天净沙系列CAT#: 低温运输,-20 保存克必隆 ets cdna 文库构建试剂盒 ets cdna Library Construction Kit 使用手册 V1.0 北京天恩泽基因科技有限公司北京市海淀区上地信息路 26 号北京市留学人员海淀创业园中关村创业大厦 506

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庸苗
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天净沙系列CAT#:130407-1 低温运输,-20 保存克必隆 ets cdna 文库构建试剂盒 ets cdna Library Construction Kit 使用手册 V1.

1 天净沙系列CAT#: 低温运输,-20 保存克必隆 ets cdna 文库构建试剂盒 ets cdna Library Construction Kit 使用手册 V1.0 北京天恩泽基因科技有限公司北京市海淀区上地信息路 26 号北京市留学人员海淀创业园中关村创业大厦 506 网址 : 电话 : ; 电邮

2 产品及特点传统的 Template Switch(TS) 技术, 也称 SMART 技术, 是指一种高效合成全长 cdna 的技术, 它利用 MMLV 逆转录酶的末端转移酶及模板自动转换功能, 合成全长 cdna 本公司 ets 技术是在 TS 基础上对 TS 引物进行了重大改进优化, 极大降低了背景, 具有更强的专一性本试剂盒是基于 ets 技术的 cdna 文库构建试剂盒, 它具有下列特点 : 1. 高效合成全长 cdna 文库, 不需要 Adaptor 的连接 2. 灵敏度高, 最低只需纳克级总 RNA 3. 一管式操作 ( 快捷 ) 或者两管式操作 ( 保真性高 ) 均可 4. 得到全长的 cdna 文库, 也不需要 Adaptor 的连接规格及成分成份编号规格本产品套使用手册 1 份运输及保存低温运输,-20 保存, 有效期一年使用方法 A. 第一链 cdna 合成 1. 在 0.5-ml 离心管中混匀以下试剂 : 1 3 μl RNA 样本 1 μl ets Oligonucleotide 1 μl ets 3 PCR Primer 如果总体积 <5 μl 时, 用水补齐至 5 μl 2. 混匀试剂并瞬时离心孵育 2 min 冰上冷却 2 min 4. 瞬时短暂离心 5. 向每管反应中加入以下试剂 : 2.0 μl 5 First-Strand Buffer 1.0 μl DTT (20 mm) 1.0 μl dntp Mix (10 mm) 1.0 μl ets MMLV Reverse Transcriptase 10.0 μl 总体积 6. 使用枪轻柔地混匀试剂, 并瞬时离心 C 孵育 1 hr 所得 cdna 可通过 PCR 法 ( 步骤 B) 或引物延伸合成

3 法 ( 步骤 C) 合成 ds cdna 采用步骤 C 的话, 需要先向反应管中加入 1 μ L 氢氧化钠,68 孵育 30 min, 然后再进入步骤 C B. PCR 法扩增合成 cdna 1. 在一个新的 0.5-ml 离心管中混匀以下试剂 : 2 μl First-Strand cdna (from A 节第 7 步 ) 80 μl H 2 O 10 μl 10 PCR Buffer 2 μl 50 dntp Mix 2 μl 5' PCR Primer 2 μl ets 3' PCR Primer 2 μl 50 Polymerase Mix 100 μl 总体积 2. 使用枪轻柔地混匀试剂, 并瞬时离心 3. 如果需要可以向管中加 2 滴矿物油, 盖上管盖, 置于预热 (95 ) 的 PCR 仪器中 4. 以下程序选择一种进行扩增 : 体系 A 95 1 min x cycles*: 体系 B sec x cycles*: sec 95 5 sec 68 6 min 68 6 min * 根据 RNA 样品的情况选择下表中最优循环数 : 总 RNA(μg) Poly A + RNA(μg) 建议循环数取 5μL 产物在 1.1% 琼脂糖 /EtBr 胶上进行检测 6. 然后进入步骤 D C. 引物延伸法扩增 ds cdna

4 1. 混匀以下试剂 : 11 μl First-Strand cdna (from A 节第 8 步 ) 71 μl Deionized H 2 O 10 μl 10 PCR Buffer 2 μl dntp Mix 2 μl 5' PCR Primer 2 μl ets 3' PCR Primer 2 μl 50 Polymerase Mix 100 μl 总体积 2. 使用枪轻柔地混匀试剂, 并瞬时离心 3. 如果需要可以加 2 滴矿物油, 盖上管盖后置于预热 (95 ) 的 PCR 仪器中 4. 以下程序选择一种进行扩增 : 体系 A 体系 B 72 C 10 min 72 C 10 min 95 C 1 min 95 C 20 sec 3 cycles: 3 cycles: 95 C 15 sec 95 C 5 sec 68 C 8 min 68 C 8 min 5. 取 5μL 产物在 1.1% 琼脂糖 /EtBr 胶上进行检测 D. 蛋白酶 K 消化 1. 向 0.5-ml 无菌管加入用 PCR 法或引物延伸法得到的 50 μl 扩增后的 ds cdna(2 3 μg) 和 2 μl 蛋白酶 K (20 μg/μl) 将剩余 ds cdna 置于 20 保存 2. 混匀试剂并瞬时离心孵育 20 min, 瞬时离心 4. 加入 50 μl Deionized H 2 O 5. 再加入 100 μl 酚 : 氯仿 : 异戊醇, 轻柔地连续颠倒 1 2 min 6. 14,000 rpm 离心 5 min 7. 将最上层液体 ( 上清液 ) 转移到 0.5-ml 干净的管 8. 加入 100 μl 酚 : 氯仿 : 异戊醇, 轻柔地连续颠倒 1 2 min

5 9. 14,000 rpm 离心 5 min 10. 将最上层液体 ( 上清液 ) 转移到 0.5-ml 干净的管 11. 加入 10 μl 3 M 醋酸钠, 1.3 μl 糖原 (20 μg/μl) 和 260 μl 室温 95% 乙醇, 立即进行 14,000 rpm 室温离心 20 min 12. 小心去除上清液 μl 80% 乙醇清洗 14. 空气干燥 (~10 min) 来挥发残留的乙醇 15. 加入 79 μl Deionized H 2 O 重悬 DNA E. SfiI 酶切 1. 在 0.5-ml 离心管中混匀以下试剂 : 79 μl cdna ( 上节第 15 步 ) 10 μl 10 Sfi Buffer 10 μl SfiI Enzyme 1 μl 100 BSA 100 μl 总体积 2. 混匀并在 50 孵育 2 hr 3. 加入 2 μl 1% 二甲苯腈蓝, 混匀 F. cdna 分选 1. 标记 16 个 1.5-ml 离心管, 按顺序摆放在管架中 2. 准备 Tiandz-400 纯化柱 : a. 室温放置纯化柱 1 hr 然后颠倒数次混匀胶质 b. 赶走纯化柱中的气泡, 使用 1000-μl 移液器轻柔地重悬胶质去除底盖让液体滴落 c. 将纯化柱放置在环形支架上 d. 借助重力将柱中存储液排干 ( 胶质的顶端应该处于柱外表面 1.0-ml 标记处 ) e. 流速 ~1 滴 /40 60 sec, 每滴体积 ~40 μl 3. 当存储液排干后, 加入 700 μl 柱纯化缓冲液并将其排干

6 4. 向胶质中央加入 ~100 μl SfiI 消化后的 cdna 和二甲苯腈蓝混合液 ( 来于上节第 3 步 ) 5. 当样本被胶质完全吸收后再进行下一步骤 6. 向胶质中央加入 100 μl 缓冲液清洗纯化柱 7. 排干缓冲液, 胶质表面不能有液体残留当无液体滴落时, 再进行下一步骤 8. 将步骤 1 中离心管放置在纯化柱下方, 使标记 1 的管对准纯化柱下方液体出口处 9. 加入 600 μl 缓冲液后立即使用管 1 16 分别收集连续的 1 滴液体 ( 每管 ~35 μl) 10. 从 16 管中各取 3 μl 在 1.1% agarose/etbr gel 上 150 V. 电泳 10 min 检测分析将最能代表实验样本 cdna 大小范围的头 3-4 滴所对应管中的样本合并到一管 11. 向管中加入以下试剂 : 1/10 vol. Sodium Acetate (3 M; ph 4.8) 1.3 μl Glycogen (20 mg/ml) 2.5 vol. 95% ethanol ( 20 C) 12. 前后轻柔地摇晃管使试剂混匀或干冰 / 乙醇中放置 1 hr ,000 rpm 室温离心 20 min 15. 小心吸掉液体 16. 短暂瞬时离心 17. 小心洗掉液体, 然后空气干燥 ~10 min 18. 加入 7 μl Deionized H 2 O 重悬 DNA 颗粒 G. cdna 连接载体 1. 标记 3 个 0.5-ml 离心管, 并向管中分别加入下表中所列试剂混匀并瞬时离心成分 1 st ligation(μl) 2 nd ligation(μl) 3 rd ligation(μl) cdna(from F.18)

7 Vector(500ng/ul) ligation Buffer ATP (10 mm) T4 DNA Ligase Deionized H 2 O 总体积孵育过夜 3. 直接进行转化 4. 3 个连接体系可获得 e6 个单克隆未扩增的文库在 4 可保存 2 weeks 5. 如果文库 <1 2 10e6 克隆, 可将剩余的 cdna 进行连接载体使用表中 cdna 和载体比例重复连接反应能够收获最好的结果 ; 也可以根据 cdna 的使用量来扩大体系来做连接再进行包装反应和滴度测定实验 6. 为了提高文库的稳定性, 首先将步骤 G.4 中包装反应物合并, 然后对文库进行扩增扩增后的文库 4 C 可放置 6 7 months, 或在 70 (in 7% DMSO) 可放置 1 年关联产品克必隆 ets 核心试剂盒 ( 产品编号 :130412)

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