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1 浙江大学学报 医学版 年 月 '#9 % +,--- )&'.!#( $)' *' / * 0 /) "( 专题报道 人源性抗乳腺癌 2 噬菌体单链抗体库的构建与筛选 卢晓辉 王志文 蔡 颖 黄 静 朱丽华 杨清玲 陈昌杰 蚌埠医学院临床检验诊断学实验中心 安徽蚌埠 蚌埠医学院生物化学与分子生物学教研室 安徽蚌埠 河南大学淮河医院检验科 河南开封 0 摘 要 目的 构建人源性抗乳腺癌噬菌体单链抗体 ( < 库 筛选和鉴定抗乳腺癌人类表皮生长因子受体 2 特异性 ( < 为 2 和 6 6 趋化因子受体 6 6 双靶向融合蛋白的研制提供靶向 2 的高亲和力序列 方法 取已确诊的乳腺癌患者癌旁淋巴组织 提取总 构建可变区基因的 载体库 将重链可变区 2 和轻链可变区 基因与,6 连接肽连接 获得,6 ( < 电转化感受态大肠杆菌 7 以 辅助噬菌体进行感染 获噬菌体抗体库 利用酶联免疫吸附试验 1 检测筛选后获得的噬菌体抗体活性 以免疫组织化学法检测抗体亲和力 并通过测序进一步鉴定 结果 成功构建大容量,6 ( < 抗体库 获得的 ( < 长度为 0 ;, 2 和 长度分别为 0 和 ; 电转化大肠杆菌 7 后酶切验证插入片段大小正确 得到库容为 的大容量抗体库 通过噬菌体展示和淘洗筛选 富集针对乳腺癌细胞株 1 表面抗原的抗体库 所得抗体对 2 有高度的亲和力和特异性 对乳腺癌组织 2 抗原也具有较高的亲和力 测序结果与人 7 抗体进行对比 所获得的 ( < 具有高度的人源性 结论 主要构建了大容量人源性抗乳腺癌细胞的噬菌体 ( < 库 并筛选获得可特异性识别人乳腺癌 2 的高亲和力 ( < 为制备以 2 为靶点的抗肿瘤 2 和 6 6 双靶向融合蛋白提供了载体 关键词 乳腺肿瘤 / 免疫学 互补 / 遗传学 基因文库 抗体 细菌 / 遗传学 细菌噬菌体 / 遗传学 受体.; 受体 6 6 聚合酶链反应 中图分类号 文献标志码!! ' 1* $ " $! #!2 % % " $# % 收稿日期 接受日期 基金项目 国家自然科学基金 安徽省自然科学基金 02 安徽省教育厅自然科学重点研究项目 作者简介 卢晓辉 男 硕士研究生 主要从事肿瘤分子生物学研究!"# & 通讯作者 陈昌杰 男 博士 教授 硕士生导师 主要从事肿瘤分子生物学研究!"#+& % %! )" & 杨清玲 女 硕士 教授 硕士生导师 主要从事肿瘤分子生物学研究!"# 9 #"" &

2 卢晓辉 等 人源性抗乳腺癌 2 噬菌体单链抗体库的构建与筛选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乳腺癌是一项世界性的健康难题 每年大约有 0 万人死于乳腺癌 人类表皮生长因子受体 %'!,"*.!#.&-+%! +&..,+&. 2 是一种具有受体酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白? 的乳腺癌患者 2 高表达 2 过表达提示乳腺癌肿瘤的恶性程度高 病情进展迅速 易复发 易发生肿瘤转移 是乳腺癌预后不良的指标 我们前期研究发现 6 6 趋化因子受体 6 6 是乳腺癌诊断和治疗新的标志分子 与乳腺癌中 2 的表达呈正相关 两者协同促进乳腺癌的肺转移 同时具有 及 交叉的信号通路 0 设计 2 和 6 6 受体双靶向的融合蛋白 可以更有效地富集到癌症病灶部位 发挥抗乳腺癌作用 单链抗体 (" # %!".! +&<!."!;#. "& ( < 是一种可以与抗原结合域结合的最小片段的免疫球蛋白分子 是通过一小段连接肽 #". 将抗体的重链可变区 <!."!;#. "& &%!<9 %!" 2 和轻链可变区!."!;#. "& &#" %+ %!" 连接而成 由于抗体的多样性 为获得与细胞膜表面 2 抗原有较高亲和力的 ( < 本研究以已确诊的乳腺癌患者癌旁淋巴组织为研究对象 利用噬菌体展示技术制备人源性抗乳腺癌 2 噬菌体 ( < 库 并进行筛选和序列鉴定 为构建

3 浙江大学学报 医学版 &'.!#& % )"! "<.("+9 *"!#1 " ( 2 和 6 6 双靶向融合蛋白提供针对 2 的抗体序列 材料与方法 材 料乳腺癌患者手术切除的癌旁淋巴结标本来自于蚌埠医学院第一附属医院,6 0 载体购自浙江大学生命科学学院 辅助噬菌体 连接酶购自美国 公司 辣根过氧化物酶 2 标记抗 单克隆抗体购自北京维食安生物技术有限公司 2 单克隆抗体购自 9 * 公司 6 扩增引物和 连接肽来自宝生物工程 大连 有限公司 '" # +.! +"& 试剂盒购自 7 公司 * 逆转录 6 总 用."$&# 法从淋巴结组织中提取 的获得按照逆转录试剂盒说明书进行操作 在 # 的反应体系中加入 B0 的总 为保证扩增片段的多样性能达到最大化 采用网格筛选法对下列引物进行交叉配对 反应体系分为三组 即重链可变区 2 组 轻链可变区 和 组 2 组的 6 程序是 0 0 " (0 ( ( 个循环 " 和 组基因扩增 6 反应条件 0 0 " (0 ( ( 个循环 " 6 产物进行琼脂糖凝胶电泳 洗脱用 '" # +.! +"& "+ 2 引物 正义链 2' 2 ;! 0L + +!! +!!+! +! + +! + + L2' 2 ;! 0L + +!! +!!+! +!! +!! +! L2' 2 ;! 0L + +!! +!!+! +! + +! + + L2' 2 ;! 0L + +!! +!!+! +! +!! + L2' 20 ;! 0L + +!! +!!+! +! + +! + + L2' 2 ;! 0L + +!! +!!+! +!! +!!! + + L 2 引物 反义链 2' 2 &.-!.* 0L +!!!! +!!+ + L 2' 2 &.-!.* 0L +!!! +!! + L 2' 2 &.-!.* 0L +!!! +!! + L 2' 2 &.-!.* 0L +!!! +! + + L 引物 正义链 2' ;! 0L +!!!+ +!+!! + + L 2' ;! 0L +!!+ + +!+! +! + + L 2' ;! 0L +!!!!+ + +!! + + L 2' ;! 0L +!!!+!!+!! + + L 2' 0 ;! 0L +!!!!!! +!! + + L2' ;! 0L +!!! + + +! +! + + L 引物 反义链 2' &.-!.* 0L! +!+ +! +! +!+! + + L2' &.-!.* 0L! +!+ +! +! +!+ +! + + L2' &.-!.* 0L! +!+ +! +! +!+!+! + + L 2' &.-!.* 0L! +!+ +! +! +!+ +! + + L2' 0 &.-!.* 0L! +!+ +! +! +!!+ +! L 引物 正义链 2' ;! 0L +!! !! L 2' ;! 0L +!! + + +! +!! L 2' ;! 0L +! + +!+ + +! +!! L 2' ;! 0L +! + + +! +! +!! L 2' 0 ;! 0L +!! +!+! +! +!! L 2' ;! 0L +!! + + +! +! + L 引物 反义链 2' &.-!.* 0L! +!+ +! +! +!! +! + + L 2' &.-!.* 0L! +!+ +! +! +!! +! + + L 2' &.-!.* 0L! +!+ +! +! +!!!! +! + + L 连接肽 $ ;$# & +, ( < 的构建 用于构建 ( < 的 2 和 基因经连接后 用限制性内切酶 和 + 酶切后 连接入噬菌粒载体,6 0 中 得到的重组噬菌体,6 0( < 电转化大肠杆菌 7 转化后产物加入 # 含? 葡萄糖的 培养基中 震荡培养 % 取少量菌液涂布于含? 葡萄糖和 /# 氨苄青霉素的 1 琼脂平板上 培养箱孵育过夜 挑取分隔良好的单克隆于 培养基培养 一部分培养物加入 7 培养基稀释至 波长处吸光度值为 B 进行后续的筛选 其余加入甘油 保存于 冰箱备用

4 卢晓辉 等 人源性抗乳腺癌 2 噬菌体单链抗体库的构建与筛选 - 噬菌体救援用辅助噬菌体 感染来进行噬菌体救援 在上一步的培养物中加入辅助噬菌体至感染复数 值为 然后静置孵育 % 震荡孵育 %./" 半径 0 室温离心 " 用 # 培养液轻柔重悬菌体 0./" 孵育过夜 培养物再次室温 离心 " 上清液中含有重组噬菌体颗粒 上清液中加入聚乙二醇氯化钠溶液沉淀 冰浴 %./" 半径 0 离心 " 弃上清液 沉淀用 培养基重悬 滴度由后续的筛选实验确定 得到 ( < 抗体库溶液. 噬菌体 ( < 抗体的富集 筛选和鉴定取 # 经稀释的初级噬菌 ( < 体抗体库溶液 先用低表达 2 受体的乳腺癌细胞株 6 进行吸附 随后以约 个高表达 2 的乳腺癌细胞株 1 细胞室温孵育 % 预冷 1 三轮洗涤细胞 加入 0 # 洗脱液 &#/ 甘氨酸,2 B0 冰浴 0 " 离心取上清液 加入 &#/,2."(2 # # 中和至,2 0 再加入大肠杆菌 7 约 培养 % 取部分稀释梯度涂布于 1 7 固体培养基 过夜 计算菌落 其余部分菌液加入辅助噬菌体 继续进行培养 进入第二轮筛选 共进行四轮淘筛 最后一轮筛选的菌液稀释后涂于 1 7 平板 过夜培养 随机挑取 个菌落 每个加入 0 # 7 培养液培养 提取质粒 分别用限制性内切酶 和 + 进行双酶切? 琼脂糖凝胶电泳鉴定 酶联免疫吸附试验 1 验证 ( < 抗原结合活性包被人 2 受体于 1 板 0 /# 每孔 # 过夜 加入含 0? 1 的 1 封闭液室温封闭 % 加入 ( < 室温孵育 % 弃去液体 1 洗板后每孔加入 2 标记的抗 单克隆抗体溶液 室温孵育 % 弃板内液体 洗板几次 加入 室温显色 加入 &# 硫酸终止反应 从最后一轮筛选的平板上随机挑选 个单克隆 制备单克隆抗体溶液并浓缩 2 标记的抗 单克隆抗体为二抗 检测 0 波长处吸光度值 以吸光度值大于 且高于阴性对照 倍为阳性结果 ( < 的免疫组织化学验证 利用免疫组织化学法验证 ( < 抗体结合 2 抗原活性 以筛选并富集的 ( < 溶液为实验组 稀释的 2 标记的抗 单克隆抗体作为二抗检测 ( < 以细胞膜呈现棕黄色为阳性 按照美国食品药品监督管理局推荐的染色强度分级为 未着色或小于? 肿瘤细胞膜着色 大于? 肿瘤细胞膜呈不完整着色或弱着色 大于? 肿瘤细胞膜呈中度着色 大于? 肿瘤细胞膜强完全着色 其中 B 为阴性表达 B 为阳性表达 随机选择 0 个视野 共计数 个细胞 计算阳性率 以商业化 2 抗体为阳性对照组 以确定的 2 不表达乳腺癌组织为阴性对照组 抗 2 ( < 基因的核酸分析含有 ( < 的重组噬菌体载体送生工生物工程 上海 股份有限公司测序 用 6 7! 2& &#& 9 进行搜寻比对 蛋白序列在 1 上进行比对 * 结 果 * 可变区基因的扩增琼脂糖电泳结果显示 经过 6 扩增 成功克隆出长度分别为 0 ;, 的 2 基因片段和 ;, 的 特异性基因片段 并正确引入酶切位点 见图 B * * 抗 2 ( < 基因的鉴定经过拼接 所得的拼接产物在 0 ;, 处有明显的特异性条带 符合 ( < 片段大小 表明本实验成功构建了抗 2 的 2#". ( < 基因片段 插入率约? 见图 *, ( < 库的建立和筛选电转化后稀释 倍 的培养平板上每块得到的菌落数目在 B 个 经估算 转 标志物 B 2 基因产物图 2 片段的凝胶电泳分析 # +.&,%&. ("(& 2.! +(;9 6

5 & $*'& (( ( 9? XO7 A?R?! S B I? " 浙江大学学报! 医学版" [ ((测定每轮筛选的投入和产出的噬菌体量的结 果显示#随着淘洗次数的增加#噬菌体产出率从第 一轮的 *b! m#" 0& 提升至第四轮的 *b& m#" 0$ # 说 * 乳腺癌细胞表面抗原的特异性 明携带抗 I+-N% 抗体得到了富集! 表 #" ) ((S% MJ#""" 标志物$ # f#"% ^k 基因产物 图 B^k 片段的凝胶电泳分析 B1 D7 X^k X 2? YZTN * 细胞特异性 \`的富集结果 表 <抗 I+-N% K,72 )<1? 72? XD7? Y B? I+-N% * X 2 7 Y 富集轮数 投入噬菌体 收获噬菌体 收获率 $ # # m#" ## *b! m#" H *b! m#" 0&! # m#" ## $b) m#" H $b) m#" 0& # m#" ##!b" m#" &!b" m#" 0H # m#" ## *b& m#" ) *b& m#" 0$ * $ (( $ 收获率 h收获噬菌体滴度 G 投入噬菌体滴度. B. \`与 P1N! 抗原结合活性的测定 ((S% MJ#""" 标志物$ # f#"% ^.基因产物 图 D^.片段的凝胶电泳分析 D1 D7 X^.X 2? YZTN 1J] IL法结果显示#除了 $,' 和 #"#其他克隆 均达 到 阳 性 标 准# 说 明 抗 体 具 有 良 好 结 合 活 性!图 &") 免疫组织化学法进一步 验 证 \`与 P1N! 抗原的结合活性结果显示# 所筛选获得的 \`与细胞膜表面 P1N! 抗原有较高亲和力% 以 商业 化 P1N! 抗 体 为 阳 性 对 照 组# 阳 性 率 为 'Hc$以确定的 P1N! 不表达乳腺癌组织为阴性 \`阳性率为 H&c 对照组#发现筛选并制备的! 图 )" ) ((S% MJH""" 标志物$ # f#"% 酶切产物 \`重组单克隆酶切鉴定 图 E EL? X 2Y?? \`? Y??B?9? 化子约为 *b" m#" ' # 插入率为 '"c# 则得到的实 B. S筛选后 \`核酸序列分析 选取结合活性最高的单克隆抽提质粒进行测 &. 序分析) 结果显示# 在酶切位点 )! 和 +*!之 间的 \`片段全长约 )H" YD#其中 ^J长 **" YD# 编码 ##" 个氨基酸$^P 长 *)H YD# 编码 #!H 个氨 ' 际库容量为!b$ m#" ) 见图 H) 基酸$ 连接肽为一条 #H 个氨基酸的多肽片段# 基 B. E抗 I+-N% * 细胞特异性 \`的富集 因序列中无终止密码子突变 # 开放阅读框架完整 ((L%稀释 #" 倍涂板$ -%稀释 #"" 倍涂板$ T%稀释 #""" 倍涂板$ M%阴性对照. 图 电转化后 _U# 的细菌生长情况 _U# D?k B E 7 IQ-LU X D?

6 卢晓辉#等.人源性抗乳腺癌 P1N! 噬菌体单链抗体库的构建与筛选 & $*/& IL法检测 \`与 P1N! 抗原结合活性 图 S1J] SL? X 7 Y?B? Y X \` P1N! D Y1J] IL \`测序和翻译结果分析 图 \ \I ;9???B?? 9 X \` ((L,M,U%乳腺癌组织$ -,T%验证筛选的 \`的结合活 性$ 1,\%商业化抗体作为阳性对照$ P,] %P1N! 阴性的乳 腺癌组织作为阴性对照! P1染色#L,M,U m$"#-,1,p m #""#T,\,]m$""". \`抗体活性 图 Z利用人乳腺癌病理组织标本检测 Z_7 B? X \`? Y B Y 9?Y? 9.! P1?? # L# M# U m$"$ -# 1 m#""$ T# \ m#""" \`^P的 -JLI_比对结果 图 ] ]_7 9 X^P X \`Y-JLI_ 全长 $$ YD#其后有一个琥珀终止密码 正确$1% 子 _LU! 图 ' " ) 将测序结果与基因库的 -JLI_ 在线数据库进行比对分析# 发现筛选出的 ^P 序 列属于 ] 超家族成员#与 ] 重链可变区框架相似 率达 ))c#^j序列与 ] 轻链 /链 ^% 区域框架 相似率达 /!c#见图 /,#") \`^J的 -JLI_比对结果 图 <^ <^_7 9 X^J X \`Y-JLI_ \`作为一种重要的基因工程抗体因具有 D讨论 分子量小,穿透性强,易于进入靶组织等特点适于 乳腺癌是目前威胁女性健康常见的恶性肿 临床诊断和治疗 '#"( #并可降低异源性抗体的免疫 瘤#常规的治疗和手术很难控制病情的发展#因此 反应 '##%#!( ) 淋巴转移是乳腺癌最常见的转移方 迫切需要寻找新的能更有效地治疗乳腺癌的手 式#相对于采用患者外周血淋巴细胞构建的噬菌 段 ''( ) 分子靶向治疗在 P1N! 阳性的乳腺癌患者 体抗体库更易筛选到高亲和力的抗体) 本研究选 中已经取得很好的疗效) 近些年针对 P1N! 基因 择乳腺癌患者癌旁淋巴组织来构建抗乳腺癌 \` 的靶向治疗吸引了越来越多的注意 '/( ) 基因#有助于提高 \`的敏感性和特异性# 并注

7 浙江大学学报 医学版 &'.!#& % )"! "<.("+9 *"!#1 " ( 重筛选不同病理类型及 2 阳性的乳腺癌患者 增加了抗乳腺癌 ( < 基因的多样性 有利于扩大抗乳腺癌噬菌体 ( < 库容量 同时 我们采用电转化得到的人源性噬菌体 ( < 具有较高的插入率 至少? 抗体库库容达 为下一步的筛选提供了良好基础 在筛选步骤中 本研究采用先低后高的洗涤力度 如低表达 2 的乳腺癌 6 细胞和高表达 2 的乳腺癌 1 细胞 低洗涤力度作为阴性筛选保证低丰度的噬菌体抗体不丢失 高洗涤力度作为阳性筛选有利于得到高亲和力的噬菌体抗体 0 噬菌体回收率的逐渐提高是对特异性抗体富集的表现 本研究以 1 细胞反复洗涤离心的方法富集特异性抗体 经过四轮富集筛选收获率明显递增 提高 倍 利用 1 法对抗体进行初步筛选 结果 个克隆达到阳性标准 且所筛选获得的 ( < 与细胞膜表面 2 抗原有较高亲和力 经测序和比对分析 说明本研究针对来自临床乳腺癌转移淋巴结的 2 1 < 抗体库成功制备 本研究基于噬菌体展示和抗体库技术获得的 2 1 < 库对 2 抗原具有靶向性 可用于后续 2 和 6 6 受体融合蛋白的制备 参考文献 !# % #" "!#",! +! * &'+ & (&" ' &%"(+& % "(+.9 & #9 +!(+!("(" ;.!(+!. # / % ;!(" ;"&#& 9&2 1',,# !# 1 # +"<! +",.&#".!+"& &%.,&("+"< ;.!(+!. #(;9! +%& 9! " ("* +"" * ;9%" %+%.&' %,'+(. " 0 2. ( +! * '+'. <&#'+"& &!*<! * ;.!(+!.+%.!,9 ) 1 1',,#1 0 陈昌杰 章 菊 杨清玲 等 6 6 的抑制性多肽对乳腺癌细胞 6 6 和 2 表达及 2 6 药物敏感性的影响 中国组织化学与细胞化学杂志 %! )" 2 7 ' 7 " #" +!# % +&" %";"+&.9,&#9,,+"* &6 6 & +%,. ("& &6 6! * 2 &;.!(+!. #(! * +% ( ("+"<"+9&%.,+" $ /! $# " " $# " 0 " 6%" ( !# + +"& &* &9 "<!# &#;!( * &!(" # %!".! + <!."!;# &+%! +"* &9 "<!# &#! +";&*9 0 0 % !# 6& (+.' +"& &(" # %!" <!."!;#.! + ( <! * "( <!#!#",%&(,%!+!( '("&,.&+ " &. * + +"& &! "#'(! +%.! "( $# 16 +!# &(&2!,#""!+"& &#&-" +.!(+'$'!; ;!( * &!*)'<! + (9(+ " +%.!,9! * ('.<"<!# &'+ & ( 1 0 M !# 6%!.! +."(!+"& &+' &.!#!..( &. #!+ * -"+%.; 2 / ' &<.,. ("&! * +!(+!("(" ;.!(+!. # 7 1 2" %!" "+9%'!! +";&*" (;9,%! *"(,#!9 # % !# ++. *("! +";&*9;!( * & &#& " "! " %! *"(,#!9 &,+ " &<!+"& (!,,#"!+"& (! * '+'. ) $ !# 1, "" "+9. ( '! *!" "+9!+'.!+"& &!#&-!" "+9! +";&*9!!" (+,.&!(+.". #!(",,+"* '(",%! *"(,#!9! * (%' #" #) !# ". + * " <"+.& <&#'+"&! *.9(+!#&.!,%"!!#9("(&!,,+"* ;" *" (" # %!"! +";&*9.! + ( < -"+% #&-," & &#!.!" "+9 / ) $# 0 7 '+!+"& ",!,"#!.9 +%9.&"*!.,!+%& ".&# &# '#!. ;!( (! * #" "!#",#"!+"& ( 12 本文编辑 沈 敏 蒋婉洁

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