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1 年 月湖南师范大学自然科学学报 & & 第 卷第 期? -#( 1 () -( ' *"# " 1 #(# - ( #*5"-0*)/ '" & 6& 3&*0#& &&& 梅毒螺旋体多表位融合抗原的表达及免疫性研究 韩 雪 魏仙萍 黄亚辉 郑 义 孔令保 & 江汉大学生命科学学院 中国武汉 & 江西农业大学生物科学与工程学院病原微生物研究所 中国南昌 & 花都市人民医院检验科 中国花都 摘 要 设计梅毒螺旋体多表位融合抗原 该融合抗原含外膜蛋白,,,, 和, 重要抗原表位 人工合成该多表位融合抗原基因 转入大肠杆菌中 6$, 诱导表达 镍柱亲合层析纯化 & 利用多表位融合抗原检测人血清中梅毒特异性抗体 梅毒患者样本组与非患者样本组检测结果存在极其显著性差异 说明多表位融合抗原可被梅毒抗体特异性识别 有较好免疫反应性 可作为梅毒诊断试剂新抗原 & 利用多表位融合抗原免疫新西兰兔 兔血清中可持续检测到高滴度梅毒抗体 显示该多表位融合抗原有较强免疫原性 是梅毒基因工程疫苗候选蛋白 & 关键词 梅毒螺旋体 融合抗原 免疫反应性 免疫原性中图分类号 7 文献标识码. 文章编号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收稿日期 基金项目 国家自然科学基金资助项目 湖北省教育厅资助项目 江西省科学技术厅重点研发计划项目. 通信作者 (* *#4( >A ) (* &

2 第 期 韩 雪等 梅毒螺旋体多表位融合抗原的表达及免疫性研究 梅毒密螺旋体苍白亚种 ( )$ * ) +*1.1)6) +* ' 是梅毒 "/)!1 的病原体 主要通过性行为传播 会导致心血管及中枢神经系统损害 & 近十年来 我国梅毒发病率处于快速增长阶段 病例数从 年 万增加到 年 万 年增长率近 & 目前 抗生素疗法是梅毒治疗的成熟手段 但由于现有梅毒诊断方法不完善 费用高 导致很多患者错过了最佳治疗时期 & 此外 梅毒疫苗研究进展缓慢 鲜见报道 & 梅毒密螺旋体抗原主要集中在外膜蛋白 因此 外膜蛋白对梅毒特异性抗体的检测及疫苗研究都具有重要意义 &,,,, 及, 均为梅毒螺旋体外膜蛋白 其中, D(( 和, D(( 区域具有强抗原性 是很好的抗原表位 可高效特异性识别梅毒一期和二期患者血清中的梅毒抗体 并且其含有的抗原决定簇使之具有刺激机体产生特异性抗体的能力, D ((, D(( 和, D (( 被证实对梅毒晚期及潜伏期患者血清有良好检出效率 同时 其中含有的抗原表位使其成为潜在疫苗候选蛋白之一 & 本研究设计含有梅毒外膜蛋白, D ((, D((, D ((, D(( 和, D (( 片段的多表位融合抗原 在大肠杆菌中实现表达并纯化 & 以多表位融合抗原检测人血清中梅毒特异性抗体 结果显示 多表位融合抗原可被梅毒患者中梅毒抗体特异性识别 有较好免疫反应性 同时 多表位融合抗原免疫兔 次 兔血清中可检测到高滴度梅毒抗体 显示该多表位融合抗原有较强免疫原性 & 材料与方法 材料 && 人血清样本及实验动物 份梅毒阳性血清,$$. 及临床确诊阳性 份梅毒阴性血清,$$. 及临床确诊阴性 由花都市人民医院郑义博士提供 & 免疫接种动物为雄性新西兰兔 & && 实验试剂 异丙基 硫代半乳糖苷 6$, 镍柱,-*0 碱 丙烯酰胺等生物试剂购买于上海宇玫博生物科技有限公司 化学试剂购于国药集团 & 方法 && 基因合成及表达菌株构建 人工合成梅毒外膜蛋白编码基因 依次编码, D((, D((, D ((, D(( 和, D (( 抗原片段 & 所对应的基因以梅毒标准 * 株为模板 分别取, D, D, D, D, D 基因作为融合抗原基因成分 基因组成如图 所示 & 融合基因由上海宇枚博生物科技有限公司合成 & 图 梅毒多表位融合基因示意图 #.,"+*(4-( 1 ' )*" *) "1 0* # (#)*4"# 4"#" && 质粒及表达菌株构建 融合基因通过 C 端的 $ 6 与 C 端的 *6 内酶切位点与原核表达载体 $, 6' ( 连接 构建 $, 6' (,,,,, 多表位融合抗原重组质粒 & 重组质粒由上海宇枚博生物科技有限公司构建 & 重组质粒利用氯化钙法转入大肠杆菌 6 $ $1 中 构建多表位融合抗原表达工程菌株 & && 多表位融合抗原表达 多表位融合抗原表达工程菌株接种基本培养基 F 过夜活化后 ' 培养基 F 扩大培养 F 条件下 6$, 诱导表达 & && 多表位融合抗原纯化 菌体收集后 超声波破碎 - *# E 离心 *# 收集沉淀 得到包涵体 包涵体尿素重溶后进行镍柱亲合吸附 并利用 6. 溶液进行洗脱 & 洗脱组分 F 透析 换 次透析液 &

3 湖南师范大学自然科学学报 第 卷 && 免疫印迹 多表位融合抗原 ' ' $. 电泳后 电转移到 $ ; 膜上 '. 封闭 F 过夜 一抗为人血清 $ ' 缓冲液稀释 倍 F 孵育 二抗为羊抗人 64 F 孵育. 显色 & && 人血清抗体检测 多表位融合抗原包板 '. 封闭 F 过夜 以待测人血清为一抗 $ ' 缓冲液稀释 倍 F 孵育 二抗为羊抗人 64 F 孵育, 显色 酶标仪 # 处测量吸光值 & 每个血清样品平行 孔检测 & && 动物免疫实验 多表位融合抗原 4 重悬于 $ ' 缓冲液 等体积的佐剂乳化 第一针佐剂为弗式完全佐剂 第二 三针佐剂为弗式不完全佐剂 & 雄性新西兰兔分别在第 天注射多表位融合抗原一次 每周耳缘取血样一次 & 以多表位融合抗原包被酶标板 一抗为免疫兔血清 F 孵育 二抗为羊抗兔 64 F 静置, 显色 硫酸终止反应 酶标仪 # 测量吸光值 & && 数据处理 人血清每个样品平行 孔检测 取 次酶联免疫结果平均值进行数据分析 利用生物统计学分析软件 '$'' 选择配对, 检验 对梅毒患者和非梅毒患者血清学检验结果进行成对样本差异性分析 & 结果与分析 多表位融合抗原的表达及纯化从图 可知 F 条件下 6$, 诱导表达 后 多表位融合抗原在大肠杆菌中成功表达 超声波结果显示融合抗原包涵体形式存在 镍柱亲合层析后 多表位融合抗原在 6. 洗脱液成分中 & 从基因大小计算 该融合抗原相对分子质量大约为 从图 可知 表达纯化的多表位融合抗原分子量与预期大小相符合 因此 笔者得到了纯度较高的梅毒多表位融合抗原 & 多表位融合抗原的鉴定图 免疫印迹结果表明 一抗孵育梅毒抗体阳性血清的膜上出现特异性的带 而以梅毒抗体阴性血清为一抗孵育的膜无带出现 说明表达的多表位融合抗原可以被梅毒患者血清中的梅毒抗体特异性识别 & 蛋白质 (->"- 诱导前全菌 诱导后全菌 亲合纯化结果 包涵体样品图 多表位融合抗原免疫印迹结果图 梅毒多表位融合抗原的表达与纯化结果 #.,"8"0)"-# )-"0 ) 1)" ' )*" #.,"": -"0* # (#+ -*1* ()* # 1)" ' )*" *) "1 0* # (#)*4"# *) "1 0* # (#)*4"# 多表位融合抗原与人血清反应性分析以纯化的多表位融合抗原为抗原 酶联免疫法检测待测人血清中梅毒特异性抗体 & 其中 例梅毒抗体阳性血清样本来自,$$. 及临床确诊梅毒患者 例梅毒抗体阴性血清样本来自,$$. 结合临床确诊非梅毒患者 每个血样平行 孔检测 取平均值进行 '$'' 检测分析 结果如图 所示 梅毒患者血清的 值 &G& 非梅毒患者血清的 值 & G& 9 & & 数据经过 '$'' 软件分析 ' & 表明梅毒患者样本组与非梅毒患者样本组的血清检测结果存在极其显著性差异 多表位融合抗原血清学检测结果与,$$. 检测结果符合度为 & 3 多表位融合抗原免疫原性分析新西兰兔免疫后 每周取血 酶联免疫法检测兔血清抗体水平 & 从图 可知 第三周开始 免疫兔血清中可检测出特异性抗体 此后抗体滴度迅速增加 并在第十一周达到最高峰 随后抗体滴度开始缓慢下降 至检测周期 十四周 内抗体滴度依旧保持在一个较高水平 &

4 第 期 韩 雪等 梅毒螺旋体多表位融合抗原的表达及免疫性研究 讨论 目前以抗生素为主的梅毒治疗方法已非常成熟并且预后良好 因此 对梅毒的防控主要集中在梅毒患者的检测及疫苗研制上 & 梅毒螺旋体明胶凝集试验,$$. 是目前梅毒诊断的主要方法 其通过检测血清中存在的梅毒抗体来确定梅毒螺旋体的感染 由于作为抗原的梅毒螺旋体无法体外培养导致试剂价格昂贵 另外 实验人员需要丰富的经验 所以不适合在基层医院推广 & 梅毒外膜蛋白,,,,, 含有梅毒特异性抗原 这些抗原可识别梅毒患者血清中的梅毒特异性抗体 是近来梅毒诊断试剂研究的热门蛋白 & 本研究通过基因工程手段 利用大肠杆菌表达梅毒多表位融合抗原 包涵了, D((, D((, D ((, D(( 和, D (( 抗原片段 & 以多表位融合抗原为抗原 通过 <6'. 检测人血清样本 酶联免疫结果显示 梅毒患者血清的 值为 &G& 非梅毒患者血清的 值为 & G& 数据经过 '$'' 软件分析 ' & 表明梅毒患者样本组与非梅毒患者样本组的血清检测结果存在极其显著性差异 多表位融合抗原血清学检测结果与,$$. 检测结果符合度为 & 因此 笔者表达纯化的多表位融合抗原可作为梅毒诊断试剂的主要成分 & 图 3 梅毒多表位融合抗原与人血清反应性 #. 3," ' )*" *) "1 0* # (#)*4"# -"( )*5*)/ *) "# 0"- 图 4 梅毒多表位融合抗原免疫兔抗体结果 #. 4," "5" 0 1(#)*,$64 *#+ "/ ' )*" *) "1 0* # (#)*4"# *# -(*) 现阶段由于体外培养梅毒螺旋体 动物模型及梅毒蛋白功能研究存在困难 导致梅毒疫苗研发进展缓慢 & 研究显示 在梅毒螺旋体感染早期 巨噬细胞的吞噬和抗体的中和作用是机体清除病原体的主要方式 因此 如何有效刺激机体产生梅毒特异性抗体是梅毒疫苗研究的关键 据报道,,,,, 外膜蛋白含有梅毒重要抗原决定簇 也具备刺激机体产生梅毒特异性抗体的潜力 & 笔者表达的多表位融合抗原免疫家兔实验表明 从第四周起家兔血清中可以检测到抗体 最高滴度达到 并长时间维持在高的滴度水平 说明多表位融合抗原的抗原决定簇得到较好暴露和递呈 有效地刺激了机体产生梅毒特异性抗体 具有良好的免疫原性 & 本研究在大肠杆菌中成功表达了梅毒多表位融合抗原 该融合抗原可被梅毒患者血清抗体特异性识别 有良好的免疫反应性 蛋白免疫家兔后 可刺激家兔产生高水平特异性抗体 有一定免疫原性 & 因此 该梅毒多表位融合抗原可作为梅毒诊断试剂抗原和梅毒疫苗的候选蛋白 & 参考文献,6$$<,. < 7 $&'/ * *0)"0)*#4 )/ *#4 (#+ )-"() "#)1 (#" "-(1 -(# + +*0"(0"? & - *# 6#1" ) *0 & < < ' & +()" # 0/ * *0? &?. "+.0 *()* # & ? & 1" )*5"#"0 10/ * *0)-"() "#) 0*#4(*)- / *# (#+ -"#(

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