中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2010,30(9):31 35 利用同源重组构建蓝藻集胞藻 6803ndhO 基因突变株及其分子鉴定龙宗娟赵娇红魏兰珍王全喜马为民 ( 上海师范大学生命与环境科学学院上海 ) 摘要蓝藻 NADPH 脱氢酶 (NDH 1) 是一种

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韵黑彭
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2010,30(9):31 35 利用同源重组构建蓝藻集胞藻 6803ndhO 基因突变株及其分子鉴定龙宗娟赵娇红魏兰珍王全喜马为民 ( 上海师范大学生命与环境科学学院上海 ) 摘要蓝藻 NADPH 脱氢酶 (NDH 1) 是一种重要的光合膜蛋白复合体, 参与 CO 2 吸收围绕光系统 I 的循环电子传递和细胞呼吸迄今为止, 人们在蓝藻细胞中已鉴定出 15 种 NDH 1 复合体亚基 (NdhA NdhO) 然而, 人们对 NdhO 亚基的研究尚不够, 至今未见有反向遗传学等方面的研究在通过构建同源重组载体自然转化和多次继代筛选后, 对转化子进行了 PCR 和蛋白免疫印迹鉴定结果表明, 卡那霉素基因已成功地插入到 ndho 基因的保守区域, 并完全破坏了 ndho 基因的蛋白表达, 从而获得了 ndho 基因缺失的突变株, 为进一步研究 NdhO 亚基对 NDH 1 复合体的稳定性和生理功能等奠定了实验基础关键词 NDH 1 复合体 ndho 基因缺失突变株集胞藻 6803 中图分类号 Q784 蓝藻是一类能进行光合放氧的原核生物, 也是研究光合作用的模式生物之一一般认为, 蓝藻类囊体膜上存在光系统 I 细胞色素 b 6 f 光系统 I 和 ATP 合酶等 4 种光合膜蛋白复合体 19 年前, 人们又在蓝藻类囊体膜上发现了另一种光合膜蛋白复合体, 称为 NADPH 脱氢酶复合体 (NDH 1) [1 2] 迄今为止, 人们已经知道该复合体参与 CO 2 吸收 [3] 围绕光系统 I 的循环电子传递和细胞呼吸 [4 5] 后来的研究表明,NDH 1 复合体对蓝藻细胞的生理活动甚至生存起着至关重要的作用 [6] 因此说, 该复合体是一种重要的光合膜蛋白复合体然而, 由于 NDH 1 复合体的研究历史较短, 与其它 4 种光合膜蛋白复合体相比, 人们对该复合体的了解尚不够通过非变性凝胶电泳分离蓝藻集胞藻 6803 (Synechocystissp.strainPCC6803) 类囊体膜粗提取液和活性染色后, 鉴定出 2 种具有活性的 NDH 1 复合体 [7 9] 目前, 人们发现这 2 种活性复合体至少由 15 种 NDH 1 复合体亚基 (NdhA NdhO) [3,10 15] 组成由于收稿日期 : 修回日期 : 国家自然科学基金 ( ) 国家 973 计划 (2009CB118500) 教育部重点项目 (209045) 上海市教委科研创新重点项目 (08ZZ67) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :wma@shnu.edu.cn NdhO 是最后一个被鉴定出的 NDH 1 复合体亚基 [15], 因此人们对它的研究尚不够研究将尝试利用同源重组构建 ndho 基因的突变株, 并在分子水平上对该突变株进行鉴定, 从而获得 ndho 基因缺失的突变株, 为下一步利用反向遗传学对 NdhO 亚基进行深入研究奠定了实验基础 1 材料与方法 1.1 实验材料与培养条件集胞藻 6803 藻种由中国科学院植物生理生态研究所米华玲研究员提供野生型集胞藻 6803 和 ndho 基因缺失突变株用含 Tris HCl(5mmol/L,pH8.0) 的 BG 11 培养基 [16], 在 30 C 40μmolphotons/m 2 s 连续光照条件下进行培养液体培养时, 用含 2% CO 2 (v/v) 的混合气体进行通气培养, 并在突变株的培养基中加入 25μg/ml 卡那霉素 (Kam R ) 固体培养时, 培养基加入 1.5% 的琼脂粉, 在含 2% CO 2 (v/v) 的培养箱进行平板培养, 并在突变株的培养基中加入 5μg/mlKam R 大肠杆菌 (E.coli)DH5α 和质粒 puc19 为本室保存 1.2 试剂与仪器各种限制性内切酶 T4DNA 连接酶 PyrobestDNA

2 32 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.30No 聚合酶 DNA 凝胶回收试剂盒等购自 TaKaRa 公司 ; 各种抗生素购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司 PCR 引物合成由上海生工生物工程有限公司完成,DNA 测序由上海联合基因科技有限公司完成 1.3 集胞藻 6803 总 DNA 的提取集胞藻 6803 总 DNA 的抽提详见文献 [17] 简述如下 : 收集 50ml 对数生长期的细胞, 重悬于 400μlTE 缓冲液 (100 mmol/l Tris HCl, ph8.0, 10 mmol/l EDTA), 并加入 20μl10% SDS,450μl 酚 / 氯仿 (1 1), 以及 0.1g 的玻璃珠混均后, 通过震荡来裂解细胞提, 再用无水乙醇沉淀总 DNA, 溶于 50μlTE 缓冲液, -20 C 保存备用 1.4 同源重组载体的构建以 Cyanobase 发表的集胞藻 6803 sl1690(ndho) 基因序列 (htp://genome.kazusa.or.jp/cyanobase/) 和 Kam R 基因序列为模板, 分别设计引物 (ndho 1,2,3, 4;kan 1,2; 表 1), 扩增出相应的上游片段下游片段和抗性基因 Kam R 序列然后, 分别连入质粒 puc19, 完成同源重组载体的构建 ( 图 1) 同源载体构建的方法详见分子克隆 [18] 经离心后, 上清液用酚 / 氯仿 / 异戊醇 ( ) 进行抽表 1 构建同源重组载体 puc ΔndhO 和 PCR 检测突变株所用的引物序列 Table1 PrimersequencesfortheconstructionofthehomologousrecombinantvectorpUC ΔndhO, andtheidentificationoftheδndho mutantbypcr DNA 片段用途引物号酶切位点引物序列 (5 3 ) 上游片段 ndho 1 SalI GCUGTCGACUAGCGCTTATGGTCATAC ndho 2 BamHI CGUGGATCCUGCTATGGAAAAGGTAG 下游片段 ndho 3 KpnI GGUGGTACCUAAAGGAGAAGTGTTG ndho 4 SacI CUGAGCTCUTTAACCGTCGCTAAC 抗性基因 kan 1 BamHI CGUGGATCCUGGGGGGGGGGGGAAAG kan 2 KpnI GGUGGTACCUGGGGGGGGGGGGCG PCR 检测 ndho 5 / TTTGTCCGGCCATTAGCCC ndho 6 / AACCTGCCAGGACTGACAG 1.5 集胞藻 6803 的自然转化和转化子的筛选集胞藻 6803 的自然转化方法详见文献 [19], 并略有改动简述如下 : 在室温条件下, 用 5000 g 离心 5 分钟收集对数生长期的细胞 (A 730 =0.6~0.8), 然后用新鲜 BG 11 培养基重悬沉淀, 使细胞数目达个 / ml 在 100μl 的细胞中, 加入 2μl 的同源重组载体 puc ΔndhO, 并使质粒 DNA 的终浓度达到 50μg/ml 在细胞和 DNA 混合液孵育 6 小时后, 涂布于含有 5μg/ mlkam R 的 BG 11 平板上, 并置于 30 C 2% CO 2 (v/v) 和 40μmolphotons/m 2 s 的光照条件下进行转化子的诱导与此同时, 取 100μl 不加质粒的细胞作为负对照在 5~7 天后, 转化子开始在平板上出现然后, 挑取单藻落进行液体筛选, 为下一步的分子鉴定作前期准备 1.6 突变株的 PCR 鉴定分别以野生型集胞藻 6803 和 ndho 基因缺失突变株的基因组 DNA 为模板, 用 ndho 5 和 ndho 6 为引物进行 PCR 扩增 ( 表 1, 图 1) 通过扩增出的 DNA 片段来对突变株的分离情况进行分析 1.7 突变株的蛋白免疫印迹鉴定按照 Laemmli [20] 的方法, 在 15% 的聚丙烯酰胺凝胶上进行 SDS PAGE 蛋白免疫印迹采用 ECL 分析试剂盒 (Amersham Pharmacia), 按照厂家方法手册进行 NdhO 抗体由本实验室制备 2 结果 2.1 同源重组载体 puc ΔndhO 的构建同源重组载体 puc ΔndhO 的构建图谱见图 1 简述如下 :(1) 以野生型集胞藻 6803 的基因组 DNA 为模板,ndhO 1 和 ndho 2 为引物 ( 表 1) 进行 PCR 扩增, 获得约 1000bp 的 DNA 上游片段 (up), 其中包括 1~ 114bp 的 sl1690(ndho) 基因序列 DNA 上游片段经 SalI 和 BamH I 双酶切后, 连入 puc19 质粒中, 产生 puc up 质粒 (2) 以 ΔndhB(M55) [3] 的基因组 DNA 为模板,kan 1 和 kan 2 为引物进行 PCR 扩增 ( 表 1), 获得 Kam R 的基因序列 Kam R 的基因序列经 BamHI 和 KpnI 双酶切后, 连入质粒 puc up 中, 产生 puc up Kam R 质粒 (3) 以野生型集胞藻 6803 的基因组 DNA

2010,30(9) 龙宗娟等 : 利用同源重组构建蓝藻集胞藻 6803ndhO 基因突变株及其分子鉴定 33 为模板, 以 ndho 3 和 ndho 4 为引物进行 PCR 扩增 ( 表 1), 获得约 1000bp 的 DNA 下游片段 (down), 其中包括 115~219bp sl1690(ndho) 的基因序列 DNA 下游片段经 KpnI 和 SacI 双酶切后, 连入质粒

1 Schematicdescribingtheconstructionofthe homologousrecombinantvectorpuc ΔndhO 2.

2b) 这一结果表明, 抗性基因 Kam R 在转化子中得到了有效地表达因此, 同源重组载体 puc ΔndhO 中的同源序列已经与集胞藻 6803 细胞中基因组 DNA 发生了同源重组图 3 在含 25μg/ml 卡那霉素的 BG 11 液体中进行 ndho 基因缺失突变株的筛选 Fig.

3 突变株的分子鉴定以筛选到第 5 代的 2 号突变株基因组 DNA 为模板 ( 图 3), 用 ndho 5 和 ndho 6 为引物进行 PCR 扩增 ( 表 1) 结果显示, 在野生型集胞藻 6803 中的扩增产物为 1.2kb, 而在 NdhO 亚基缺失突变株中的 PCR 产物为 2.5kb( 多了 1.3kb 的 Kam R 基因片段 ) 并且在突变株的 PCR 产物中未出现 1.

3 2010,30(9) 龙宗娟等 : 利用同源重组构建蓝藻集胞藻 6803ndhO 基因突变株及其分子鉴定 33 为模板, 以 ndho 3 和 ndho 4 为引物进行 PCR 扩增 ( 表 1), 获得约 1000bp 的 DNA 下游片段 (down), 其中包括 115~219bp sl1690(ndho) 的基因序列 DNA 下游片段经 KpnI 和 SacI 双酶切后, 连入质粒 puc up Kam R, 产生 puc up Kam R down 质粒, 即完成了同源重组载体 puc ΔndhO 的构建该同源重组载体的测序结果正确 ( 数据未显示 ) 过多次继代筛选, 以达到完全分离出 ndho 基因缺失突变株的目的然后, 在核酸和蛋白水平上进行鉴定图 1 同源重组载体 puc ΔndhO 的构建图谱 Fig.1 Schematicdescribingtheconstructionofthe homologousrecombinantvectorpuc ΔndhO 2.2 集胞藻 6803 的自然转化和突变株的筛选将同源重组质粒 puc ΔndhO 与野生型集胞藻 6803 细胞混合液孵育 6 小时后, 涂布于含有 5μg/ml Kam R 的 BG 11 平板上与此同时, 不加同源重组质粒 puc ΔndhO 的野生型集胞藻 6803 细胞作为负对照 5~7 后, 在 BG 11 平板上出现了单藻落 ( 图 2a), 而负对照则未出现单藻落 ( 图 2b) 这一结果表明, 抗性基因 Kam R 在转化子中得到了有效地表达因此, 同源重组载体 puc ΔndhO 中的同源序列已经与集胞藻 6803 细胞中基因组 DNA 发生了同源重组图 3 在含 25μg/ml 卡那霉素的 BG 11 液体中进行 ndho 基因缺失突变株的筛选 Fig.3 ScreeningofthendhO geneinactivation mutantinbg 11liquidcontaining 25μg/mlkanamycin 1~5:Singletransformant 2.3 突变株的分子鉴定以筛选到第 5 代的 2 号突变株基因组 DNA 为模板 ( 图 3), 用 ndho 5 和 ndho 6 为引物进行 PCR 扩增 ( 表 1) 结果显示, 在野生型集胞藻 6803 中的扩增产物为 1.2kb, 而在 NdhO 亚基缺失突变株中的 PCR 产物为 2.5kb( 多了 1.3kb 的 Kam R 基因片段 ) 并且在突变株的 PCR 产物中未出现 1.2kb 的扩增片段 ( 图 4) 因此, 这一结果表明, 至少在 DNA 水平上, 已经完全分离出了 ndho 基因缺失的突变株图 2 在含 5μg/ml 卡那霉素的 BG 11 平板上进行转化子的诱导 Fig.2 InducementofthetransformantsonBG 11 platecontaining5μg/mlkanamycin (a)transformations(b)negativecontrol 分别挑取几个单藻落至 BG 11 液体培养基中, 并在 25μg/mlKam R 的条件下进行抗性筛选 ( 图 3) 通图 4 ndho 基因缺失突变株的 DNA 水平鉴定 Fig.4 IdentificationofthendhO gene inactivationmutantatdnalevel 1:Negativecontrol;2:WildtypeSynechocystissp.strain PCC6803;3:ΔndhO;4:200bpDNAladdermolecularmarker 利用 NdhO 亚基多克隆抗体, 分别与野生型集胞藻

4 34 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.30No 和 ndho 基因缺失突变株进行蛋白免疫印迹检测结果显示, 在相同上样量的情况下, 一条分子量约 8 kda 的带出现在野生型集胞藻 6803 中, 但未能在 ndho 基因缺失突变株中鉴别出 ( 图 5) 这一结果表明, Kam R 基因片段插入了 ndho 基因的保守区域, 破坏了 ndho 基因的蛋白表达综上所述, 研究已经成功地得到了 ndho 基因缺失的突变株 ΔndhO 图 5 ndho 基因缺失突变株的蛋白水平鉴定 Fig.5 IdentificationofthendhO geneinactivation mutantatproteinlevel 1:WildtypeSynechocystissp.strainPCC6803;2:ΔndhO 3 讨论通过构建同源双交换整合载体 puc ΔndhO 自然转化单藻落的继代筛选, 以期获得 NdhO 亚基表达缺失的突变株在第 5 代筛选后, 通过 DNA 和蛋白质水平的鉴定, 实验成功地获得了 ndho 基因缺失的突变株 ΔndhO 蓝藻 NDH 1 是一种重要的光合膜蛋白复合体, 参与 CO 2 吸收围绕光系统 I 的循环电子传递和细胞呼吸 [3 5] 迄今为止, 人们鉴定出 2 种具有活性的 NDH 1 复合体 [7 9] 并且,NdhO 亚基均包含在这 2 种 NDH 1 活性复合体因此, 在获得了 ΔndhO 后, 人们可以开展许多相关的研究工作例如,NdhO 亚基的缺失是否会影响 NDH 1 复合体的各种生理功能, 是否会影响这 2 种 NDH 1 活性复合体的稳定性等因此, 通过实验, 为下一步研究蓝藻 NdhO 亚基的许多相关的研究工作奠定了实验基础参考文献 [1]BergerS,ElersiekU,SteinmulerK.Cyanobacteriacontaina mitochondrial complex I homologous NADH dehydrogenase. FEBSLet,1991,286(1 2): [2]BergerS,ElersiekU,KinzeltD,etal.Immunopurificationofa subcomplexofthenad(p)h plastoquinone oxidoreductasefrom thecyanobacterium Synechocystissp. PCC6803. FEBS Let, 1993,326(1 3): [3]OgawaT.A genehomologoustothesubunit 2geneofNADH dehydrogenase is esentialto inorganic carbon transportof SynechocystisPCC6803.ProcNatlAcadSciUSA,1991,88 (10): [4]MiH,EndoT,SchreiberU,etal.Electrondonationfromcyclic andrespiratoryflowstothephotosyntheticintersystem chainis mediated by pyridine nucleotide dehydrogenase in the cyanobacterium SynechocystisPCC PlantCelPhysiol, 1992,33(8): [5]MiH,EndoT,OgawaT,etal.Thylakoidmembrane bound pyridine nucleotide dehydrogenase complex mediates cyclic electrontransportinthecyanobacteriasynechocystispcc6803. PlantCelPhysiol,1995,36(4): [6]PieuleL,GuedeneyG,Casier ChauvatC,etal.Thegene encodingthendhhsubunitoftype1nad(p)hdehydrogenaseis esentialtosurvivalofsynechocystispcc6803.febslet,2000, 487(2): [7]MaW,DengY,OgawaT,etal.ActiveNDH 1complexesfrom thecyanobacteriumsynechocystissp.strainpcc6803.plantcel Physiol,2006,47(10): [8]MaW,MiH.Efectofexogenousglucoseontheexpresionand activity of NADPH dehydrogenase complexes in the cyanobacteriumsynechocystissp.strainpcc6803.plantphysiol Biochem,2008,46(8 9): [9]MaW,DengY,MiH.Redoxofplastoquinonepoolregulatesthe expresionandactivityofnadphdehydrogenasesupercomplexin Synechocystissp.strainPCC6803.CurMicrobiol,2008,56 (2): [10]SteinmülerK,LeyAC,SteinmetzAA,etal.Characterization ofthendhc psbg ORF157/159operonofmaizeplastidDNAand ofthecyanobacterium Synechocystissp. PCC6803. MolGen Genet,1989,216(1): [11]SteinmülerK.NucleotidesequenceandexpresionofthendhH geneofthecyanobacterium Synechocystissp.PCC6803.Plant MolBiol,1992,18(1): [12]ElersiekU,SteinmulerK.Cloningandtranscriptionanalysisof thendh (A I G E) geneclusterand thendhd geneofthe cyanobacterium Synechocystissp. PCC6803. PlantMolBiol, 1992,20(6): [13] Schluchter W M, Zhao J, BryantD A. Isolation and characterizationofthendhfgeneofsynechococussp.strainpcc 7002 and initialcharacterization ofan interposon mutant. J Bacteriol,1993,175(11): [14] PrommeenateP, Lennon A M, MarkertC, etal. Subunit compositionofndh 1complexesofSynechocystissp.PCC6803: identificationoftwonewndhgeneproductswithnuclear encoded homologuesinthechloroplastndhcomplex.jbiolchem,2004, 279(27): [15]BatchikovaN,ZhangP,RuddS,etal.IdentificationofNdhL

5 2010,30(9) 龙宗娟等 : 利用同源重组构建蓝藻集胞藻 6803ndhO 基因突变株及其分子鉴定 35 and sl1690(ndho) inndh 1LandNDH 1M complexesof Synechocystissp.PCC6803.JBiolChem,2005,280(4): [16]AlenMM.Simpleconditionsforgrowthofunicelularblue green algaeonplates.jphycol,1968,4(1):1 4. [17] CaiY P,WolkC P.Useofaconditionalylethalgenein Anabaenasp.strainPCC7120toselectfordoublerecombinants andtoentrapinsertionsequences.jbacteriol,1990,172(6): [18] SambrookJ,FitschE F,ManiatisT.MolecularCloning:A LaboratoryManual.NY:ColdSpringHarborLaboratoryPres, [19]WiliamsJGK.Constructionofspecificmutationsinphotosystem Iphotosyntheticreactioncenterbygeneticengineeringmethodin Synechocystis6803.MethodsEnzymol,1988,167: [20]LaemmliUK.Cleavageofstructuralproteinsduringtheasembly oftheheadofbacteriophaget4.nature,1970,227(5269): ConstructionofthendhO GeneInactivationMutantofthe Cyanobacterium Synechocystissp.StrainPCC6803by UsingtheHomologousRecombinationStrategyandits MolecularIdentification LONGZong juan ZHAOJiao hong WEILan zhen WANGQuan xi MAWei min (ColegeofLifeandEnvironmentSciences,ShanghaiNormalUniversity,Shanghai ,China) Abstract CyanobacterialNADPH dehydrogenase(ndh 1)isanimportantphotosyntheticmembrane proteincomplex,andisesentialtoco 2 uptake,cyclicelectrontransportaroundphotosystem Iandcelular respiration.theenzymeacceptselectronsfrom NADPH andconsistsofatleast15subunits,i.e.,ndha to NdhO.TheNdhOisanewlyidentifiedsubunit,andlitleisknownregardingitsrolesincyanobacteria.Toobtain thendhogeneinactivationmutant,thehomologousrecombinationvector,puc ΔndhO,wasconstructed,and thenthisvectorwastransfered into wild type Synechocystissp. strain PCC 6803 by using the natural transformationmethod.further,afterseveralsubcultures,thetransformationswereexaminedbyusingthepcr andimmunobloting.theexperimentalresultsindicatedthatthekanamycincodingsequencehadsuccesfuly insertedintotheconservativeregionofndho gene,andcompletelyinhibitedtheexpresionofndho gene. Therefore,anndhOgeneinactivationmutant,ΔndhO,hassuccesfulybeenobtained,anditwilfurtherhelpus torevealtherolesofndhosubunitinthendh 1complexandintheunicelularcyanobacterium Synechocystis sp.strainpcc6803. Keywords NADPHdehydrogenasecomplex ΔndhO Synechocystissp.strainPCC6803

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽

中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2010,30(9):31 35 利用同源重组构建蓝藻集胞藻 6803ndhO 基因突变株及其分子鉴定 龙宗娟赵娇红魏兰珍王全喜马为民 ( 上海师范大学生命与环境科学学院上海 ) 摘要蓝藻 NADPH 脱氢酶 (NDH 1) 是一种

中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2010,30(9):31 35 利用同源重组构建蓝藻集胞藻 6803ndhO 基因突变株及其分子鉴定龙宗娟赵娇红魏兰珍王全喜马为民 ( 上海师范大学生命与环境科学学院上海 ) 摘要蓝藻 NADPH 脱氢酶 (NDH 1) 是一种