): ZHANG JiaṉXin, MENG PiṉJia,ZHANG Da-Ming,ZHANG WeṉFang, CHEN CuṉYi.J. Hygiene Research.,00,39(5): 张建新, 孟品佳, 张大明, 张文芳, 陈存仪. 卫生研究,00,39(5): WANG Yong-Wei,LIXiu-Qin,TIANJiṉGuo.EnvironmentalChem.,00,9():56-57 王勇为, 李秀琴, 田进国. 环境化学,00,9(): WANG Xiao-Bing,DING Li,ZHU Shao-Hua,DAIHua,XU Zhou,JIAO YaṉNa,WANG Li-Yue.Packaging Engineering.,0,(5):43-47 王晓兵, 丁利, 朱绍华, 戴华, 许宙, 焦艳娜, 王利岳. 包装工程,0,(5):43-47

6 分析化学第 40 卷 AnalysisofSeveninHumanHairbyHybridLinearIon Trap / Orbitrap MassSpectrometry YE Hai-Ying,ZHENGShui-Qing,LIANGChen,WANG Rong,ZhangYu-Rong, ZHANGLing-Yi,Zhang Wei-Bing,ZHANG RuṉSheng * (ShanghaiInstitiuteofForensicScience,ShanghaiKeyLaboratoryofCrimeSceneEvidence-StateKey LaboratoryBreedingBaseofCrimeSceneEvidence,00083Shanghai,China) (ShanghaiKeyLaboratoryofFunctionalMaterialsChemistry,andResearchCentreofAnalysisandTest, EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai0037,China) Abstract Anew methodwasdevelopedforthedeterminationofsevenilicitdrugsandmetabolitesin humanhairbyultrahighperformanceliquidchromatographtandemalineariontrap-orbitraphybrid instrumentathigh massresolution (UHPLC-LTQ-Orbitrap/MS).Afterbeingwashedandgrinded, thehairsamplesweresoakedinph 9.boratebuferwithultrasonicfor90 min.thenthesamples wereextractedbysolidphaseextraction (SPE).Highresolution massspectrometry wasappliedto reducematrixinterference.fulscanningofelectrostaticfieldorbitrapwasappliedforquantification ofdrugs.thelimitsofdetection(lod)ofsevenilicitdrugsandmetabolitesinhumanhairwere mg/g.themethodshowedafairlygoodlinearityovertherangeof mg/g(r>0.9975).the spikedrecoverieswerebetween76.%-09.6%,andthedeviationofintra-andinteṟ day waslessthan4.9%.the methodissimple,highsensitive,andsuitableforthedeterminationof ilicitdrugsinhumanhair. Keywords Lineariontrap/orbitrapmassspectrometry;Opiates;Ketamine;Methadone;Solidphase extraction;ultrahighperformanceliquidchromatography;hair (Received March0;accepted0July0)

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.