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不伍
5 years ago
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文献参考 epmotion 5075 如何出色地完成 96 通量的质粒抽提和 PCR 产物的纯化工作 Eppendorf epmotion 5075 VAC 是新一代的全自动分子生物学工作站, 能够实现高通量核酸分离纯化的无人操作, 同时也是高通量操作实验室最佳的移液操作平台本文详细描述了 epmotion 5075 VAC

Perfectprep Plasmid 96 Vac Direct Bind Kit 96- 克隆的质粒文库,IRAT-1( 来自 Mammalian Gene Collection) 单克隆 - psv- β-galactosidase, 宿主菌为 TOP10 工作站操作流程收集的菌体直接置入 epmotion 5075 VAC

2 ml LB 培养基含 50μg/ml 氨卞青霉素, 然后用 96 针式接种复制器接种, 接种源为甘油保存的冻存文库接种后的培养板在 37 300 rpm 摇床中过夜培养 18 个小时培养板在 1900 g 的离心力下离心 5 分钟, 去上清, 收集菌体, 倒置在吸水纸上除去残余的培养液图 1: epmotion Editor

1 文献参考 epmotion 5075 如何出色地完成 96 通量的质粒抽提和 PCR 产物的纯化工作 Eppendorf epmotion 5075 VAC 是新一代的全自动分子生物学工作站, 能够实现高通量核酸分离纯化的无人操作, 同时也是高通量操作实验室最佳的移液操作平台本文详细描述了 epmotion 5075 VAC 工作站在提取 96 个样品的质粒 DNA BAC DNA 以及 PCR 产物的纯化三个高通量实验的应用, 对抽提和纯化的核酸得率质量和操作方式做了详细的评测应用一 :epmotion 5075 VAC 进行 96 个克隆的质粒全自动抽提材料与方法 Eppendorf epmotion 5075 VAC 工作站 Eppendorf Perfectprep Plasmid 96 Vac Direct Bind Kit 96- 克隆的质粒文库,IRAT-1( 来自 Mammalian Gene Collection) 单克隆 - psv- β-galactosidase, 宿主菌为 TOP10 工作站操作流程收集的菌体直接置入 epmotion 5075 VAC 工作站中, 运行预设程序中的 ep Plasmid 96 Vac DB 程序, 得到的质粒 DNA 会被洗脱在 70μl 低盐的 TE 缓冲液中细菌的培养 96 克隆的质粒文库 :96 深孔培养板中每孔各加入 1.2 ml LB 培养基含 50μg/ml 氨卞青霉素, 然后用 96 针式接种复制器接种, 接种源为甘油保存的冻存文库接种后的培养板在 rpm 摇床中过夜培养 18 个小时培养板在 1900 g 的离心力下离心 5 分钟, 去上清, 收集菌体, 倒置在吸水纸上除去残余的培养液图 1: epmotion Editor 软件显示的 ep Plasmid 96 Vac DB 程序中工作台面的设置和布局单克隆 : 将融化 300μl 的甘油冻存的 TOP10 细胞接种于含 50μg/ml 氨卞青霉素的 600 ml LB 培养基中,TOP10 菌株中含有 psv- β-galactosidase 质粒接种后的培养液在 rpm 摇床中过夜培养约 16 个小时, 细菌数量达到 OD600 的读数为 3.0 在 96 深孔培养板中每孔分装 1.2 ml 培养物, 收集菌体, 方法同上 10

2 文献参考 No. 4 表 1: ep Plasmid 96 Vac DB 程序中工作台面的设置和布局详细说明位置编号实验耗品实验耗品说明 A2 ep T.I.P.S. Motion 1000μl 96 个样品所需的 96 个吸头 A3 ep T.I.P.S. Motion 1000μl 96 个样品所需的 96 个吸头 A4 收集板收集洗出液 85 mm 高度适配器抬高收集板, 加快操作 B1 试剂槽 6 个试剂槽, 盛放试剂盒中的溶液槽 1: 溶液 1 槽 2: 溶液 2 槽 3: 溶液 3 槽 4: 结合缓冲液槽 5: 稀释的洗涤缓冲液 100 ml 试剂槽槽 6: 低盐洗脱液 B2 ep T.I.P.S. Motion 1000μl 96 个样品所需的 32 个吸头 B3 55 mm 高度适配器抬高过滤板, 加快操作真空槽框架上 : 过滤板 A 过滤细菌裂解液真空框架 1 真空槽的过滤板适配器真空歧管内部 : 过滤板 DB 结合质粒 DNA C2 深孔培养板内有收集好的菌体 C3 55 mm 高度适配器抬高过滤板 A C4 真空槽框架的支架用于放置真空槽框架 T0 夹板器用于自动移取工作台上的各种板 T1 TM 通道 1000μl 量程的分液工具自动荧光测序分析用 ABI PRISM 3700 DNA 测序仪, ABI BigDye TM V 3.1 测序试剂盒对所有质粒 DNA 进行序列测定, 测序条件和反应组成如下表 : 结果琼脂糖凝胶电泳分析循环条件反应组成 96 2 分钟 2μl 5 反应缓冲液秒 2μl 10μM 496fwd 引物 50 5 秒 2μl BigDye v 分钟 10μl 分子生物级水 25 个循环 10 长时间保存总反应体积 20μl 图 2: 用 Perfectprep Plasmid 96 Vac DB Kit 在 epmotion 5075 Vac 工作站上抽提得到的 96 克隆文库的质粒 DNA, 取 3μl 在 1% 的琼脂糖凝胶电泳中分析,EB 染色得到的电泳结果, 两边的分子量标记为 HindIII 酶解的 λdna 用 15 μl 异丙醇混合测序产物, 室温下静置 15 分钟, 在 1900 g 的离心力下离心 30 分钟, 去上清, 将沉淀在空气中晾干, 用 15μl 0.1 TE 缓冲液重悬图 3: 用 Perfectprep Plasmid 96 Vac DB Kit 在 epmotion 5075 Vac 工作站上抽提得到的单克隆质粒 DNA, 用 4 个 96 孔板抽提的 384 个样品, 取 2μl 在 1% 的琼脂糖凝胶电泳中分析, 得到的凝胶照片为其中一块 96 孔板的质粒, 两边分子量标记为 1 kb 的 DNA Ladder 11

文献参考质粒的得率和纯度表 2:epMotion 5075 Vac 工作站抽提得到的 96 克隆文库的质粒的平均浓度和 A 260/280 比值平均浓度 (μg/ml) A 260/280 比值 168.9 1.

3 48.33 合并 384 孔板 1.80 0.10 212.7 45.31 自动荧光测序 96 克隆文库板 : 用 ABI PRISM 3700 DNA 测序仪, ABI BigDye TM V 3.1 试剂盒测序所有结果的测序质量平均值 Phred Q>20 的情况下, 有效可读长度为 645 个碱基, 测序通过率 ( 有效可读长度 >100 碱基 ) 为 91.

6% 的结果的有效可读长度大于 700 碱基讨论质粒 DNA 在许多生物学研究领域中扮演着十分重要的角色, 它甚至是一个研究项目的关键点质粒 DNA 的产率要能满足实验需求, 纯度要能保证高质量的下游实验 Perfectprep Plasmid 96 Vac DB 试剂盒就是这样一款能提供高产率高纯度的 96 样品抽提的工具, 配合 epmotion 5075 Vac

3 文献参考质粒的得率和纯度表 2:epMotion 5075 Vac 工作站抽提得到的 96 克隆文库的质粒的平均浓度和 A 260/280 比值平均浓度 (μg/ml) A 260/280 比值表 3:epMotion 5075 Vac 工作站抽提得到的 4 96 样品的单克隆的质粒的平均浓度和 A 260/280 比值培养板编号 A 260/280 平均比值标准偏差平均浓度 (μg/ml) 标准偏差合并 384 孔板自动荧光测序 96 克隆文库板 : 用 ABI PRISM 3700 DNA 测序仪, ABI BigDye TM V 3.1 试剂盒测序所有结果的测序质量平均值 Phred Q>20 的情况下, 有效可读长度为 645 个碱基, 测序通过率 ( 有效可读长度 >100 碱基 ) 为 91.7 % 有 61% 的结果其有效可读长度大于 700 碱基单克隆 : 每块 96 孔板质粒各取一半样品进行测序, 采用 ABI BigDye TM V 3.1 试剂盒进行测序反应, 经 ABI PRISM 3700 DNA 分析仪检测序列在测序质量平均值 Phred Q>20 的有效可读长度为 743 个碱基, 测序通过率 ( 可读长度 >100 碱基的结果 ) 为 99.0% 有 91.6% 的结果的有效可读长度大于 700 碱基讨论质粒 DNA 在许多生物学研究领域中扮演着十分重要的角色, 它甚至是一个研究项目的关键点质粒 DNA 的产率要能满足实验需求, 纯度要能保证高质量的下游实验 Perfectprep Plasmid 96 Vac DB 试剂盒就是这样一款能提供高产率高纯度的 96 样品抽提的工具, 配合 epmotion 5075 Vac 工作站和优化的工作程序, 我们能得到高质量的质粒 DNA, 无任何基因组 DNA RNA 或蛋白质的污染在 96 克隆质粒文库的实验中, 我们可以得到的质粒平均浓度为 168μg/ml, 测序的 Phred Q>20 的有效长度达 645 碱基这套系统通过 96 孔板模式的操作, 可以得到非常均一的结果为了说明结果的均一性, 我们使用了来自单个克隆的菌液在工作站上进行 4 96 模式的质粒抽提, 每块 96 孔板样品得到的质粒平均浓度分别为 186.1, 200.3,208.0, μg/ml, 标准偏差分别为 20.29,41.42,31.58, 48.33, 平均的 A 260 /A 280 比值为 1.86,1.79,1.80,1.74, 比值的标准偏差为 0.05, 0.10,0.10,0.13, 充分说明质粒 DNA 无蛋白质污染结论图 4: 质粒文库测序的色谱图例,Phred Q>20 情况下的序列有效可读长度达到 795 个碱基, 第一个不可读碱基 N 在第 845 个碱基位 Perfectprep Plasmid 96 Vac DB 试剂盒与 epmotion 5075 Vac 工作站的联合应用能够给高通量的基因组测序项目和一些特定基因研究项目提供完整的系统, 在 60 分钟内即可得到高质量, 高通量的质粒 DNA, 可以完全满足下游的各种应用 12

4 文献参考 No. 4 应用二 : epmotion 5075 VAC 进行 96 个 BAC DNA 的全自动抽提 BAC( 细菌人工染色体 ) 是基因组研究中经常使用的大片段 DNA 载体, 它不仅稳定性好, 还可以象质粒一样进行操作, 应用起来非常方便 BAC 载体通常载有比较大的 DNA 片段, 有的长达 300kb BAC 主要通过指纹图谱分析和末端测序来进行研究, 能帮助获得一些长的基因组的片段序列和信息在大规模的基因组序列计划中,BAC 可以和全自动工作站实现高通量的末端测序本应用就是用 Eppendorf Perfectprep BAC 96 试剂盒在 epmotion 5075 Vac 工作站上进行的全自动 BAC DNA 抽提试剂盒为优化的碱裂解法抽提 BAC, 分离和纯化由工作站的移液和真空系统全自动完成, 可在 75 分钟得到 μg 的高纯 BAC DNA, 并直接用于各种下游应用这个产量至少可以用于 5 个测序反应, 或 4 个测序反应和 1 个指纹图谱分析, 或多个 PCR 反应 BAC 的纯度可以完全确保高质量的测序结果材料与方法 Eppendorf Perfectprep BAC 96 试剂盒 Eppendorf epmotion 5075 Vac 工作站人的 BAC 文库 96 孔板工作站操作流程将收集的菌体直接置入 epmotion 5075 VAC 工作站中, 运行预设程序中的 ep BAC 96 程序, 抽提 1 块 BAC 文库 96 孔板和 4 块 96 孔 ( 共 384 样品 ) 单克隆 BAC 板细菌的培养文库板的处理 : 在 96 深孔培养板中的每孔各加入 1.5 ml 2 YT 培养基, 含 12.5 μg/ml 氯霉素, 再用 96 针式接种器从 384 孔板中甘油冻存的 BAC 文库接种, 然后置入摇床中在 37,325 rpm 转速下过夜培养 2 4 小时将培养板在 1900 g 的离心力下离心 10 分钟, 收集菌体, 弃上清, 并倒置在吸水纸上吸取多余的培养液单克隆的处理 : 将 15μl 单克隆的 BAC 细菌冻存液接种于 5mL 2 YT 培养基中 ( 含 5μl 12.5μg/ml 氯霉素 ), 在摇床中 37, 325 rpm 进行 6 小时的小量初始培养然后, 从 5mL 初始培养液中取 600μl 接种于 600mL 2 YT 培养基中 ( 含 600μl 12.5μg/ml 氯霉素 ), 置入摇床中在 37,325 rpm 转速下过夜培养近 18 小时再将培养后的菌液以每孔 1.5 ml 分配到 96 深孔培养板中将培养板在 1900 g 的离心力下离心 10 分钟, 收集菌体, 弃上清, 并倒置在吸水纸上吸取多余的培养液收集的菌体在抽提前可以冻存在 -20 图 5: epmotion Editor 软件显示的 ep BAC 96 程序中工作台面的设置和布局 13

7 文献参考应用三 : epmotion 5075 VAC 进行 96 个样品的全自动高通量 PCR 产物纯化 PCR 是生物学研究中经常使用的技术, 而且是很多完整的实验中间的一个重要环节, 很多 PCR 的产物都要用于下游一些对 DNA 的质量要求比较苛刻的实验, 所以 PCR 反应中一些和 DNA 产物无关的成份必须有效去除, 如剩余的引物 dntps 和盐本实验是在 epmotion 5075 Vac 工作站上进行 Eppendorf Perfectprep PCR Cleanup 96 试剂盒的全自动纯化, 该试剂盒采用超滤膜技术纯化 PCR 产物, 对反应中多余成份的去除十分有效, 能纯化 300bp 至 3kb 范围的各种 PCR 片段, 平均回收率大于 80%, 过滤纯化板可操作 20μl 至 300μl 的 PCR 反应液工作站已预设好该试剂盒的操作程序, 只需要 30 分钟即可完成纯化纯化得到的 PCR 片段可直接用于测序 DNA 微阵列克隆或酶解等下游应用 PCR 实验中扩增了 4 种 P C R 片段, 其中 3 种是扩增自 λdna 模板, 片段长度分别为 305 bp 1048 bp 和 3400 bp, 第四个是扩增自人的基因组 DNA p53 基因, 片段长度为 533 bp 每种 PCR 片段都是在 96 孔 PCR 板中扩增的, 然后将产物全部混合工作站的纯化操作过程在 twin.tec 96 孔 PCR 板中每孔加入 50μl 混合的 PCR 反应产物, 用工作站的 ep PCR Cleanup 96 程序运行自动纯化过程最后纯化的 PCR 片段被洗脱在 50μl 洗脱液中材料与方法 Eppendorf Perfectprep PCR Cleanup 96 试剂盒 Eppendorf epmotion 5075 Vac 工作站 Eppendorf Taq DNA 聚合酶 Eppendorf 10 Taq 缓冲液 Eppendorf dntps Eppendorf 醋酸镁溶液 λdna 人的基因组 DNA 引物图 9:epMotion Editor 软件显示的 ep PCR Cleanup 96 程序中工作台面的设置和布局表 7:ep PCR Cleanup 96 程序中工作台面的设置和布局详细说明位置编号实验耗品实验耗品说明 A2 ep T.I.P.S. Motion 300μl 96 个样品所需的 96 个吸头 A3 ep T.I.P.S. Motion 300μl 96 个样品所需的 96 个吸头 A4 ep T.I.P.S. Motion 300μl 96 个样品所需的 8 个吸头 B2 试剂槽 1 个试剂槽, 盛放试剂盒中的溶液槽 1: 分子生物级水 30mL 试剂槽 B3 twin.tec 带裙边 96 孔 PCR 板未纯化的 PCR 产物 55mm 高度适配器抬高 PCR 板, 加快操作速度真空槽框架上 : 过滤板过滤引物 dntps 盐真空框架 1 真空歧管内部 : 废液收集板真空槽的过滤板适配器收集滤过液 C3 纯化液收集板收集洗脱下来的 PCR 片段 55mm 高度适配器抬高收集板, 加快操作速度 T0 夹板器用于自动移取工作台上的各种板 T1 TM 通道 300μl 量程的分液工具 16

文献参考 No. 4 自动荧光测序分析对 96 个 1048 bp 和 3400 bp 两种纯化后的 PCR 片段进行了测序分析, 用 ABI PRISM 3700 DNA 测序仪, ABI BigDye TM V 3.

1 预反应混合液 2μl 引物 (10μM) 2μl 分子生物级水 9 μl 总反应体积 20μl 表 9: 测序反应的程序第一步 96 2 分钟第二步 96 10 秒第三步 50 5 秒第四步 60 4 分钟第五步从第二步再开始 24 个循环第六步 10 保存测序产物的纯化 :

1xTE 缓冲液重悬溶解, 加样至 ABI 3700 测序仪结论琼脂糖凝胶电泳检测 M 100 % 50 % 50 % 100 % 305 bp 533 bp 50 % 100 % 1048 bp M M 100 % 50 % 3400 bp 图 10: 用 epmotion

8 文献参考 No. 4 自动荧光测序分析对 96 个 1048 bp 和 3400 bp 两种纯化后的 PCR 片段进行了测序分析, 用 ABI PRISM 3700 DNA 测序仪, ABI BigDye TM V 3.1 测序试剂盒进行序列测定, 测序条件和反应组成如表 8 表 9: 表 8: 测序反应的组成模板 DNA 5μl 5 测序缓冲液 (ABI) 2μl BigDye version 3.1 预反应混合液 2μl 引物 (10μM) 2μl 分子生物级水 9 μl 总反应体积 20μl 表 9: 测序反应的程序第一步 96 2 分钟第二步秒第三步 50 5 秒第四步 60 4 分钟第五步从第二步再开始 24 个循环第六步 10 保存测序产物的纯化 : 在测序板的每孔中加入 15μl 异丙醇室温下静置 15 分钟, 然后在 1900 g 的离心力下室温离心 30 分钟弃去异丙醇, 将沉淀物在空气中晾干,(15 分钟以上 ), 最后用 15 μl 0.1xTE 缓冲液重悬溶解, 加样至 ABI 3700 测序仪结论琼脂糖凝胶电泳检测 M 100 % 50 % 50 % 100 % 305 bp 533 bp 50 % 100 % 1048 bp M M 100 % 50 % 3400 bp 图 10: 用 epmotion 5075 Vac 工作站和 PCR Cleanup 96 试剂盒纯化得到的 PCR 片段的电泳检测分别取了 8 个 305 bp 533 bp 1048 bp 和 3400 bp 的 PCR 产物在 1.5-2% 琼脂糖凝胶中电泳, 另设立了两个 100% 和 50% 未纯化 PCR 产物的对照,305bp 533bp 和 1048 bp 的 PCR 产物用 100bp DNA Ladder 做分子量标记,3400 bp PCR 产物用 1kb DNA ladder 箭头指示的为未纯化的 PCR 产物中的引物二聚体 17

文献参考自动荧光测序分析对 96 个 1048 bp 和 3400 bp 两种纯化后的 PCR 片段进行了测序分析, 用 ABI PRISM

1 测序试剂盒进行序列测定表 10:Perfectprep PCR Cleanup 96 试剂盒和工作站纯化得到的 PCR 片段的测序结果

的样品都进行了凝胶电泳和测序分析,1048 bp 和 3400 bp 两个片段的高质量测序结果 ( 测序质量平均值 Phred Q>20

96 试剂盒和工作站可以纯化得到高纯的 PCR 片段 1048 bp(n = 96) 711 100% 3400 bp(n = 96) 695

9 文献参考自动荧光测序分析对 96 个 1048 bp 和 3400 bp 两种纯化后的 PCR 片段进行了测序分析, 用 ABI PRISM 3700 DNA 测序仪, ABI BigDye TM V 3.1 测序试剂盒进行序列测定表 10:Perfectprep PCR Cleanup 96 试剂盒和工作站纯化得到的 PCR 片段的测序结果 PCR 产物测序质量平均值 Phred Q>20 测序通过率有效可读长度讨论与小结这四个不同长度的 PCR 片段的 80% 的样品都进行了凝胶电泳和测序分析,1048 bp 和 3400 bp 两个片段的高质量测序结果 ( 测序质量平均值 Phred Q>20 有效可读长度分别为 711 碱基和 695 碱基, 通过率分别为 100% 和 99%) 表明 Perfectprep PCR Cleanup 96 试剂盒和工作站可以纯化得到高纯的 PCR 片段 1048 bp(n = 96) % 3400 bp(n = 96) % 图 11:1048 bppcr 片段的测序峰轨迹图例, 该序列 Phred Q>20 的有效长度为 771 碱基图 12:3400 bp PCR 片段的测序峰轨迹图例, 该序列 Phred Q>20 的有效长度为 786 碱基 18

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析