期 王 杰等 噬菌体 %" 的生物学特性分析及对鸡大肠杆菌的疗效 禽大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的禽类 急慢性传染病 在鸡群中一般发病率为 死亡率为 目前针对大肠杆菌病多采用抗生素治疗和预防 而抗药性日益加剧的大肠杆菌给养禽业带来了严重损失 并对公共卫 生 食品安全构成了严重威胁 噬菌体治疗细菌

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1 畜牧兽医学报 噬菌体 < 的生物学特性分析及对鸡大肠杆菌的疗效 王 杰 李璐璐 张 庆 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 济南 ) 山东大学生命科学学院 济南 ) 摘 要 为了解决目前严重的抗生素耐药性 寻找抗生素的替代品 作者探究了大肠杆菌噬菌体 %" 的基本生物学特性及其对致病性大肠杆菌 的治疗效果 大肠杆菌噬菌体 %" 的生物学特性分析显示其效价可达到 8" F 透射电镜结果显示该噬菌体属于有尾目 # 噬菌体 热稳定性较好 在 I 保温 后噬菌体效价仍可达到 8" F 以上 对 1 值的适应范围较宽 在 1 内仍能保持较高的裂解活性 该噬菌体的最适 1 在 左右 最佳感染复数 $ 为 感染宿主菌的潜伏期 " 爆发期 " 大肠杆菌噬菌体 %" 对大肠杆菌 有较强的裂解能力 可使 鸡肠道内大肠杆菌 的数量降低 ) 该大肠杆菌噬菌体 %" 在治疗特定的大肠杆菌感染中具有较大的应用潜能 关键词 大肠杆菌 噬菌体 生物学特性 治疗中图分类号 文献标志码 文章编号 #)##%'"#''$#<% #"%#%%")" - 1 %"$"$%""$ %%1) "'$1) '%#%#-'6'88'-6 '-'-'6'6'8%"6'8' '''-'-#-'-'6'6'8%"; 6; 8" F -'66'6' "6 8" F 86' I 86;681 "'-'1#""18; "-"--'88' $;'688''6 ; "#6-86"-'6 "'6'; -#%"6 -'6'#"68'''6') #'%"66-866"8 '8'8' '-'-'6'6'6 收稿日期 ) 基金项目 国家自然科学基金 山东省农业重大应用技术创新项目 # 山东省自然科学培养基金 % 作者简介 王 杰 女 山东济宁人 硕士 主要从事噬菌体基本性质和裂解机制研究 #-)"-;6 '" 通信作者 张 庆 "-''"

2 期 王 杰等 噬菌体 %" 的生物学特性分析及对鸡大肠杆菌的疗效 禽大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的禽类 急慢性传染病 在鸡群中一般发病率为 死亡率为 目前针对大肠杆菌病多采用抗生素治疗和预防 而抗药性日益加剧的大肠杆菌给养禽业带来了严重损失 并对公共卫 生 食品安全构成了严重威胁 噬菌体治疗细菌感染性疾病的历史由来已 久 世纪 年代就有了噬菌体成功治疗霍乱 ) 的报道 然而抗生素的出现与大量使用阻碍着噬菌体治疗的研究与发展 但是 随着抗生素滥用产生的畜禽产品药物残留问题与耐药菌株的大量出 现 以及新抗生素研发难度的增加 使噬菌体作为一种新兴的生物治疗制剂又重新受到了研究人员的 关注 噬菌体特异性强 治疗细菌感染时只针对相应的致病菌 而不会干扰机体正常的菌群平衡 且可以在细菌感染部位快速增殖使得噬菌体剂量得以放大 进而快速达到增强疗效的作用 噬菌体有很 强的宿主依赖性 会随着宿主菌的清除而死亡 另外机体内本身就存在着种类繁多的噬菌体 所以噬菌体几乎没有任何毒副作用 本试验测定了大肠杆菌噬菌体 %" 的基本生物学特性 并给 鸡口服大肠杆菌噬菌体 % " 及其特异宿主菌致病性大肠杆菌 观测粪便中宿主菌数量的变化 评估大肠杆菌噬菌体 % " 的裂解疗效 材料与方法 - 材料 培养基和试剂 固体 培养基 半固体 培养基 液体 培养基 麦康凯固体培养基 1 液体培养基 缓冲液 ""- F #6 1-""- F $ ""- F - ""- F -1)$ '6- )6'% 引物 % 酶 琼脂糖粉 分光光度计等 抗菌药物 氟苯尼考 氨苄西林 头孢噻肟 头孢曲松 左氧氟沙星 环丙沙星 多西环素 庆大霉素 丁胺卡那霉素 硫酸黏菌素 恩诺沙星 头孢噻呋和新霉素 购自中国兽医药品监察所 菌株和噬菌体 大肠杆菌 分离自青岛病死鸡体 大肠杆菌噬菌体 %" 分离自青岛病死鸡肠道 禽源致病性大肠杆菌 ) 株 沙门菌 株 铜绿假单胞菌 株 耐甲氧西林金黄 色葡萄球菌 株 金黄色葡萄球菌 株 均为实验室保存 实验动物 健康的 ) 日龄 鸡 只 购自山东省农业科学院家禽研究所 鸡场 - 噬菌体 < 的基本生物学特性 双层琼脂平板法测定噬菌体效价 滴度 参照文献 中的方法富集噬菌体 %" 利用双层平板法测定效价 噬菌体 %" 的电镜形态 参照文献 中的方法 纯化得到噬菌体颗粒后进行透射电镜观察 采用点滴法分析噬菌体的裂解谱 测定噬菌体 %" 对实验室保存的禽源致病性大肠杆菌 ) 株 沙门菌 株 铜绿假单胞菌 株 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 株 金黄色葡萄球菌 株 的裂解能力 取 过夜培养的待测菌液加入到 半固体 培养基中混匀 倒平板 取噬菌体悬液滴加到平皿的不同位置上 I 培养 观察有无噬菌斑 噬菌体 %" 的最佳感染复数 "- "--'88'$ 将处于对数生长期的宿主菌用 液体培养液洗涤 然后将细菌的浓度调整为 G '8" F $ 分别为 将相应数量的噬菌体液加入到已准备好的菌液中 二者体积分别为 ) 混匀 I 6" F 振荡培养 ) 混合培养物 6" F 离心 " 得到裂解液 测噬菌体效价 最高效价的感染复数即为最佳感染复数 ) 噬菌体 %" 的一步生长曲线 噬菌体液与宿主菌液各 ) 以 $ 的比例混合 I 孵育 )"6" F 离心 " 弃上清 液体洗涤 次 加入 " I 预热的 液体培养基 充分混匀 迅速置于 I 摇床中振荡培养 每隔 " 取样一次 测噬菌体的效价 噬菌体 %" 最适生长温度 ) I 各取 噬菌体稀释液与 宿主菌 利用双层琼脂平板法计数噬菌斑 噬菌体 %" 的热稳定性 将噬菌体悬液放于 ) I 水浴锅中 持续 和 " 后 各取 噬菌体液与 宿主菌混合 利用双层琼脂平板法计数噬菌斑 噬菌体 %" 的最适 1 调整 液体培养基的 1 分别为 )

3 % 畜牧兽医学报 ) 卷 每个 XI 均取 %-Q加入 %-Q 的 % X P4Qp% 带判定噬菌体作用前后大肠杆菌有无变化' 的噬菌体液混匀 1 s 作用 双层平板法计数噬 菌斑' #E %16 鸡 口 服 噬 菌 体 `$P 治疗大肠杆菌 #"#X 感染的效果 #E 噬菌体 `$P 裂解大肠杆菌 #"#X 的体外试验 ' %;\ 鸡 粪 中 大 肠 杆 菌 与 高 抗 性 大 肠 杆 菌 P4Qp% 口服攻毒大肠杆菌 %% 浓度 % 剂量为 4Q'试验 组 分 小 组即 为 只 攻 菌 组只 %% 的 <MB 测定 参照 BQ M标 准微量 肉汤 稀 释 法 测 定 ;\ 鸡 粪 中 的 大 肠 杆 菌 以 及 大 肠 杆 菌 攻噬菌体组菌与噬 菌 体 组每 小 组 只 鸡口 服 噬 %% 对 % 种药物的 <MB 值' ' 在 ;\ 鸡 肠 道 噬 菌 体 H4 裂解大肠杆 粪样直到第 % 小 时' 每 个 粪 样 取 O 溶 于 4Q 菌 %% 的试验 根 据 药 敏 结 果 选 取 新 霉 素 药 物 制备麦康凯药板配制麦康 凯 药 板质 量 浓 度 为 % -O 4Q "大 肠 杆 菌 %% <MB 的 一 半此 浓 度 可 以区分大 肠 杆 菌 %% 和 ;\ 鸡 肠 道 原 有 的 大 肠 p% 杆菌#' 取 AO;\ 鸡粪于 4Q 液体 Q^ 培养基中 同时加入大肠杆菌噬菌体 H4 和 大肠杆菌 %% 各 %-Q1 s 摇 床 过 夜 培 养' 培 养 的 菌 液 % 倍 梯度稀释涂布麦康凯药板平板计数菌落单菌落于 菌体 4Qq% X P4Qp% 从 开始每隔 取 生理盐水中混匀 % 倍梯度稀释取稀释% %) 和 %A 倍的样品 浓 度 涂 布 A -O 4Qp% 的 新 霉 素 麦 康凯药板每个药 板 上 加 菌 样 %-Q 1 s 过 夜 培 养菌落计数统计经噬菌体治疗与未经噬菌体治疗 的 ;\ 鸡粪样中大肠杆菌 %% 数量' 结 果 #`$P 的效价 图 % 为噬菌体 H4 的 生 长 情 况' 大 肠 杆 菌 噬菌体 H4 的效价测定结果如下$噬菌体 H4 液体 Q^ 中 1 s 摇床过夜培养提取 ]8=与原大 双层板平均为 % 个 噬 菌 斑计 算 出 噬 菌 体 富 集 液 肠杆菌 %% 的 ]8= 同时作 CT $ ;B比对基因条 的效价为 ' %q%x P4Qp% ' 图 # 稀释了 #"M 倍的噬菌斑生长情况 #) 8 ) G W % ; ;#"M F E `$P 的电镜形态观察 图 为噬菌体 H4 的 透 射 电 镜 图' 结 果 显 示噬菌 体 H4 为 有 尾 目 噬 菌 体由 二 十 面 体 头 部与尾部组成头 部 直 径 约 为 %%1-4整 个 噬 菌 体 长度约 -4属于 ) 噬菌体类型' 解谱较宽' %`$P 的最佳感染复数 最佳感染复数结果"图 #显 示 大 肠 杆 菌 噬 菌 体 H4 的 <6M为 ' '`$P 的一步生长曲线 `$P 的裂解谱分析 噬菌体 H4 的裂 解 谱 显 示 大 肠 杆 菌 噬 菌 体 菌体 H4 感染宿 主 菌 4$ - 内噬 菌 体 的 量 增 的宿主特异性很强几乎不裂解沙门菌铜绿假单胞 加不大这段 时 间 称 为 潜 伏 期感 染 宿 主 菌 后 " 菌金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 4$ -噬菌体的量急速增加这段时间称之 为爆 发 期即 H4 的爆发期约为 14$ -' 但是可以裂解 A 株 致 病 性 大 肠 杆 菌 中 的 株裂 根据噬菌体 H4 的一步生长曲 线"图 )#噬

4 %% 期 王 杰等$噬菌体 H4 的生物学特性分析及对鸡大肠杆菌的疗效 % 图 ' 噬菌体 `$P 的最适温度 'KG F - FG ` $P E 图 噬菌体 `$P 透射电镜图 ) 4 F 4 4 F G G) E `$P % X P4Qp% '在 s 保 温 % 后 效 价 可 在 %1 P4Qp% 以上经 1 s 保温 % 后仍 有 噬 菌 体 存 X 活而经 s 作用后 噬 菌 体 基 本 上 被 灭 活"此 部 分 结果因显示条件所 限 在 图 中 未 能 体 现#' 由 此 可 见这株噬菌体的热稳定性较好' 图 噬菌体 `$P 的 >KU E ) >K U `$P G) 图 M 噬菌体 `$P 的热稳定性 M ) F - C `$P E `$P 的最适 G] 大肠杆菌噬菌体 H4 的最适 XI 的测定结果 统计分析如图 1 所示'大肠杆菌噬菌体 H4 的最 适 XI 在 A"1同时在 XI)"% 时仍能保持较高的 效价'所以噬菌体 H4 能适应较宽的 XI 范围' 图 % 噬菌体 `$P 的一步生长曲线 E %K 4 8 ) Q `$P G M`$P 的最适生长温度 最适生长温度测定结果"图 A#显示噬菌体 H4 适合生长的温度在 最适生长温度为 ") s 1 s' $`$P 的热稳定性 热稳定性 测 定 结 果 "图 #显 示 噬 菌 体 H4 在 和 ) s 保 温 4$ - 和 % 后 基 本 保 持 原 活 性在 A s 保 温 % 后 噬 菌 体 的 效 价 仍 可 维 持 在 图 $ 噬菌体 `$P 的最适 G] $) G FF G] `$P E

5 %1 畜牧兽医学报 ) 卷 X`$P 裂解大肠杆菌 #"#X 的体外试验 微量肉汤稀释法测定的大肠杆菌%% 及 ;\ 鸡 粪中大肠杆菌对 % 种 药 物 的 <MB 值'根 据 药 敏 结 果统计分析环丙沙星多西环素恩诺沙星新霉素) 种药可以有效地区分大肠杆菌%% 与 ;\ 鸡粪中原 有的大肠杆菌'选取新霉素做后续耐药菌株的筛选' 根据药敏结果大肠杆菌 %% 用 A-O4Qp% 的 新 霉素麦康凯药板筛选' 筛选出来的耐药大肠杆菌提取 ]8= CT $ ;B 产物琼脂糖电泳条带如图 所示$结果显示 %% 菌 株经噬菌体作用前 后 无 变 化可 以 利 用 药 敏 试 验 的 结果对噬菌体作用后的菌株进行筛选' #"16 鸡口服 `$P 治疗其相应大肠杆菌感 染效果 攻毒后利用新霉素麦康凯平板对大肠杆菌 %% 分离计数加入噬菌体后粪样中的耐药菌数量显著下 降结果见表 以 % 的统计结果计算只口服大 肠杆菌 %% 的 ;\ 鸡每克粪样中大肠杆菌 %% 耐 药菌含量为 ' q% P4Q 同时口服大肠杆菌 1 p% %% 和噬菌体 H4 的 ;\ 鸡 每 克 粪 样 中 大 肠 杆 菌 %% 耐药菌 含 量为 q% P 4Qp% 后 者 比 <'AUX ]8= 相 对 分 子 质 量 标 准 %%'原 大 肠 杆 菌 %%]8= %% % %% %% %% )'经噬菌体 H4 作用后的大肠杆菌 %%]8= <'A UX ]8= 4 T SN T%%'P " ' " $" %% %%% %% %% )'P " ' " $" ]8=%% 前者降低了 ' AZ '所以该大肠杆菌噬菌体可有效 %%]8= N T T N 4N# XONH4 图 大肠杆菌 N P6A 产物琼脂糖电泳条带 裂解致病性大肠杆菌 %%降低 ;\ 鸡的患病风险' ) N P6AG ; C 4; E G) 表 # 每克粪样中大肠杆菌 #"#X 耐药菌含量 P4Qp% C # ) F4 1 -% - # #"#X 4 C G F - FG 取样时间%$4N 处理 T N 4N 大肠杆菌 %% P " %% 大肠杆菌 %%` 噬菌体 P " %%`;ON ) % ' %q% A' q% ' 1q%1 ' q%1 ' q%1 q% q% q% q% 中和污水中分 离 出 的 噬 菌 体 相 似 )%A%1' 噬 菌 体 H 讨 论 噬菌 体 在 自 然 界 分 布 广 泛据 统 计 分 析 其 数 量 可以达到 %%) 大 肠 杆 菌 噬 菌 体 更 是 广 泛 分 布 的最佳感染 复 数 为 ' %感 染 宿 主 菌 的 潜 伏 期 4 为 4$ -爆 发 期 为 1 4$ -' 潜 伏 期 和 爆 发 期 短 可以在短时间内杀 死 宿 主 菌有 效 控 制 大 肠 杆 菌 的 '充分利用这些 生长'噬菌体 H4 的 裂 解 谱 分 析 结 果 表 明 H 噬菌体可以在一定 程 度 上 替 代 抗 生 素 的 使 用降 低 可以裂解 A 株 致 病 性 大 肠 杆 菌 中 的 株裂 4 解谱较宽' 于鸡消化道鸡场及周边环 境 中 ) %) 细菌耐药性提高养殖企业的经济利益' 作者 分 离 到 的 大 肠 杆 菌 噬 菌 体 效 价 可 达 到 % X P4Qp% 由 面体 和 尾 部 组 成属 于 ) 类 噬菌体'这与许多 研 究 人 员 从 养 殖 场 粪 便 中河 水 噬菌体 H4 的热 稳定 性较 高在 s 保 温 % 后 噬 菌 体 效 价 仍 可 达 到 %1 X P 4Qp% 以 上' 对 XI 的适应范围较宽在 XI)"% 内 能 保 持 较 高

6 期 王 杰等 噬菌体 %" 的生物学特性分析及对鸡大肠杆菌的疗效 的裂解活性 这些特性一方面可以使其在生产过程中不需要过于严苛的生产环境 可以降低生产成本 有利于大规模的工业生产 另一方面在应用时能适应多种环境 可以在相对复杂的环境中保持一定的裂解能力 有利于扩大该噬菌体的适用范围和应用效果 在 鸡肠道中的杀菌试验表明噬菌体 % " 可显著降低其对应大肠杆菌在体内的存活数量 有研究报道 噬菌体经胃酸作用后会失活 但是本试验表明 噬菌体 %" 经胃酸作用后仍能有效杀死宿主菌 这也是该噬菌体的优势之一 目前抗生素耐药性越来越严重 噬菌体作为杀菌物质具有很大的优势和应用潜力 本研究中分离到的 %" 只是数量庞大的噬菌体中的一株 分离新的噬菌体并对其性质进行深入研究 可以为其成为新的抗菌剂打下基础 同时 还需要对其临床 应用过程中的问题进行研究 相信经过众多科研工作者的努力 噬菌体会在很大程度上弥补抗生素的缺陷 在畜禽细菌病防治中起到越来越重要的作用 结 论 大肠杆菌噬菌体 %" 的效价为 8" F 属于有尾目 # 噬菌体 %" 热稳定性好 I 后效价仍可达到 8" F 以上 最适 1 在 左右 在 1 内能保持较高的裂解活性 最佳感染复数为 感染宿主菌的潜伏期 " 爆发期 "%" 对大肠杆菌 有较强的裂解能力 可使 鸡肠道内大肠杆菌 的数量降低 ) 可望用于治疗特定的大肠杆菌感染 " %"-" "'6-'- "-'-6-'- $%$# % -% 6; -'86-66'#") ) )1% '6 6" '"'-6'-8'%4 " ") %%$ 66-# 68'6'6-6' 6-6 6" 4%) )) 1 $ #$%%$ ''-8686 %% % %$## %# "-'6"-8' )) #41%''6 '8'6' 1) '-' ) $1$ % % 1%--'6'68 '6-$6' ) 张 倩 于会举 孙耀强 等 一株裂解性奶牛乳房炎源屎肠球菌噬菌体的分离及其生物学特性分析 畜牧兽医学报 参考文献 "' % %1$%'-'- - " -' - ))8 1 1%$%#4 %#1 %-'"'- "6"8 '6--'-8'' 6; # %-"6 '8-""'-6' "' '6'68-'8'% % 8 " 1# 1%= % '6 6"% 李 杨 王 静 霍 恺 等 大肠杆菌噬菌体的分离及生物学特性研究 中国畜牧兽医 4 1$ --'6 '68'68-86"

7 畜 牧 兽 医 学 报 卷 -8''86"%"$8 $ " ) 张培东 孙 岩 任慧英 等 大肠杆菌噬菌体的分离及其生物学特性 中国兽医杂志 1 4% '6'6 8 '6 1% $ " 王 冉 韩 晗 张 辉 等 大肠杆菌 噬菌体的分离鉴定及其生物学特性 华北农学报 % '6'68-''686 ' %% $% 1##4 -" -8'68'8#- 8666"-66- '-' 李 灏 谢慧君 孔 健 等 畜禽肠道致病菌噬菌体的生物学特性研究 微生物学通报 1=1$--'-'6'6 88;--'6 $ 4$ %66 ))) 编辑 白永平

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