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1 8 南方医科大学学报 J South ed Univ 0;(8) 基础研究 系统性红斑狼疮儿童特异性全长抗体基因库的构建与分析 周志刚 朱美华 梁中锟 陈振瑞 贺 微 李长征 谭万龙 姜世勃 5 刘叔文 周 烨 6 周 辰, 7 广州医学院第二附属医院儿科 广东 广州 560 南方医科大学 南方医院 药学院 中医药学院 6 基因工 程研究所 广东 广州 复旦大学上海医学院分子病毒学教育部//卫生部重点实验室 上海 香 港 Dgen 生物技术有限公司 香港 摘要 目的 构建系统性红斑狼疮 SLE 儿童个体特异性哺乳动物细胞表面展示的全长人抗体基因库 方法 采集 SLE 确诊患 儿外周血 分离外周血淋巴细胞 提取外周血淋巴细胞总RN 用RT-PCR扩增全长Kappa轻链 LCκ 和重链可变区 VH 基因 构建抗体轻链基因库和抗体重链基因库 将抗体基因库转染9T细胞 流式细胞仪分析抗体在9T细胞表面的表达 结果 以 0.8 μg 总 RN 为模板 用 6 套引物成功扩增全长 Kappa 轻链和重链可变区基因 插入表达载体 构建获得的重链基因库容量为 9. 轻链基因库容量为 8. 随机挑选的 个重链克隆有 8 个含有正确的阅读框架 编码 8 个不同的氨基酸序列 个 轻链克隆 7 个含有正确的阅读框架 编码 7 个不同的氨基酸序列 流式细胞仪分析挑选的单克隆和抗体基因库 均检测到全长 抗体在9T细胞表面的表达 理论上抗体库中可表达的抗体多样性可以达到9 结论 以0.8 μg总rn为模板 通过RT-PCR 扩增 成功构建SLE儿童特异性全长人抗体基因库 并在9T细胞表面成功展示SLE儿童个体抗体库中的全长抗体 为进一步 研究SLE儿童自身抗体的特点及自身抗体在SLE 发病机制中的作用及临床应用打下良好基础 关键词 系统性红斑狼疮 儿童 哺乳动物细胞表面展示 全长人源抗体库 中图分类号 R59. 文献标志码 文章编号 doi:.969/j.issn Construction of personalized full-length fully human mammalian display antibody library for children with systemic lupus erythematosus ZHOU Zhigang, ZHU eihua, LING Zhongkun, CHEN Zhenrui, HE Wei, LI Changzheng, TN Wanlong, JING Shibo5, LIU Shuwen, ZHOU Ye6, ZHOU Chen, 7 Department of Pediatrics, Second ffiliated Hospital of Guangzhou edical College, Guangzhou 560, China; Nanfang Hospital, School of Pharmaceutical Science, School of Traditional Chinese edicine, 6Institute of Genetic Engineering, Southern edical University, Guangzhou 555, China; 5Key Laboratory of edical olecular Virology of OE/OH, Shanghai edical College, Fudan University, Shanghai 000, China; 7Hong Kong Dgen iotech Limited Company, Hong Kong bstract: Objective To construct a personalized full-length fully human antibody mammalian display library for children with systemic lupus erythematosus (SLE). ethods The total RN was isolated from the PCs of SLE children. The heavy chain variable region and kappa light chain (VH and LCκ) of the antibody genes were amplified by RT-PCR and inserted into the pdg-hc-t vector separately to construct the heavy chain and light chain libraries. The library DNs were transfected into 9T cells and the expression of full-length fully human antibody on the surface of 9T cells was analyzed by flow cytometry. Results Using 0.8 μg total RN as the template, the VH and LCκ were amplified and the full-length fully human antibody mammalian display library was constructed. The VH and LCκ gene libraries had a size of 9. and 8., respectively. Sequence analysis of clones randomly selected from the VH and LCκ gene libraries each showed that 8 heavy chain clones and 7 light chain clones contained correct open reading frames, and flow cytometry demonstrated that all the 5 clones express full-length antibodies on 9T cell surfaces. 9T cells co-transfected with the VH and LCκ gene libraries expressed the full-length antibodies on the cell surface. Conclusion The personalized full-length fully human antibody library for SLE children constructed allows display of the full-length antibodies on mammalian cell surfaces, thus providing a valuable platform for analyzing the autoantibodies, their etiological role, and their clinical implications in SLE. Key words: systemic lupus erythematosus; children; mammalian display; full-length fully human antibody library 收稿日期 基金项目 国家自然科学基金 066 香港Dgen iotech Ltd科研基 金 DG0008 十二五科技重大专项 0ZX 高等学校 博士学科点专项科研基金 0009 广东省自然科学基金 S00078 Supported by National Natural Science Foundation of China (066). 作者简介 周志刚 副主任医师 liangbing507@6.com 通讯作者 周 辰 博士 zyujun@yahoo.com 周 烨 博士 讲师 lzhouye@6.com SLE 是一种典型的 主要发生在年轻女性 亦包括 儿童的自身免疫性疾病 危害性大 难以治愈 此病的 发病机制尚不清楚 但研究表明病人血清中存在着多种 自身抗体 自身抗体与抗原结合形成免疫复合物沉积在 组织及器官而引起炎症反应造成组织损伤 这在SLE的 - 发生发展中起着极为重要的作用 如果能高效地展 示及表达SLE个体的抗体库 对SLE的发病机制 诊断

2 第 8 期 周志刚, 等. 系统性红斑狼疮儿童特异性全长抗体基因库的构建与分析 8 甚至治疗将大有帮助 近 0 年来, 抗体领域的发展使得人们能够应用现代的生物学技术克隆全套的人抗体基因组 噬菌体展示技术是目前发展最成熟应用最广泛的展示技术, 此技术将单链抗体 (scfv) 或抗体的 Fab 片段 [-] 展示在噬菌体表面, 用于特异性抗体的分析和筛选 有文献报道应用噬菌体展示技术构建 SLE 特异性的单 [5] 链抗体 (scfv) 基因库 虽然噬菌体展示技术受到广泛 [6] 应用, 但它表达的不是全长抗体而是抗体片段, 所用的抗体表达系统是原核细胞 哺乳动物细胞表面展示技术是新一代的抗体展示 [7-8] 技术, 可在表达抗体的哺乳动物细胞表面直接分析筛选高亲和力的全长抗体, 优于常用的仅可用于筛选抗体 [9-] 片段的噬菌体展示技术 ; 构建的哺乳动物细胞表面展示型全长抗体库的库容量达到 [-] 在本研究中, 我们采用本课题组前期建立的快速构建全长抗体库 [-] 的方法, 成功构建大容量的 SLE 个体特异性儿童的抗体基因库, 并应用流式细胞分析技术对抗体库的多样性及全长抗体在细胞表面的表达进行了初步分析, 为进一步研究 SLE 儿童自身抗体的特点及自身抗体在 SLE 发病机制中的作用及临床应用打下良好基础 材料和方法. 载体哺乳动物细胞表达载体 pdg-hc-t 由本实验 [] 室构建, 可用于构建大容量抗体基因库 载体中抗体基因表达结构包括 CV 启动子, 带有 PDGFR 跨膜序列 (T) 的人抗体全长 IgG 重链基因 (HC-T) 采用 smi 酶切后可用于插入抗体重链的可变区基因, 用 SfiI 酶切后可用于插入抗体全长的轻链基因. 材料人淋巴细胞分离液购自天津美德太平洋科技有限公司 RN 提取试剂盒购自 QIGEN 引物均自行设计后由 Invitrogen 合成 逆转录酶 限制性内切酶 SfiI smi 和 T DN 连接酶购自 Fermentas,Taq DN 聚合酶购自 Promega TOPO- 电转化感受态大肠杆菌由本实验室制备, 转化效率为 8 个转化子 /μg puc9 质粒 DN 质粒 DN 小提试剂盒和 DN 凝胶回收试剂盒购自 xygen 9T 细胞由南方医科大学抗病毒研究中心提供 DE 和血清购自 Hyclon 细胞转染试剂由香港 Dgen 生物技术有限公司提供 荧光标记的抗体购自 D Pharmingen 外周血标本取自确诊的 SLE 个体. 方法.. 外周血淋巴细胞的分离与总 RN 的提取 SLE 个体的抗凝外周血约 8 ml, 采用梯度离心法分离获得外周血淋巴细胞 5 6, 按试剂盒方法提取获得淋巴细胞 总 RN 约.6 μg.. LCκ 和 VH 的扩增采用两步法扩增抗体基因 以 0.8 μg 总 RN 作为模板, 用 RT 试剂盒逆转录为 cdn;rt 产物共 5 μl 直接用于 PCR 扩增 参照本课 题组前期建立的方法 [], 用 套重链引物 (HGP, HGP,HGP) 和 套轻链引物 (HKP,HKP,HKP), 通过 6 个 PCR 反应, 扩增抗体 IgG 重链可变区 (VH) 和 kappa 轻链 (LCκ) 基因库 每个 PCR 反应体积 0 μl, 含有 μl RT 产物 PCR 反应条件如下 :9 预变性 5 min;9 变性 0 s,55 退火 0 s,7 延伸 min, 重复循环 5 次 ; 最后 7 继续延伸 7 min 琼脂糖凝胶 电泳回收 PCR 产物并测定其浓度.. 构建抗体轻链基因库和抗体重链基因库用 SfiI 对载体 pdg-hc-t 和扩增获得的 LCκ 基因进行酶 [5] 切, 按照黄婉玲等描述的方法进行 DN 的凝胶电泳 分离纯化 载体片段和轻链片段按 分子比例混合, 用 T DN 连接酶, 在 6 连接 h, 用连接产物电击 转化感受态大肠杆菌 TOPO-, 电感条件为.5 kv 5 μf 00 Ω, 将转化后的细菌接种于含有 0 mg/l 氨 苄青霉素的 L 平皿,7 培养过夜, 根据长出的克隆 数计算库容量 收集转化获得的所有菌落即为轻链抗 体基因库 收集平皿上所有的菌落, 即为抗体轻链基因 库 用 smi 对载体 pdg-hc-t 和扩增获得的 VH 基因进行酶切, 电泳分离纯化目的片段, 载体片段与重 链片段连接过夜, 电击转化感受态大肠杆菌 TOPO-, 接种于培养皿后隔日计算库容量, 收集平皿上所有的菌 落, 即为抗体重链基因库 分别从重链抗体库 轻链抗 体库中各随机挑选 个单克隆培养过夜后抽提质粒, 交广州 Invitrogen 公司进行测序.. 抗体基因转染 9T 细胞细胞转染在 孔细胞 培养板中进行, 每孔接种 8 5 9T 细胞,7 培养过 夜, 然后进行细胞转染 取 μg 质粒 DN( 轻重链表达 载体的分子比为 ) 和 6 μl 转染试剂, 分别用 80 μl DE 稀释, 放置 min 后将 DN 溶液加入转染溶液, 然后将二者的混合液在室温放置 5 min 后直接加入细 胞培养孔中 ;6~ h 后换成新鲜培养液 ;0~60 h 后检测 抗体在细胞表面的表达..5 流式细胞仪分析抗体在 9T 细胞表面的表达用 不含胰酶的细胞消化液 (Invitrogen) 消化转染后的细 胞, 然后取分散的细胞与荧光标记的抗体进行反应 在 50 μl 反应体系中含有 5 5 细胞和 μl PE 标记的鼠抗 人 Kappa 链的特异性抗体 (PE-Kappa), 混匀后于冰上 孵育 0 min, 用染色缓冲液 (PS+%FS) 洗涤细胞 次, 然后将细胞重悬于 00 μl 染色缓冲液, 用流式细胞 仪分析抗体基因在细胞表面的表达 用 FCS Express V 对结果进行分析

3 8 南方医科大学学报 J South ed Univ 结果. 抗体基因的扩增 以所获的外周血淋巴细胞总 RN 为模板 经逆转 录合成 cdn 然后以 cdn 为模板 用特异性引物扩 增出 LCκ基因和 VH 基因 将 PCR 扩增得到的 组重 链可变区 VH 产物和组轻链 LCκ 基因产物 经琼脂 糖凝胶电泳分析可见0.5 kb的dn条带和0.75 kb的 DN 条带 大小与预期结果相符 图 回收相应大小 的 DN 片段 用微量紫外分光光度计测定 DN 浓度 计算回收量 结果表明轻 重链的各套引物均能高效 扩增到相应的轻 重链基因. 抗体基因的进一步纯化和酶切处理 为尽可能保持所扩增的抗体基因的代表性 以及分 析扩增产物的均一性 每组扩增产物各取 将轻 重链基因分别混合各得 0 ng 进行第 次琼脂糖凝 胶电泳分析 如图 和表 所见 第一次回收的扩增产 物含有大量的非目的 DN 片段 回收相应大小的 DN 片段 用微量紫外分光光度计测定 DN 浓度 计 图 RT-PCR产物电泳图 : VH PCR 产 物. : arker; ~: HGP; 5~8: HGP; 8~: HGP. : LCκ PCR 产物. : arker; ~: HKP; 5~8: HKP; 9~ : HKP Fig. Electrophoresis of the RT-PCR products. 算回收量约 0% VH 60 ng LCk 75 ng 将回收的 VH和LCκ DN片段分别用smI和SfiI酶切 然后进 行第 次琼脂糖凝胶电泳分析纯化 分别各回收获得 5 ng 第 卷 C 基因库的构建及分析 酶切后的重 轻链 PCR 产物 插入载体 pdghc-t 并导入感受态细菌 根据在带有氨苄青霉素 抗性 L 平皿上的菌落数 计算连接转化效率和所构建 抗体基因库的库容量 连接转化设实验组 载体+插入 片段 和对照组 只有载体 无插入片段 结果表明 重 链基因库实验组的连接转化效率为每微克 DN 5 6 克隆 对照组为. 克隆 无插入片段的背景克隆为 % 轻链基因库实验组的连接转化效率为每微克DN.7 6克隆 对照组为. 克隆 无插入片段的背景 图 混合后及酶切后 VH 和 LCκ RT-PCR 产物电 泳图 : 混合后 LCκ RT-PCR 产物的电泳图. : arker; ~ : LCκ. : 混合后VH RT-PCR产物电泳图. : arker; ~: VH. C: 酶切后VH和LCκ RT-PCR产物电泳图. : arker; ~: LCκ; ~: VH Fig. Electrophoresis of the RT-PCR products of VH and LCκ genes after digestion. 克隆为% 分别用50 ng重链连接产物和0 ng轻链 连接产物转化感受态细菌 构建获得的重链基因库容量 为9. 轻链基因库容量为8. 随机挑选0个 单克隆 轻 重链基因库各 个 进行测序分析 结果 表明 个重链克隆有8个含有正确的阅读框架 编码8 个不同的氨基酸序列 图 个轻链克隆 7 个含有 正确的阅读框架 编码7个不同的氨基酸序列 图. 全长抗体在9T细胞表面的表达 将 8 个重链克隆分别与经鉴定可高效表达轻链的 载体DN共转染9T细胞 同时将7个轻链克隆分别

4 第8期 周志刚,等.系统性红斑狼疮儿童特异性全长抗体基因库的构建与分析 与经鉴定可高效表达重链的载体 DN 共转染 9T 细 胞 然后用流式细胞仪分析抗体在 9T 细胞表面的表 达 结果表明轻链库的7个克隆 重链库的8个克隆均可 检测到抗体的表达 图 为研究整体抗体基因库的表达 分别提取轻链库和 重链库的质粒 DN 将轻 重链基因库共转染 9T 细 胞 流式细胞仪分析全长人源抗体在细胞表面的表达 结果表明 所构建的抗体库共转染的 9T 细胞表面可 检测到抗体表达 阳性细胞比例达到.% 图 5 说 明9T细胞表面能够成功展示抗体库中的全长抗体 表 PCR扩增DN片段纯化回收定量分析 Tab. Quantitative analysis of the purified DN fragments after PCR amplification 引物 st 回收 ed 混合电泳 HGP 5 ng HGP 960 ng HGP 00 ng HKP 695 ng HKP 680 ng HKP 750 ng ed 回收 rd 回收 60 ng 5 ng 75 ng 5 ng 85 重链引物 轻链引物 图 轻重链可变区氨基酸序列的比对分析 : 重链可变区; : 轻链可变区 Fig. Sequence analysis of the amino acids in the variable region of the light and heavy chains. 讨论 抗体库技术已经成为分析筛选单克隆抗体的重要 手段 与目前常用噬菌体表面展示技术相比 近期发展 的哺乳动物细胞表面抗体展示技术能在细胞表面展示 全长抗体 所表达的抗体在分子结构 理化性质和生物 学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质 7 能直接 在细胞表面进行许多抗体特性如亲和力和表达强度等 的分析 用于抗体药物的研发将可能降低成本 缩短时 间 提高成功率 在临床上 小儿血样本的收集困难 而且样本量很 少 难以对SLE患儿的抗体库进行深入分析 本课题组 前期用6个PCR反应即可快速构建全长抗体基因库 流 式细胞仪分析显示全长抗体在细胞表面的高效表达 本文报道采用此快速抗体库构建技术仅用临床检验剩 余的少量血样本成功构建SLE患儿个体特异性的全长 人源抗体库 为了保障RT-PCR扩增的抗体基因库的质量 实验 中 先后对 PCR 产物进行 次琼脂糖凝胶电泳分离纯 化 每次纯化均进一步提高了目的 DN 的纯度 随着 样品量的减少 回收率大大降低 表结果表明 第次 回收率约为0% 第次则更不足0% 为了最终能获 得足够的目的 DN 用于基因库的构建 在只有少量 RN样本的情况下 RT-PCR扩增的高效是关键 本实 验采用两步法分别进行RT和PCR反应 并在PCR反应 时将反应体积扩大到 0 μl 进行 5 次循环扩增 从而 使PCR反应的产量至少也达到. μg 为了提高连接效率 对载体和基因片段进行酶切 时 在初次酶切过夜后再补加适量的酶加时酶切~6 h 以尽可能切除载体中原有的DN片段及基因片段两端 的非互补序列 在本研究中分别构建了抗体轻链基因

5 % E I.78% J N % K % L 8.8% H 0.7% 5.98% 00 7.% G D F %.0% 7.67% C 0.% % % 5.8% % 第 卷 南方医科大学学报 J South ed Univ O 0 0 P 5.78% 图 流式细胞仪检测抗体在细胞表面的表达 X轴表示FITC的荧光强度, Y轴表示PE的荧光强度, 分别以 和 标示. : 阴 性对照; : 阳性对照; C~J: 8个重链克隆, K~Q: 7个轻链克隆 Fig. Flow cytometric analysis of the expressed antibodies on the cell surface. 0 0 Q 库和重链基因库 基因库中没有插入抗体基因的背景 8. 和9. 但共转染哺乳动物细胞以后 轻重链 克隆仅为%~% 随机选择单克隆进行基因序列和抗 在哺乳动物细胞内可以依靠其天然的配对机制进行随 体表达分析表明7/的克隆可在细胞表面检测到抗体 机配对 理论上抗体库可表达的抗体多样性可以达到 的表达 因此 虽然抗体轻 重链基因库库容量仅为 % 9. 80% 这些结果

6 第 8 期周志刚, 等. 系统性红斑狼疮儿童特异性全长抗体基因库的构建与分析 87 %.% 0 0 图 5 流式细胞仪分析抗体库在 9T 细胞表面的表达 X 轴表示 FITC 的荧光强度, Y 轴表示 PE 的荧光强度, 分别以 和 标示. : 阴性对照 ; : 抗体库共转染的 9T 细胞 Fig.5 Flow cytometric analysis of antibody tibrary on 9T cell surface. 0 0 表明本实验构建的抗体库具有良好的质量和多样性 综上所述, 本实验应用快速抗体库构建技术成功构建 SLE 患儿个体特异性全长抗体基因库, 用流式细胞仪检测到全长抗体在哺乳动物细胞表面的高效表达, 可表达的抗体多样性达到 9 我们在前期研究中已成功地从构建的抗乙肝表面抗原抗体阳性个体特异性抗体基 [6] 因库中筛选到抗原特异性抗体 因此,SLE 个体特异性抗体库的建立为 SLE 患者自身抗体的分析和筛选提供了良好的研究平台 参考文献 : [] Rumore P, Steinman CR. Endogenous circulating DN in systemic lupus erythematosus. Occurrence as multimeric complexes bound to histone[j]. J Clin Invest, 990, 86(): [] Villarreal G, Drenkard C, Villa R, et al. Prevalence of autoantibodies and of the 6/6 and related pathogenic idiotypes in 65 patients with systemic lupus erythematosus and their relationship with disease activity[j]. Lupus, 997, 6(5): 5-5. [] Smith GP. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface[j]. Science, 985, 8 (705): 5-7. [] zzazy H, Highsmith WE Jr. Phage display technology: clinical applications and recent innovations[j]. Clin iochem, 00, 5(6): 5-5. [5] 康向东, 陈顺乐, 鲍春德, 等. SLE 患者自身抗体单链噬菌体抗体库构建及抗体活性检测 [J]. 上海免疫学杂志, 999(): -5. [6] Vaughan TJ, Williams J, Pritchard K, et al. Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library[j]. Nat iotechnol, 996, (): 09-. [7] Zhou C, Jacobsen FW, Cai L, et al. Development of a novel mammalian cell surface antibody display platform[j]. bs, 0, (5): [8] eerli RR, auer, user R, et al. Isolation of human monoclonal antibodies by mammalian cell display[j]. Proc Natl cad Sci US, 008, 5(8): 6-. [9] Zhao Y, mer S, Wang J, et al. Construction, screening and identification of a phage display antibody library against the Eimeria acervulina merozoite[j]. iochem iophys Res Commun, 0, 9(): []Sommavilla R, Lovato V, Villa, et al. Design and construction of a naïve mouse antibody phage display library[j]. J Immunol ethods, 0, 5(-): -. []Zhou Y, Chen ZR, Li CZ, et al. novel strategy for rapid construction of libraries of full-length antibodies highly expressed on mammalian cell surfaces[j]. cta iochim iophys Sin (Shanghai), 0, (8): [] 陈振瑞, 李长征, 贺微, 等. 采用哺乳动物细胞表面展示技术构建全长人源抗肾癌抗体基因库 [J]. 南方医科大学学报, 0, 0(5): []Zhou I, Zhang ZH, Li CZ, et al. Four-way ligation for construction of a mammalian cell-based full-length antibody display library[j]. cta iochim iophys Sin (Shanghai), 0, (): -8. [] 贺微, 李长征, 陈振瑞, 等. 快速构建哺乳动物细胞表面展示的全长人抗体基因库 [J]. 南方医科大学学报, 0, (): 08-. [5] 黄婉玲, 李长征, 陈振瑞, 等. 紫外线照射所致的 DN 损伤对连接转化的影响 [J]. 南方医科大学学报, 0, 0(): -, 7. [6]Li CZ, Liang ZK, Chen ZR, et al. Identification of Hsg-specific antibodies from a mammalian cell displayed full-length human antibody library of healthy immunized donor[j]. Cell ol Immunol, 0, 9(): ( 编辑 : 黄开颜 )

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