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1 2010;30(1)%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 南方医科大学学报 (J%South%Med%Univ) 25 抗表皮生长因子受体 Ⅲ 型突变体噬菌体单链抗体库的构建与初步筛选韩东刚 1, 段小艺 2, 郭佑民 3, 周琦 1, 王全颖 4, 杨广笑 4 1 ( 西安交通大学医学院第二附属医院超声研究室, 3 影像中心, 陕西西安 ; 2 西安交通大学医学院第一附属医院核医学科, 陕西西安 ; 4 西安华广生物工程公司, 陕西西安 ) 摘要 : 目的构建抗表皮生长因子受体 Ⅲ 型突变体 (EGFRvⅢ) 特异性单链抗体库, 从中筛选抗 EGFRvⅢ 特异性单链抗体方法用 pep-3 偶联载体蛋白 OVA, 然后免疫 BALB/c 小鼠从脾淋巴细胞中提取总 RNA, 采用 RT-PCR 方法扩增重链 (VH) 和轻链 (VL)% 的可变区基因片段将两基因片段由编码 (Gly4Ser)3 的 linker 连在一起, 并克隆入噬菌体展示表达载体 pcantab5e% 中, 电转化至 E. coli TG1, 经辅助噬菌体超感染, 构建噬菌体单链抗体库以 pep-3-bsa 为抗原对所建抗体库进行 4 轮亲和筛选, 用 ELISA 鉴定抗体与 EGFRvⅢ 结合的特异性结果经琼脂糖凝胶电泳分析,RT-PCR 方法扩增的抗体 VH 和 VL 基因片段大小约 350 和 320%bp, 与预期理论值相符经重组 PCR 得到大小约 780%bp 的 ScFv 基因片段 ScFv 基因片段经双酶切后成功定向克隆到噬菌粒载体, 回收后构建成库容量为的噬菌体抗体库, 噬菌体滴度为 %pfu/%ml 通过亲和筛选使抗 EGFRvⅢ 噬菌体单链抗体得到富集, 第 4 轮为第 1 轮的 56 倍在 E. coli HB2151 中实现了单链抗体的可溶性表达 SDS-PAGE 结果显示抗体相对分子质量为 28%000 左右 ELISA 测定结果显示该单链抗体具有结合 EGFRvⅢ 的特异性结论成功构建了噬菌体单链抗体库, 筛选得到了抗 EGFRvⅢ 特异性噬菌体单链抗体关键词 : 噬菌体展示技术 ; 单链抗体 ; 表皮生长因子受体 Ⅲ 型突变体 ; 筛选中图分类号 :R742.%3%%%%%%%% 文献标识码 :A%%%%%%%% 文章编号 : (2010) Construction of a phage antibody library and screening of anti-epidermal growth factor receptor variant III single chain antibody HAN%Dong-gang 1,%DUAN%Xiao-yi 2,%GUO%You-min 3,%ZHOU%Qi 1,%WANG%Quan-ying 4,%YANG%Guang-xiao 4 Department%of%Medical%Ultrasound%Study,%Second%Affiliated%Hospital,%Xi'an%Jiaotong%University%College%of%Medicine,%Xi'an%710004,%China Abstract: Objective To%obtain%specific%anti-epidermal%growth%factor%receptor%variant%III% (EGFRvIII) %single%chain%antibody% (ScFv) %by%phage%antibody%library%display%system. %Methods The%total%RNA%was%extracted%from%the%spleen%B%cells%of%BALB/c% mice%immunized%with%pep-3-ova%protein,%and%the%first-strand%cdna%was%synthesized%by%reverse%transcription.%antibody%vh% and% VL% gene% fragments% were% amplified% and% joined% to% a% ScFv% gene% with% the% linker. % The% ScFv% gene% was% ligated% into% the% phagemid%vector%pcantab5e,%which%was%transformed%into%competent%e. coli TG1.%The%transformed%cells%were%then%infected% with%m13ko7%helper%phage%to%yield%the%recombinant%phage%to%construct%the%phage%scfv%library. %Pep-3-BSA%protein%was%used% to%screen%the%phage%antibody%library%and%elisa%carried%out%to%characterize%the%activity%of%the%antibody. % Results The%VH%and% VL%gene%fragments%of%the%antibody%were%about%350%bp%and%320%bp%in%length%as%analyzed%by%agarose%gel%electrophoresis. %The% ScFv%gene%was%780%bp, %consistent%with%the%expected%length. %The%recombinant%phagemid%with%ScFv%gene%insert%was%rescued,% and%an%immune%phage%scfv%library%with%the%content%of% %was%constructed. %The%recombinant%ScFv%phage%had%a%titer%of% %cfu/ml, %and%the%fourth%phage%harvest%yielded%56%times%as%much%as%that%of%the%first%one. %SDS-PAGE%demonstrated%a% molecular%mass%of%the%soluble%scfv%of%about%28%kd. %ELISA%results%indicated%good%specificity%of%the%ScFv%to%bind%EGFRvIII.% Conclusion An%immune%phage%ScFv%library%is%successfully%constructed,%and%the%ScFv%antibody%fragment%is%capable%of%specific% binding%to%egfrviii.% Key words: phage%display%system;%single%chain%variable%fragment;%epidermal%growth%factor%receptor%variant% Ⅲ;%screening 表皮生长因子受体与恶性肿瘤的发生发展存在密切关系, 近年系列研究发现 EGFR 蛋白的表达不很收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ); 陕西省科技攻关项目 (2007K11-02) 作者简介 : 韩东刚 (1975-), 男, 硕士, 主治医师, 在读博士生研究生, 电话 : , eastg2006@126.com 通讯作者 : 郭佑民 (1955-), 博士, 教授, 电话 : , %cjr. guoyoumin@vip.163.com 稳定, 常常出现基因的扩增和重排, 导致肿瘤细胞表面的抗原表型发生相应变化, 其中最常见的突变类型为 EGFR%Ⅲ 型突变体 (EGFRvⅢ) [1] EGFRvⅢ 的产生促进了细胞向恶性表型的转化, 使肿瘤细胞活力增 [2-3] 高, 侵袭性增强, 易发生早期转移由于 EGFRvⅢ 仅表达于恶性肿瘤细胞, 在正常组织中检测不到, 因而成为治疗恶性肿瘤的理想靶点本研究采用基因工程和噬菌体表面展示技术建立针对 EGFRvⅢ 的单链

2 26 %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 南方医科大学学报 (J%South%Med%Univ)%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 第 30 卷噬菌体抗体库并筛选获得相应的单链抗体 (scfv)%, 为研究针对 EGFRvⅢ 的抗肿瘤药物奠定一定的研究基础 1%% 材料与方法 1.1%% 材料雌性 BALB/c 小鼠 7 只,6~8 周龄, 体质量 18~22% g, 购自西安交通大学医学实验动物中心包含 EGFRvⅢ 突变区融合位点的 13 个氨基酸所组成的短肽 pep-3 [4] ( 氨基酸序列为 LEEKKGNYVVTDHC) 由西安蓝晶生物工程公司合成 Imject% 免疫原 EDC 偶联试剂盒购自 PIERCE% 公司噬菌粒载体 pcantab5e 辅助噬菌体 M13KO7% 大肠杆菌 TG1 及 HB2151 购自 Amersham% Biosciences 公司 Taq% DNA% 聚合酶 dntp% 及限制性内切酶为 Promega% 公司产品 1.2% 引物设计重链可变区正向引物 :5`-CAG%GTS%MAR%CTG% CAG%SAG%TCW%GG-3'; 反向引物 :5`-TGM%GGA%GAC% GGT%GAC%CRW%GGT%CC-3' 轻链可变区正向引物 : 5'-GAG%CTC%GTG%CTC%ACM%CAR%WCT%CC-3'; 反向引物 :5`-GGA%TAC%AGT%TGG%TGC%AGC%ATC-3' 轻链和重链间连接子正向引物 :GGC%GGT%GGT%GGG% TCG% GGT% GGC% GGC% GGA% TCT% GAG% CTC% GTG% CTC%ACM; 轻链和重链间连接子 Linker 反向引物 : CGA% CCC% ACC% ACC% GCC% CGA% GCC% ACC% GCC% ACC%TGM%GGA%GAC%GAC 设计包含有噬菌体载体酶连接点的正向引物 :% 5`-CAG%CCG%GCC% ATG% GCG% CAG% GTS% CAG% CTG% CAG%SAG%TC;( 注 :CC%ATG%G 为 Nco I% 酶切点,CTG% CAG 为 Pvu Ⅱ 酶切点 ), 反向引物 :5`-GAA% GAT% GGA% TCC% AGC% GGC% CGC% TCA% GGA% TAC% TGG% TGC%AGC%ATC( 注 :%GC%GGC%CGC:%Not I% 酶切点 ) 1.3% 方法 1.3.1% 免疫动物提取总 RNA% 将包含 13 个氨基酸的短肽 pep-3 作为半抗原, 通过 EDC 交联分子与载体蛋白 OVA 偶联, 按厂家使用说明书介绍方法偶联纯化后, 经腹腔注射免疫 BALB/c 小鼠, 每周免疫 1 次, 免疫剂量为 30%μg/ 次第 1 次使用偶联蛋白与等量完全弗氏佐剂的乳化混合物, 第 2 次使用偶联蛋白与不完全弗氏佐剂的乳化混合物, 此后免疫不加佐剂而仅使用偶联蛋白, 每次免疫后的第 3 天鼠尾采血, 用间接 ELISA% 方法测血清抗体的效价, 包被液为 pep-3 与 BSA 的偶联物待抗体效价达到后, 杀鼠取脾, 提取总 RNA 1.3.2%%PCR 扩增抗体基因片段以总 RNA 为模板, 通过 poly%t 引物逆转录合成 cdna 以 cdna 为模板, 分别使用重链和轻链可变区引物扩增重链与轻链可变区抗体基因 VH 与 VL PCR 反应条件为 94% 预变性 300%s,94% 变性 60%s,45% 退火 60%s,72% 延伸 60% s,30 个循环后,72% 延伸 3%min 将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定, 用 DNA%Purification%System 纯化回收目的片段 1.3.3%% 连接 VH% 和 VL% 基因片段并进行 PCR 扩增将回收的 VH 和 VL 片段与编码 (Gly4Ser)3 的 linker 连接子引物以等摩尔浓度混合, 通过包含有噬菌体载体酶连接点的正反向引物重叠 - 延伸 - 拼接 PCR 形成 scfv 基因片段, 然后再向反应体系中加入 scfv 扩增的引物, 形成两端分别带有酶切位点的 scfv 基因片段 PCR% 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化回收目的片段 1.3.4%% 构建噬菌体抗体库将拼接后的 ScFv 基因片段和噬菌粒载体 pcantab5e 分别用 NcoI 和 NotI 双酶切并纯化回收, 回收产物用 T 4 %DNA 连接酶连接 ( 图 1) 制备感受态大肠杆菌 TGl, 进行电穿孔转化将转化产物立即加入至 37% 预热的 L%2 YTG(20%% 葡萄糖 ) 培养基中,37% 培养 1%h%, 取少部分转化菌经梯度稀释后铺 SOBAG 琼脂板, 计数菌落, 测定库容其余的菌液涂于 SOBAG% 琼脂板,30% 培养 24%h 用 2 YT% 培养基收集细菌集落, 取一部分悬于 10%ml%2 YTAG(100%μg/ml 氨苄,20% 葡萄糖 )% 培养基中, 振荡培养 1%h 至对数生长期后, 加入 M13KO7% 辅助噬菌体进行超感染, 继续培养 1%h, 离心后将菌体质量悬于 2 YTAK(50%mg/ml 卡那霉素,20% 葡萄糖 )% 培养基中过夜培养, 次日离心收集上清, 加入 1/5% 体积的 PEG/NaCl 溶液沉淀噬菌体, 冰浴 1%h, 离心后用 PBS 重悬沉淀, 即为噬菌体 ScFv 抗体库,4% 储存备用另取 10%μl 经梯度稀释的噬菌体抗体加入到 100%μl% TG1 菌中,37% 缓摇 15%min 后铺 SOBAG 平板,37% 过夜培养, 次日按所生长菌落数计算噬菌体滴度 (cfu) 1.3.5%% 抗 EGFRvⅢ 噬菌体 scfv 的筛选取 scfv 噬菌体抗体库菌种 1%ml 进行噬菌体表面呈现以短肽链 pep-3 与载体蛋白 BSA 的偶联物为抗原对所建的抗体库进行筛选, 将 20%ml 稀释的 PEG- 重组噬菌体抗体悬浮液加入预先准备好的包被抗原培养瓶,37% 孵育 24%h; 倒空培养瓶, 用 PBS 洗涤培养瓶 20 遍 ; 以甘氨酸 - 盐酸 (ph2.2)% 洗脱吸附的重组噬菌体抗体, 用 2%mol/L%Tris(pH7.4) 中和后再次感染对数生长期的 TG1,37% 250%r/min 培养 1%h 按上述方法再次制备重组噬菌体, 共进行 4 轮筛选 1.3.6% 制备单克隆噬菌体抗体将最后一轮筛选得到

波长酶标仪读板,P/N>2 为阳性实验质量控制在免疫阶段采用间接 ELISA% 方法测血清抗体效价,VH% 和 VL% 基因片段扩增及连接采用琼脂糖凝胶电泳鉴定, 抗体库构建和筛选严格按照试剂盒说明书操作规程, 单链抗体基因序列的鉴定通过 DNA 测序并进行 BLAST 比对, 单链抗体的特异性通过 SDS-PAGE 鉴定并作 ELISA 检验图 1%%ScFv

3 第 1 期韩东刚, 等. 抗表皮生长因子受体 Ⅲ 型突变体噬菌体单链抗体库的构建与初步筛选 27 Sequences%on%following%page 的特异性用 pep-3-ova 偶联蛋白包被 96 孔培养板将鉴定正确的噬菌体单链抗体浓缩后倍比稀释并作为一抗,HRP 标山羊抗 M13IgG 为二抗,ABTS 为底物进行 ELISA 检测以 BSA 包被 96 孔培养板做为对照 405%nm 波长酶标仪读板,P/N>2 为阳性实验质量控制在免疫阶段采用间接 ELISA% 方法测血清抗体效价,VH% 和 VL% 基因片段扩增及连接采用琼脂糖凝胶电泳鉴定, 抗体库构建和筛选严格按照试剂盒说明书操作规程, 单链抗体基因序列的鉴定通过 DNA 测序并进行 BLAST 比对, 单链抗体的特异性通过 SDS-PAGE 鉴定并作 ELISA 检验图 1%%ScFv 组装进入噬菌粒载体示意图的含有重组噬菌体的上清转移到 10 个灭菌离心管, 分别从每一管中取 500%μl 噬菌体上清转入另一离心管, 分别加 200%μl%PEG/NaCl, 混匀后室温放置 10%min 后离心, 弃上清将沉淀物重悬于 100%μl 碘化物缓冲液中, 加入 250%μl 乙醇, 室温温育 10%min 后离心, 弃上清, 并用 70% 的乙醇洗沉淀, 干燥 2%h 将沉淀重悬于 30%μl%TE 中 1.3.7%%PCR 扩增 scfv-dna 产物并插入 pgem-t%easy 载体将 10 管中 scfv%dna 产物分别进行 PCR 扩增反应体系 :scfv%dna 模板 1%μ1,VHF2 正向引物 0.25% μ1,vhr2 负向引物 0.25%μ1,dNTPs(10%mmol/μ1)0.5% μ1,10 Taq%DNA 聚合酶缓冲液 2.5%μ1,Taq%DNA 聚合酶 (2.5%U/μ1)%0.25%μ1,Mgcl2(25%mmol/μ1)1.5%μ1, 去离子水 16.75%μ1 PCR 反应条件 :94% 预变性 300% s,94% 变性 60%s,56% 退火 60%s,72% 延伸 60%s,30 个循环后,72% 延伸 3%min; 取 5%μ1%PCR 反应产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定将鉴定正确的 PCR 产物通过 T 4 %DNA 连接酶连接入 PGEM-T%Easy% 载体质粒, 扩增后小提质粒并送往上海生工生物工程技术有限公司进行测序, 并对 VH 和 VL 基因序列进行 BLAST 比对 1.3.8%%scFv% 基因的表达及表达产物的鉴定用鉴定正确的噬菌体 scfv% 感染 E. coli HB2151, 铺板, 挑取单克隆接种到 2 YTAG 培养基中, 培养至对数生长期, 离心, 菌体重悬于 2 YT 培养基中, 加入 IPTG 至 1% mmol/l% 诱导表达 4%h,Anti-E%Tag 柱亲和柱层析纯化表达的抗体检测噬菌体单链抗体的特异性采用 ELISA 法初步检测筛选出的噬菌体单链抗体与 EGFRvⅢ 结合 2%% 结果 2.1%% 免疫动物及总 RNA 提取用 pep-3-ova 免疫 BALB/c 小鼠, 免疫第 3 次有 3 只小鼠可检测到抗体, 免疫 4 次后所有小鼠均可检测到抗体, 免疫 6 次后所有小鼠血清中抗体效价均超过 , 说明免疫可诱导机体产生特异性 IgG 杀鼠取脾, 提取总 RNA, 经 1% 琼脂糖凝胶电泳可见 28S 和 18S 两条清晰条带, 表明提取的 RNA 质量较好 2.2%%VH 和 VL 基因的扩增和 scfv% 基因的拼接以总 RNA 为模板, 逆转录合成 cdna 第一条链, 用两组简并引物分别扩增出大约 350%bp 的 VH 和 320%bp 的 VL 基因片段 ( 图 2)%, 将 VH 和 VL 基因与 linker 连接成 scfv 并进行二次 PCR 扩增扩增出的 scfv 基因片段经琼脂糖凝胶电泳后可见 780%bp 左右的扩增带, 与预期大小相符 ( 图 3) M%%%%%A%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%M%%%%%%%%B bp bp 图 2%%VH 和 VL 的 RT-PCR 扩增产物 M:DNA 相对分子质量标准 ;%A:VH% 基因 ;%B:VL% 基因 2.3%% 噬菌体单链抗体库构建和筛选对噬菌体 scfv 库进行了吸附 - 洗脱 - 扩增的富集筛选 ( 表 1), 经过 4 轮筛选, 特异性噬菌体抗体逐渐富集, 到第 4 轮噬菌体收获率是第 1 轮的 56 倍, 说明特异性的 scfv% 得到了有效富集

28 %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 南方医科大学学报 (J%South%Med%Univ)%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 第 30 卷 A%%%%%%%%%%%%%B VH 1000 780 图 3%%scFv

48 10-8 %%%%%2%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%2.1 10 11 %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%4.1 10 4 %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%1.95 10-7 %%%%%3%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%1.0 10 11 %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%1.

50 10-6 图 4%%scFv 重链与轻链可变区基因的氨基酸排列顺序取 10%μ1 已经转化 ScFv/pCANTAB5E 的菌液, 用 2 YT 培养基按照梯度稀释 (10 1 10 2 10 8 ), 平铺在 9 个 SOB-AG 平板上, 干燥后倒置,30% 孵育过夜 ; 计数菌落, 测定库容达到 5.0 10 6, 噬菌体滴度为 3.0 10 4 %%pfu/ml 2.

见图 4 2.5%%SDS-PAGE 鉴定 ScFv 抗体的相对分子质量将阳性的噬菌体感染 E.coli HB2151, 经 IPTG 诱导做 SDS-PAGE 鉴定, 在相对分子质量近 28%000 处可见一条表达带, 经亲和柱层析纯化后显示在该处有一条清晰的显色条带 ( 图 5) 2.

4 28 %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 南方医科大学学报 (J%South%Med%Univ)%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 第 30 卷 A%%%%%%%%%%%%%B VH 图 3%%scFv 基因的琼脂糖凝胶电泳鉴定 VL A:DNA 相对分子质量标准 ;%B:ScFv% 基因表 1%% 每轮筛选中噬菌体抗体的回收率筛选轮投入噬菌体效价 (cfu) 产出噬菌体效价 (cfu) 回收率 % %%%%%1%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% %%%%%2%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% %%%%%3%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% %%%%%4%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% % %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 图 4%%scFv 重链与轻链可变区基因的氨基酸排列顺序取 10%μ1 已经转化 ScFv/pCANTAB5E 的菌液, 用 2 YT 培养基按照梯度稀释 ( ), 平铺在 9 个 SOB-AG 平板上, 干燥后倒置,30% 孵育过夜 ; 计数菌落, 测定库容达到 , 噬菌体滴度为 %%pfu/ml 2.4%% 噬菌体 scfv 序列分析将筛选获得的含有重组噬菌体的上清转移到 10 个离心管中, 通过 PCR 扩增 DNA 后插入 pgem-t% Easy 载体, 经过琼脂糖凝胶电泳鉴定后显示所有离心管中均检测出噬菌体单链抗体的存在 DNA 测序结果显示, 所得 scfv 序列与预期设计相符通过 BLAST 比对分析, 重轻链可变区含有明确的骨架区 (FR) 和抗原决定簇互补区 (CDR), 见图 4 2.5%%SDS-PAGE 鉴定 ScFv 抗体的相对分子质量将阳性的噬菌体感染 E.coli HB2151, 经 IPTG 诱导做 SDS-PAGE 鉴定, 在相对分子质量近 28%000 处可见一条表达带, 经亲和柱层析纯化后显示在该处有一条清晰的显色条带 ( 图 5) 2.6%% 噬菌体单链抗体的特异性检测结果用 ELISA 测定纯化 scfv 抗体的免疫活性, 结果显示其具有针对 EGFRvⅢ 的特异性, 能与 pep-3 结合, 而不与 OVA 结合 (P<0.05, 图 6) 3%% 讨论 ScFv 是由重轻链可变区通过连接子连接而构成的小分子抗体, 其免疫原性低组织穿透力强体内循环半衰期短易于基因工程制备和改造, 是目前肿 D450 kd 图 5%%%SDS-PAGE% 检测 scfv 表达与纯化 1: 蛋白质 Marker,2:IPTG 诱导大肠杆菌 E.coli HB2151 的表达产物 ;3: 纯化的 scfv 抗体 pep-3-ova%%%%%%%%%%%%%%%%ova%%%% pep-3-ova 或 OVA PBS 图 6%ELISA 检测单链抗体与 EGFRvⅢ 的结合特异性 [5] 瘤靶向治疗中应用较为广泛的基因工程噬菌体抗体库技术的出现为 scfv% 的制备提供了便捷有效的途径, 使基因工程抗体可以不经过杂交瘤而直接从免疫动物或人体淋巴细胞中获得抗体基因并表达, 避免了单克隆抗体制备的复杂过程, 也促进了抗体人源化的

5 第 1 期韩东刚, 等. 抗表皮生长因子受体 Ⅲ 型突变体噬菌体单链抗体库的构建与初步筛选 29 [6] 发展噬菌体抗体库技术虽然有着很多优点, 但在实际操作中仍有一些值得注意的方面首先, 免疫原的选择很重要我们根据 EGFRvⅢ 特异性融合位点的 cdna 序列, 合成包含突变融合区的短肽链 ( 又称 pep-3) 作为半抗原由于短肽链的免疫原性差, 我们将 pep-3 与载体蛋白 OVA 偶联, 以此偶联物作为完全抗原来诱导机体产生抗体实验结果表明该偶联蛋白能刺激机体产生高效价抗体在进行 ELISA 检测抗体时, 我们将 pep-3 与另一种载体蛋白 BSA 进行偶联后包被 96 孔培养板, 目的是减少抗体对包被原的非特异性结合, 提高分析的特异性其次, 抗体可变区 PCR% 引物的设计非常重要, 应尽可能保持亲本抗体可变区序列的完整性和真实性抗体重链可变区 (VH) 和轻链可变区 (VL) 基因分别由相对保守的骨架区 (FR) 和能够根据不同抗原做出相应变化的抗体互补决定区 (CDR) 组成虽然抗体分子可变区有着数量巨大的多样性, 但其骨架区的序列和前导序列相对保守, 通过采用简并引物, 可以扩增出多样性的抗体基因本研究从免疫动物的脾脏提取总 RNA, 在设计可变区引物时参考了 Wang [7] [8] 和 Essono% 的工作,5' 端引物根据抗体 FR1 及部分前导区的保守序列设计,3' 端依据抗体绞链区 (J 区 ) 的保守序列设计连接方面, VH2 正向引物的 3' 端和 Vκ2% 反向引物的 5' 端分别和 Linker% 序列的两端互补由于 κ 链占小鼠抗体轻链 95% 以上, 因此, 扩增 VL% 时只使用了 κ 链的引物此研究中, 我们利用噬菌体表面展示技术获得了库容为噬菌体单链抗体库从理论上讲, 库容越大, 从抗体库中筛选到高亲和力抗体的机会就越大但是, 我们建立的是包含 EGFRvⅢ 特异性突变融合区的免疫抗体库, 这一过程使目标抗体在体内经过了抗体亲和力的成熟, 其特异性 mrna 的丰度会比未经免疫的小鼠高很多, 因而不需要很大的库容就可从该抗体库中筛选到针对 EGFRvⅢ 的单链抗体, 致使抗体库制备和筛选过程相对简化我们将获得的单链抗体进行基因测序和序列分析, 结果与预期相符 SDS-PAGE 及 ELISA 法检测表明筛选得到的抗体片段与 EGFRvⅢ 抗原具有特异性结合活性综上所述, 本研究采用噬菌体展示技术, 构建了抗 EGFRvⅢ 噬菌体 scfv 库, 并筛选获得特异针对 EGFRvⅢ 的单链抗体, 下一步将对此单链抗体进行生物学修饰, 研究其抗肿瘤效应参考文献 : [1] Sihto%H,%Puputti%M,%Pulli%L,%et%al.%Epidermal%growth%factor%receptor% domain%Ⅱ,%Ⅳ,%and%kinase%domain%mutations%in%human%solid%tumors [J].%J%Mol%Med,%2005,%83(12):% % [2] Pedersen%MW,%Tkach%V,%Pedersen%N,%et%al.%Expression%ofa%naturally% occurring%constitutively%active%variant%of%the%epidermal%growth%factor% receptor%in%mouse%fibroblasts%increases%motility [J]. %Int%J%Cancer,% 2004,%108(5):% [3] Ning%Y,%Zeineldin%R,%Liu%Y,%et%al.%Down-regulation%of%integrin%alpha2% surface% expression% by% mutant% epidermal% growth% factor% receptor% (EGFRv Ⅲ ) % induces% aberrant% cell% spreading% and% focal% adhesion% formation[j].%cancer%res,%2005,%65(20):% % [4] Heimberger% AB, % Crotty% LE, % Archer% GE, % et% al. % Epidermal% growth% factor% receptor% V Ⅲ peptide% vaccination% is% efficacious% against% established%intracerebral%tumors[j].%clin%cancer%res,%2003,%9(11):% [5] Filpula%D. %Antibody%engineering%and%modification%technologies [J].% Biomol%Eng,%2007,%24(2):% % [6] Thie%H,%Meyer%T,%Schirrmann%T,%et%al.%Phage%display%derived%therapeutic% antibodies[j].%curr%pharm%biotechnol,%2008,%9(6):% % [7] Wang%Z,%Raifu%M,%Howard%M,%et%al.%Universal%PCR%amplification%of% mouse% immunoglobulin% gene% variable% regions: % the% design% of% degenerate% primers% and% an% assessment% of% the% effect% of% DNA% polymerase%3'%to%5'%exonuclease%activity [J]. %J%Immunol%Methods,% 2000,%233(1-2):% % [8] Essono%S,%Frobert%Y,%Grassi%J,%et%al.%A%general%method%allowing%the% design% of% oligonucleotide% primers% to% amplify% the% variable% regions% from% immunoglobulin% cdna [J]. % J% Immunol% Methods, % 2003, % 279 (1-2):% %

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌