88 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No 方法 MSTN 成熟肽的原核表达与鉴定将含重组原核表达质粒的 pet 32a MSTN 转化到大肠杆菌 BL21 (DE3) 中过夜培养后按转接至新鲜培养基, 加入 0.1m

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采枝许
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2014,34(9):87 93 DOI: /j.cb 绵羊肌肉生长抑制素 MSTN 原核表达及其纳米抗体文库的构建与鉴定 1 李尤简 2 张国奇 2 郭吉星 1 陈新凯 1 豆晓霞 2 陈创夫 1 盛金良 (1 石河子大学动物科技学院 2 新疆地方与民族高发病教育部重点实验室石河子 ) 摘要克隆绵羊肌肉生长抑制素 (myostatin,mstn) 基因并在大肠杆菌中诱导表达, 纯化重组蛋白免疫健康的双峰驼 (Bactriancamel), 分离其外周血淋巴细胞提取总 RNA, 利用 RT PCR 扩增骆驼重链抗体 IgG2 IgG3 的可变区 (VHH) 基因片段, 将 VHH 片段与 pcantab5e 连接后电转入大肠杆菌 TG1 构建纳米抗体文库结果显示, 纳米抗体文库容量为 , 挑取部分克隆进行测序分析, 所获得的纳米抗体文库具有良好的多态性, 为进一步筛选绵羊 MSTN 的高特异性纳米抗体片段奠定了基础关键词绵羊肌肉生长抑制素纳米抗体噬菌体展示文库中图分类号 Q78 [1] 1997 年 McPheron 等发现了生长分化因子 8 (GDF 8),GDF 8 表达之后可以对骨骼肌肌肉的生长分化予以限制小鼠实验表明该基因去除后, 小鼠表现肌肉肥大, 所以称其为肌肉生长抑制素 (myostatin, MSTN) 基因十多年的时间里, 在人类医学和畜牧业生产中, 大批的科研工作者都对 MSTN 进行了大量的研究重链抗体是在骆驼体内发现一种特殊的抗体, 该抗体天然缺失轻链, 故称为重链抗体, 因其晶体结构呈椭圆形, 直径 2.5nm, 长约 4nm, 所以又被称为纳米抗体 [2] 纳米抗体具有分子量小稳定性强可溶性好易表达, 免疫原性低等特点, 目前已广泛用于基础研究医学诊断和检测抗体药物开发等领域鉴于纳米抗体其自身结构上的独特性, 以及作为多功能抗体的广泛前景, 本研究以抑制绵羊肌肉生长抑制素的功能为出发点, 通过目的 MSTN 蛋白免疫健康双峰驼, 以分离的外周淋巴细胞为实验材料, 利用噬菌体展示技术构建了多样性好的单域重链抗体文库, 为下一步筛选针对 MSTN 高效高特异性的纳米抗体收稿日期 : 修回日期 : 国际科技合作项目 (2013DFR30970), 兵团博士基金 (ZD2007JC02) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :ccf?xb@163.com,sjlshz@126.com 来阻断其分子作用通路, 以有效的促进动物肌肉的生长和发育的进一步研究奠定了基础本研究对于肌肉生长抑制素纳米抗体的研究将为畜牧业改良肉用类动物品质开辟一条新途径 1 材料与方法 1.1 材料菌株与质粒大肠杆菌 BL21(DE3) 及载体 pet 32a(+) 为作者实验室保存 ; 大肠杆菌 TG1 载体 pcantab 5E 和辅助噬菌体 M13K07 均购自北京森润生物技术有限公司实验动物健康成年骆驼 2 只, 购自新疆玛纳斯, 预先经过疾病检疫, 饲养于石河子大学动物科技学院动物实验站试剂 RNA 提取试剂盒购自北京康为世纪生物有限责任公司, 淋巴细胞分离液购自上海生工生物, RT PCR 试剂盒高保真 DNA 聚合酶限制性内切酶级 T4 连接酶均购自 TaKaRa 公司, 质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京天根生物有限责任公司,QuickLigationKit 购自 NewEnglandBiolabs 公司, 蛋白胨和酵母提取物购自英国 Oxoid 公司, 其它试剂均为国产分析纯

2 88 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No 方法 MSTN 成熟肽的原核表达与鉴定将含重组原核表达质粒的 pet 32a MSTN 转化到大肠杆菌 BL21 (DE3) 中过夜培养后按转接至新鲜培养基, 加入 0.1mmol/LIPTG 于 27 分别诱导 2,4,6,8h 后离心收集菌体, 按 1 40 的比例加入 Lysisbufer 重悬菌体, 液氮和 42 水浴反复冻融 3~4 次之后进行超声破碎细菌, 工作条件为 : 超声破碎 10s, 间歇 10s,90 次 / 周期, 重复 3 次, 直至菌液清亮为止 6000r/min 离心 10 min, 取上清和沉淀, 加入 l SDS PAGE 上样液,100 煮沸 10min, 经蛋白 SDS PAGE 电泳检测选择最佳诱导时间, 大量诱导表达目的蛋白, 用 AKTAxpres 智能多维纯化系统进行纯化透析浓缩并测定蛋白浓度及免疫原性骆驼免疫及淋巴细胞的分离将表达纯化后的 MSTN 蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化于双峰驼颈部背部和臀部三处进行皮下多点注射, 跟踪观察注射包块吸收情况, 以确认免疫正确初次免疫 21 天后加强免疫, 加强免疫 6 次后进行琼脂糖扩散试验检测血清中抗体效价, 根据检测结果继续加强免疫, 待确定产生抗体效价达到一定水平后采用真空采血管在双峰驼颈静脉处采血 10ml, 用淋巴细胞分离液密度梯度离心收集单核细胞总 RNA 的提取,VHH 基因的扩增和连接参照 RNAiso 试剂说明书提取总 RNA, 紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 的纯度及浓度以 oligo dt 反转录合成 cdna 第一链, 反应条件为 42,30 min,50,60min,70,15min 采用 PrimeSTAR 高保真 DNA 聚合酶, 经巢式 PCR 获得重链抗体的可变区编码基因第一轮 PCR 分别以引物 AlpVh LD 和 CH2 R 扩增 cdna, 反应条件为,98,10s,50,20s,72,1 min,20 个循环,98,30s,68,1min,40 个循环,72 延伸 10min [3] 第一轮 PCR 产物用 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳, 用康为世纪琼脂糖凝胶回收试剂盒回收 bp 的 DNA 条带, 根据浓度稀释 5 10 倍后作为第二轮 PCR 反应的模板, 引物设计参考文献 [4] 并稍作修改 :AlpVh SfiI 和 AlpVHHR1 NotI( 表 1), 用 AlpVh SfiI 和 AlpVHHR2 NotI 进行 PCR 扩增两种亚型重链抗体 VHH 基因片段, 反应条件为 :98,10s,50,20s, 72,40s,5 个循环,98,10s,70,40s,35 个循环, 72 延伸 10min 回收 DNA 片段, 测定浓度,-20 保存备用用限制性内切酶 SfiI 分别酶切 pcantab 5E 载体和 PCR 产物, 然后再加入限制性内切酶 NotI 继续酶切酶切完成后载体和目的片段用 1% 的琼脂糖凝胶检测, 回收 DNA 保存于噬菌体扩增和滴度测定按 M13k07 辅助噬菌体说明书操作进行将 -80 冻存的 TG1 菌种分别与 M9 和 LB A 琼脂平板上划线培养, 验证其为 AP 次日于 M9 琼脂平板上挑取单菌落接种于 5ml2 YT 培养基中,37 剧烈振荡至对数生长期 (OD 600 =0.4) 取 2 ml 上述菌液加 l00μlm13k07 保存液,37 温育 30 min, 加入 100ml2 YTK 培养基,37 培养过夜次日, 以 3500~4000r/min,4 离心 15min, 收集上清 ; 加入 1/5 体积 PEG/NaCl, 混匀, 冰上放置 lh,4 9000r/min 离心 40min, 弃上清 ; 加入 1mlpH7.4 的 PBS 重悬沉淀, 再以 9000r/min 离心弃去不溶物, 收集上清即为辅助噬菌体 M13KO7 扩增液,4 贮存备用通过 YT 上层琼脂检测扩增噬菌体滴度噬菌体单域抗体库的构建将目的片段和载体连接, 参考文献并作适当修改 [5] 连接产物经乙醇沉淀后, 取 2μl, 加入到 TG1 感受态细胞中, 轻轻混匀后静置 30min, 经电击转化后向电击杯中加入 800μl 无抗性 SOC 液体培养基, 轻轻吹打数次后吸到 1.5ml EP 管中,37,200r/min 培养 2h,2000r/min 离心 5 min, 重悬菌体均匀涂布在含有 Amp 抗性的 SOC 固体培养基上,37 培养箱中过夜培养, 挑取单菌落作进一步筛选和鉴定剩余菌落用细胞刮刀刮至 20ml 液体 SOC 培养基中继续摇床振荡培养 16h, 加入终浓度为 25% 甘油保菌,-80 保存备用同时设阳性和阴性对照文库质量评价取过夜培养的平板随机挑取 40 个单克隆进行分析 : 首先利用载体上的通用引物进行菌液 PCR 验证 ; 其次提取质粒进行酶切分析 ; 再次随机挑取 30 个克隆进行测序, 对测序结果进行比对分析辅助噬菌体救援及滴度测定取 100μl 甘油管保存的驼源 cdna 文库加入含有氨苄和 2% 葡萄糖的 100mlLB 培养基中,37 摇至 OD 600 为 0.6 后, 按感染复数 20 1 加入辅助噬菌体 ( 终浓度约为 10 9 Pfu/ml), 37 静置 30min 后震荡培养 1.5h 分 2 管,4,8000 r/min 离心 10min, 用含氨苄 0.5% 葡萄糖和卡那霉素的 100mlLB 培养基重悬沉淀 37 摇床过夜培养次

2014,34(9) 李尤简等 : 绵羊肌肉生长抑制素 MSTN 原核表达及其纳米抗体文库的构建与鉴定 89 日将过夜培养物分 3 管,4,8000r/min 离心 10min, 液体转移到第二管沉淀中, 依次重悬所有 5 管沉淀, 吸移取上清按 1 5 加入 PEG/NaCl,4 放置 1h 沉降噬菌到第六个 EP 管中, 加 200μlPEG /NaCl,4 放置 1h 体

3 2014,34(9) 李尤简等 : 绵羊肌肉生长抑制素 MSTN 原核表达及其纳米抗体文库的构建与鉴定 89 日将过夜培养物分 3 管,4,8000r/min 离心 10min, 液体转移到第二管沉淀中, 依次重悬所有 5 管沉淀, 吸移取上清按 1 5 加入 PEG/NaCl,4 放置 1h 沉降噬菌到第六个 EP 管中, 加 200μlPEG /NaCl,4 放置 1h 体 4,8000r/min 离心 15min, 完全弃去上清, 用 4 4,12000r/min,10min 离心 6 个管中的 2 个, 单独收 ml 的 1 PBS 重悬噬菌体, 反复洗涤管壁几次, 上下吹集上清到 15ml 离心管中把新的两管液体加到第一打几分钟, 将噬菌体悬液分装到 5 个 1.5ml 的 EP 管次的两管中离心, 将上清移到上面 15ml 的离心管中, 中, 每管 800μl, 再用 1mlPBS 冲洗离心管壁, 以尽可最后两管重复前面步骤最后用 500μlPBS 分别稀释能完整收集噬菌体, 然后把这 1ml 悬液均分到上面的 5 两管沉淀, 最大转速离心 5min, 取上清即为收集的噬个 EP 管中, 向每个 EP 管中添加 200μlPEG /NaCl, 菌体文库取收集的噬菌体文库 10 9 陪被稀释液 r/min,4, 离心 10min, 去除细菌碎片收集上 μl 侵染宿主菌 TG1 后, 取感染液 100μl 涂于 2 YTGA 清, 分装 5 个 EP 管中, 然后每个管添加 PEG /NaCl(1 板上过夜培养并计数另按相同步骤分别制作仅含噬 5 比例 ) 将 1mlPBS 添加到第 1 管重悬沉淀, 重悬的菌体及仅含宿主菌的阴性对照培养板表 1 文库构建所用的引物 Table1 Primersusedforlibraryconstruction Primer AIPVh LD CH2 R AlpVh SfiI AlpVHHR1 AlpVHHR2 Primersequences(5 3 ) 5 CTTGGTGGTCCTGGCTGC 3 5 GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC 3 5 CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTCNGGNGG 3 5 CATGCCATGACTCGCGCGGCCGCCGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG 3 5 CATGCCATGACTCGCGCGGCCGCCTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG 3 2 结果 2.1 MSTN 蛋白的诱导表达重组蛋白在 6h 时表达量达到最高, 主要以包涵体形式表达 SDS PAGE 电泳结果显示获得的融合蛋白 pet32a MSTN 分子量大约为 32kDa 的片段 ( 图 1) 图 1 MSTN 重组蛋白不同时间诱导表达 Fig.1 MSTNrecombinantfusionprotain inducedatdiferenttime M:Lowmolecularweightproteinmarker;1:InducedcontrolofpET 32a;2 5:pET 32a MSTN inducedbyiptg for2,4,6,8h, respectively 2.2 MSTN 蛋白的纯化和 Western-bolt 检测诱导 6h 收集菌体, 充分溶于于 8M 尿素中,0.45 μm 滤膜过滤后离心去杂质, 上机纯化后获得大量 MSTN 成熟肽蛋白 ( 图 2a) 重组融合蛋白 MSTN 与鼠抗 6 His 单克隆抗体反应后, 在 32kDa 左右有一条特异的条带, 说明重组目的蛋白具有免疫原活性 ( 图 2b) 2.3 抗体效价的检测双峰驼在第六次免疫后一周开始采血分离抗血清, 每次免疫后琼脂糖扩散实验检测抗体血清效价, 当免疫十次后, 通过琼脂糖扩散试验显示, 其外周血清中抗体血清效价达 1 64 ( 图 3) 并通过 ELISA 检测羊抗驼 IgG 抗体水平, 结果显示终免后, 羊抗驼 IgG 抗血清滴度可达 (Cut of 值为 2.1) ( 图 4) 2.4 RNA 的提取与分析经 NanoDrop 1000 核酸定量仪测定分析, 所提取的总 RNAOD 260 /OD 280 =1.96, 浓度为 953ng/μl, 表明所提取的 RNA 比较理想, 且没有明显的 DNA 和蛋白质的污染

90 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No.92014 图 2 重组蛋白的纯化及 Westernblot 分析 Fig.

MSTNinducedbyIPTGfor6h;3:Purifiedfusionprotein;4:Proteinconcentrate 图 3 琼脂糖扩散试验 Fig.

5 Agarosegelelectrophoresisof firstroundpcrproducts M:DNA markerdl2000;1:negativecontrol;2 3:Productsoffirst

4 90 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No 图 2 重组蛋白的纯化及 Westernblot 分析 Fig.2 AnalysisofpurificationexpresiveproductsbySDS PAGEandWesternblot (a)analysisofexpresiveproductsbysds PAGE (b)westernblot;m.lowmolecularweightproteinmarker;1:inducedcontrolofpet 32a; 2:pET 32a MSTNinducedbyIPTGfor6h;3:Purifiedfusionprotein;4:Proteinconcentrate 图 3 琼脂糖扩散试验 Fig.3 Agarosedifusiontest 图 5 第一轮 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图 Fig.5 Agarosegelelectrophoresisof firstroundpcrproducts M:DNA markerdl2000;1:negativecontrol;2 3:Productsoffirst roundpcr 图 4 MSTN 免疫骆驼血清滴度检测 Fig.4 Titerdetectionofcamelwas immunizedwithmstnprotein 2.5 VHH 基因的扩增巢式第一轮 PCR 以总 RNA 反转录合成的 cdna 为巢式第一轮 PCR 的模板, 用 AlpVh LD 和 CH2 R 为扩增引物进行 PCR, 产物用 1% 的琼脂糖凝胶电泳, 扩增结果出现 740bp 和 600bp 的两条带 ( 图 5) 巢式第二轮 PCR 第一轮 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳分离, 回收 740bp 的条带, 根据浓度稀释 5 10 倍后作为第二轮 PCR 的模板, 经 AlpVh SfiI 和 AlpVHHR1 NotI,AlpVh SfiI 和 AlpVHHR2 NotI 两对引物分别扩增后, 得到 450bp 左右的条带 ( 图 6) 图 6 第二轮 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图 Fig.6 Agarosegelelectrophoresisof secondroundpcrproducts M:DNAmarkerDL2000;1:Negativecontrol;2 3:Productsofsecond roundpcr 2.6 pcantab 5E 载体与 VHH 连接转化 VHH 片段与载体以和 7 1 的摩尔比进行

2014,34(9) 李尤简等 : 绵羊肌肉生长抑制素 MSTN 原核表达及其纳米抗体文库的构建与鉴定 91 连接, 转化并对菌斑进行计数, 最终确定最佳摩尔比为 5 1, 此后以该比率进行大规模连接经多次电转化巢式 PCR 产物连接转化获得的初级文库命名为 MNAL, 经菌落计数测定初级文库库容量达到 9.5 10 5 2.7

5 2014,34(9) 李尤简等 : 绵羊肌肉生长抑制素 MSTN 原核表达及其纳米抗体文库的构建与鉴定 91 连接, 转化并对菌斑进行计数, 最终确定最佳摩尔比为 5 1, 此后以该比率进行大规模连接经多次电转化巢式 PCR 产物连接转化获得的初级文库命名为 MNAL, 经菌落计数测定初级文库库容量达到文库的鉴定初级抗体基因库的库容计算对随机挑取 40 个 TG1 单菌落进行菌液 PCR 鉴定阳性率, 挑取的 40 个单克隆中有 38 个扩增出了 450bp 左右的目的条带从电泳结果可观察到, 阳性对照能扩增出目的条带, 阴性对照未扩增出条带, 说明 PCR 鉴定结果具有可靠性 ( 图 7), 结果表明构建的初级文库 MNAL 的克隆率为 95%, 因此构建的初级文库的实际库容量为 ( 其中包含串联序列无义突变序列以及冗余序列等无效克隆 ) 初级抗体基因库多样性鉴定从 IgG2 和 IgG3 的初级文库 MNAL 中各随机挑取 15 个克隆送至北京六合华大基因公司进行序列测定,R1 有 14 个成功测图 7 文库 PCR 鉴定 Fig.7 LibraryofthePCRidentification M:DNAmarkerDL2000;1:Positivecontrol;2:Negativecontrol;3 10:PCRidentification 序,R2 有 13 个成功测序, 利用 BLAST 分析测序结果, IgG2 的 14 个克隆和 IgG3 的 13 个克隆序列的进化树分析 ( 图 8), 比对分析结果显示全部克隆均为编码单域重链抗体可变区的基因, 序列无重复, 抗体基因库具有良好的多样性图 8 随机挑选阳性克隆的进化树分析 Fig.8 LibraryofthePCRidentification 2.8 噬菌体抗体库表达及滴度测定抗体库经辅助噬菌体扩繁液感染后, 分离获得重组噬菌体抗体展示文库, 噬菌体文库 10 9 倍稀释液侵染对数生长期的 TG1 大肠杆菌后涂板, 过夜培养后计数, 共有 180 个阳性克隆集落, 计算得出噬菌体抗体库滴度约为 pfu/ml 同时仅含噬菌体和 TG1 的对阴性培养板上均无阳性克隆集落生长 3 讨论目前我国养羊业存在的普遍问题是绵羊生长周期长, 产肉率低, 肌肉在胴体中的比率低等, 这些问题直接影响了畜牧业的经济效益本实验室长期致力于探寻一种安全有效的促动物生长制剂肌肉生长抑制素属于转化生长 β 超家族成员, 对肌肉生长起负调控作用, 现有的研究表明, 通过制备肌肉生长抑制素的拮抗物来阻断其分子作用通路, 可以有效的促进动物肌肉的生长和发育 [6 7] 此前本实验室已制备出 MSTN 多克隆抗体并经过肌肉细胞毒性分析, 证实了 MSTN 多克隆抗体对肌肉细胞无毒性作用, 为肌肉生长抑制素抗体作为异源性物质进行动物体效果验证提供了安全保障 [8] 噬菌体抗体库技术是利用 PCR 技术从生物体内扩增骆驼体内的 IgG2,IgG3 的可变区 [9], 利用噬菌体展示技术表达至噬菌体表面, 并用特异性抗原从中筛选得到特异抗体基因的技术 [10] 噬菌体抗体库可以根据外周血来源的不同分为免疫库和非免疫库, 前者是经

6 92 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No 免疫后的淋巴细胞所构建, 由于用于构建这些抗体库的淋巴细胞已在体内经过抗原选择和亲和力成熟, 因此从较小库容 (10 5 ~10 6 ) 就可以筛选到特异性强的高亲和力抗体后者则是来自未经免疫的个体外周血, 由于免疫库来源于受抗原刺激的个体外周血, 所以其特异性更高, 更容易获得高亲和力的抗体 [11] 研究以获得 MSTN 的重链抗体可变区为目标, 利用原核表达的 MSTN 蛋白免疫骆驼, 刺激产生相应抗体后, 采集不同时期的血液样本监控抗体效价, 在抗体达到最佳效价水平时分离外周血淋巴细胞, 以提高淘选出针对特定抗原的特异性抗体的机率由于重链抗体的 CDR3 比普通抗体的要长, 这可能在一定程度上弥补抗原结合能力下降的缺陷, 况且不同抗体的长度之间也存在着较大的差异性 [12], 因此最终扩增产物非一条特异性条带, 而是一定大小范围的 DNA 混合物在巢式 PCR 第一轮时, 用较低的退火温度扩增出大量的非特异性产物, 以保证能够尽可能的扩增较多的重链抗体基因 [13] 巢式第二轮 PCR 时, 分两步进行扩增反应, 以增加扩增的特异性, 在此过程中我们还进行了梯度 PCR, 找到最适退火温度最后, 通过优化连接体系, 优化电击转化的条件经过十多次电转化获得的库容量, 满足噬菌体免疫抗体库后续筛选对库容的要求, 测序结果表明该抗体库具有良好的多样性通过辅助噬菌体救援获得噬菌体展示文库滴度达 pfu/ml, 为筛选 MSTN 抗原特异的 VHH 抗体奠定基础参考文献 [1]McPheronAC,LawlerAM,LeeSJ,etal.Regulationofskeletal musclemasin micebyanew TGF β superfamilymember. Nature,1997,387: [2] Hamers Casterman C, Atarhouch T, MuydermansS, etal. Naturalyoccuringantibodiesdevoidoflightchains.Nature, 1993,363(6428): [3] 涂追, 许杨, 刘夏, 等. 驼源天然单域重链抗体库的构建与鉴定. 中国生物工程杂志,2011,31(4): TuZ,XuY,LiuX,etal.Constructionandbiopanningofcamelid naive single domain antibody phage display library.china Biotechnology,2011,31(4): [4] DavidR.Maas,JorgeSepulveda,AtonPernthaner,etal. Alpaca(Lamapacos) asaconvenientsourceofrecombinant camelidheavychainantibodies(vhhs).journalofimmunological Methods,2007,324(1 2): [5] GhahroudiM A,DesmyterA,WynsL,etal.Seleetionand identificationofsingledomain antibodyfragmentsfrom camel heavy chainantibodies.febsleters,1997,414(3): [6]MaXY,CaoYC,ShuDM,etal.Cloningandexpresionof swinemyostatingeneanditsapplicationinanimalimmunization trial.scichinaserc:lifesciences,2005,48(4): [7] Kim Y S,BobbiliN K,PaekK S,etal.Productionofa monoclonalanti myostatin antibodyand theefectsofin ovo administrationoftheantibodyonposthatchbroilergrowthand muscremas.poultsci,2006,85(6): [8] 郭吉星, 张辉, 胡圣伟, 等. 绵羊 MSTN 多克隆抗体的制备及细胞毒性分析. 生物技术,2013,23(2): GuoJX,ZhangH,HuSH W,etal.ProductionofPolyclonal Anti Myostatin Antibody of Ovine and the Analysis of Cytotoxicity.Biotechnology,2013,23(2): [9] GhahroudiM A,DesmyterA,WynsL,etal.Selectionand identificationofsingledomain antibodyfragmentsfrom camel heavychainantibodies.febsleters,1997,414(3): [10]McCafertyJ,GrifithsAD,WinterG,eta1.Phageantibodies: filamentousphagedisplayingantibodyvariabledomains.nature, 1990,348: [11] SblateroD, Florian F, BradburyA, etal. Analyzingthe peripheralbloodantibodyrepertoireofaceliacdiseasepatient usingphageantibodylibraries.hum Antibodies,2000,9(4): [12]VuKB,GhahroudiMA,WynsL,etal.ComparisonoflamaV H sequeneesfrom conventionaland heavy chain antibodies. MolecularImmunology,1997,34(16 17): [13] GhahroudiM A,DesmyterA,WynsL,etal.Seleetionand identificationofsingledomain antibodyfragmentsfrom camel heavy chainantibodies.febsleters,1997,414(3):

7 2014,34(9) 李尤简等 : 绵羊肌肉生长抑制素 MSTN 原核表达及其纳米抗体文库的构建与鉴定 93 ExpresionofOvineMyostatinGeneandConstructionandIdentification ofnanobodylibraryagainstrecombinantmstn LIYou jian 1 ZHANGguo qi 2 Gouji xing 2 CHENxin kai 1 DOUXiao xia 1 CHENChuang fu 2 SHENGJin liang 1 (1ColegeofAnimalScienceandTechnology) (2KeyLaboratoryofXinjiangEndemicandEthnicDisease,ShiheziUniversity,Shihezi ,China) Abstract TheovinemyostatingenewassubclonedintothepET 32a(+),andtransformedintoE.coli BL21.TheMSTN recombinantfusionproteinwaspurifiedandthehealthybactriancamelwasselectedfor immunizationwiththemstnprotein.totalrnawasextractedfrom peripherallymphocytesfortheamplification ofvhhfragmentsbyrt PCR.Primersdesignedaccordingtothesingledomaingenesequencesoftheantibodies andthevariablecameligg2,igg3geneswereamplifiedbynestedpcr.pcrproductswerethenpurifiedand insertedintophagemidvectorpcantab5e.thevhh antibodygenelibrarywasobtainedbyelectroporating recombinantpcantab5e VHH vectorsintoe.colitg 1cels.Thefirstsetofantibodygenelibrarywas composedwith individualcolonesaftercloningvhhgenesandthelibraryweposesedhighdiversity andgoodcapacity,whichprovidesaplatformforpanningvhhcamilidantibodyaimedatovinemstn. Keywords Ovine Myostatin Nanobody Phagedisplaylibrary 致谢近期为本刊审稿的专家 ( 按拼音首字母排列 ): 陈必链陈金春陈向东陈忠斌程旭东董关木方福德顾军郎志宏李佳慧李伟军李寅梁前进刘斌刘德虎刘晓兰刘兴军刘征刘志培马岚毛建平倪晔潘杰沈亚领汪道文王宾王贵学王明丽王云山温博海杨晓张万科朱泰承邹祥

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽

88 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No 方法 MSTN 成熟肽的原核表达与鉴定将含重组原核表达质粒的 pet 32a MSTN 转化到大肠杆菌 BL21 (DE3) 中过夜培养后按 转接至新鲜培养基, 加入 0.1m

88 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No 方法 MSTN 成熟肽的原核表达与鉴定将含重组原核表达质粒的 pet 32a MSTN 转化到大肠杆菌 BL21 (DE3) 中过夜培养后按转接至新鲜培养基, 加入 0.1m