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附僚袁
5 years ago
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1 684 doi /j.issn 基础研究采用哺乳动物细胞表面展示技术构建全长人源膀胱癌特异性抗采用哺乳动物细胞表面展示技术构建全长人源膀胱癌特异性抗体基因库体基因库蓝开健 1 张哲欢 2 梁中锟 1 王俊洁 1 娄海波 1 周元平 1 刘叔文 3 李长征 1 4 谭万龙 1 周辰南方医科大学南方医院药学院中医药学院广东广州汕头市中心医院广东汕头杭州环捷科技有限公司浙江富阳摘要目的构建大容量且能高效展示于哺乳动物细胞表面的全长人源膀胱癌特异性抗体基因库方法分离膀胱癌患者的外周血单核细胞 PBMC 提取 PBMC 的总 RNA 用 RT-PCR 方法扩增全套 IgG1 重链可变区 VH 和 Kappa 型轻链全长 LCκ 基因经过相应的限制性内切酶酶切后分别插入pDGB-HC-TM载体分别构建膀胱癌特异性的抗体重链基因库和轻链基因库一级抗体库随机挑取 20 个单克隆测定抗体基因序列并瞬时转染 FCHO 细胞结合流式细胞仪检测细胞表面抗体的表达将上述构建好的轻重链基因库通过4片段连接方法插入双表达载体pDGB4 构建二级抗体库转染FCHO后用流式细胞仪检测细胞表面抗体表达结果分别成功构建了膀胱癌特异性的重链基因库和轻链基因库随机挑取的轻重链单克隆各有 7 个和 9 个含有正确的抗体基因编码序列且能展示于哺乳动物细胞表面理论库容量达到 [( %) ( %)] 成 5 功构建了膀胱癌二级抗体库库容量为9 10 结论利用哺乳动物细胞表面展示技术我们成功构建了膀胱癌特异性的全长人源抗体基因库一级抗体库的库容量达到二级抗体库库容量达到为下一步筛选特异性高亲和力抗膀胱癌抗体奠定了基础关键词膀胱癌哺乳动物细胞表面展示全长人源抗体流式细胞仪检测 Construction of full-length human bladder cancer-specific antibody libraries based on mammalian display technology LAN Kaijian1, ZHANG Zhehuan2, LIANG Zhongkun1, WANG Junjie1, LOU Haibo1, ZHOU Yuanping1, LIU Shuwen3, LI Changzheng1, 4, TAN Wanlong1, ZHOU Chen4, 5 1 Nanfang Hospital, 3School of Pharmacy, 4Department of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou , China; 2Shantou Central Hospital, Shantou , China; 5Hangzhou Huanjie Science and Technology Co., Ltd., Fuyang , China Abstract: Objective To construct full-length human bladder cancer-specific antibody libraries for efficient display of full-length antibodies on the surface of mammalian cells. Methods The total RNA was isolated from peripheral blood mononuclear cells from patients with bladder cancer. The repertoires of IgG1 heavy chain variable region (VH) and Kappa light chain were amplified by RT-PCR using specific primers. The antibody genes were inserted into the vector pdgb-hc-tm to construct the bladder-cancer-specific antibody libraries of heavy chains and light chains. Ten clones from each library were randomly picked for gene sequencing and transient transfection into FCHO cells to analyze antibody display on mammalian cell surface by flow cytometry after staining with corresponding fluorescent labeled antibodies. Results The libraries of bladder-cancer-specific antibody heavy chain (IgG1) and light chain (LCκ) were successfully constructed. Seven out of the 10 clones randomly selected from the heavy chain library and 9 out of the 10 clones from the light chain library showed correct open reading frame, coding for 7 unique VH and 9 unique LCk. The combinatory library size reached [( %) ( % )]. Conclusion We have successfully constructed a full-length human bladder-cancer-specific antibody library with a combinatory diversity of based on mammalian display technology, which can be used for screening monoclonal antibodies against bladder-cancer-associated antigens. Key words: bladder cancer; mammalian cell display; full-length human antibody; flow cytometry 收稿日期基金项目广东省自然科学基金 S S 教育部高等学校博士学科点专项科研基金杭州环捷科技有限公司科研基金广东省教育厅育苗工程项目 LYM11037 南方医科大学科研启动计划作者简介蓝开健在读硕士研究生 kles@foxmail.com 张哲欢医师 @qq.com 蓝开健张哲欢共同为第一作者通信作者谭万龙教授博士生导师 tanwanlong@gmail.com 周辰教授 zhouchen1952@yahoo.cn 李长征讲师主治医师 lcztcm@126.com 膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤 1 表浅性膀胱癌行经尿道膀胱肿瘤切除术 TUR-BT 后 5 年内复 2-3 发率可能达70% 肌层浸润性膀胱癌行根治性膀胱切除术后高达 50%的患者会出现转移普通化疗和放疗 4 效果不理想单克隆抗体可以针对肿瘤的特异性靶点起作用在杀伤肿瘤细胞的同时基本不损伤正常组织 5-7 但目前尚无明确有效的膀胱癌特异性的靶向治疗抗体药物如果能筛选到特异性针对膀胱癌相关

2 685 抗原的抗体研发抗体新药就可以发挥单克隆抗体的靶向治疗作用有可能改善目前复发或晚期膀胱癌治疗效果不理想的问题由于鼠源抗体的异源性 8 理想的治疗性抗体应为全长人源抗体目前广泛应用的噬菌体展示技术只能筛选抗体片段而非全长抗体所用的载体细胞是细菌没有转录后修饰功能筛选到的抗体表达程度和亲和力 9-14 往往较低哺乳动物细胞表面抗体展示技术是理想的筛选人源抗体的技术平台因为这个平台能够展示全长抗体可以提供蛋白质的正确折叠和转录后的修饰功能在本实验中我们利用哺乳动物细胞表面展示技术成功构建了膀胱癌特异性的全长人源抗体基因库一级抗体库的库容量达到二级抗体库库容量 5 达到9 10 为下一步筛选特异性高亲和力抗膀胱癌抗体奠定了基础体亚型针对抗体轻链 Kappa 链全长基因设计 3 套引物 HKP1~HKP3 分别对应 12 种 13 种 15 种抗体亚型 23 bla promoter Amp (R) CMV promoter BstXⅠ SfiⅠ BsmBⅠ pdgb-hc-tm BsmBⅠ puc origin BstXⅠ HCTM BGH pa BstXⅠ 1 材料与方法 1.1 材料膀胱癌患者的外周血取自南方医院泌尿外科术后病理检查确诊为膀胱癌术前3 d采血 RNA提取试剂盒购自 QIAGEN 公司 Green MasterMix M-MuLV 购自 Promega 限制性内切酶 T4DNA 连接酶购自 Fermentas公司质粒DNA小提制剂盒 DNA凝胶回收试剂盒购自 Axygen 公司化学感受态大肠杆菌 TOPO-10 由本实验室根据标准程序自行制备转化效 7 率约为 /μg PUC19 细胞转染试剂购自杭州环捷科技有限公司荧光标记抗体购自 BD Pharmingen FCHO 细胞购自 Invitrogen 公司 Ham'SF12 培养基 DMEM培养基血清购自HyClone 1.2 载体和引物本实验室前期工作中已经成功构建了真核表达载体 pdgb-hc-tm 21 结构如图 1 所示包括 CMV 启动子用于控制插入基因的表达 IgG1 重链基因 HC 包括可变区和恒定区血小板衍生生长因子受体的跨膜序列 TM 氨苄青霉素抗性基因及相应酶切位点经 BsmBⅠ或SfiⅠ酶切后可分别插入重链可变区或轻链全长基因转染哺乳动物细胞后可以在细胞表面检测到全长人源抗体的表达另外也成功构建了真核表达载 22 体pDGB4 结构如图2所示包含双表达框架并含有被限制性内切酶 BsmBⅠ BstXⅠ和 SfiⅠ识别的序列通过一次四片段连接即可将轻链全长和重链可变区基因插入该载体且能在哺乳动物细胞表面展示全长二价抗体 RT 引物 PCR 引物参照 V-base 网站设计并由 Invitrogen 公司合成针对抗体重链可变区基因设计 3 套引物 HGP1~HGP3 分别对应 14 种 13 种 13 种抗 SfiⅠ 图1 pdgb-hc-tm载体结构 Fig.1 Schematic illustration of vector pdgb-hc-tm. af-s gh polya BstXⅠ CMV promoter SfiⅠ SfiⅠ BsmBⅠ BGHpA ERT pdgb4 BsmBⅠ BstXⅠ Hygromycin No ATG CMV promoter bla promoter SV40-pA Amp Ori 图2 pdgb4载体结构 Fig.2 Schematic illustration of vector pdgb 方法分离PBMC和提取总RNA 术前3 d抽取10个膀胱癌患者的外周血各10 ml 所有病人经术后病理确诊为膀胱癌密度梯度离心法分离外周血单核细胞 PBMC 采用QIAGEN RNA提取试剂盒提取总RNA NanoDrop 微量核酸蛋白定量仪测定总RNA的浓度扩增 IgG1 抗体重链可变区 VH 和 kappa 型轻链全长 LCκ 基因以上述膀胱癌患者的外周血单核细胞的 2 μg 总 RNA 为模板与重链可变区和轻链全长基因的特异性反向引物混合 70 水浴变性 5 min 迅速置冰浴 5 min 在 M-MuLV RT 酶作用下合成 cdna 第一

686 链以 cdna 为模板, 用 3 组重链引物 ( 扩增 40 种 IgG1 重链亚型 ) 和 3 组轻链引物 ( 扩增 40 种 kappa 轻链亚型 ) 在 Master Mix 作用下进行 PCR 扩增 PCR 条件如下 : 94 预变性 5 min,35 个循环的 PCR 扩增 (94 变性 30 s,55 退火 30 s,72 延伸 1 min), 随后 72 延长 7

3 686 链以 cdna 为模板, 用 3 组重链引物 ( 扩增 40 种 IgG1 重链亚型 ) 和 3 组轻链引物 ( 扩增 40 种 kappa 轻链亚型 ) 在 Master Mix 作用下进行 PCR 扩增 PCR 条件如下 : 94 预变性 5 min,35 个循环的 PCR 扩增 (94 变性 30 s,55 退火 30 s,72 延伸 1 min), 随后 72 延长 7 min, 以确保全长目的片段的合成 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物, 采用 DNA 凝胶试剂盒回收目的片段酶切 PCR 产物 pdgb-hc-tm 载体及连接采用 BsmBⅠ 充分酶切重链可变区 PCR 产物, 电泳纯化回收目的片段 ; 采用 SfiⅠ 充分酶切轻链全长的 PCR 产物, 电泳纯化回收目的片段用 BsmB Ⅰ Sfi Ⅰ 分别酶切 pdgb-hc-tm 载体, 电泳纯化回收载体片段将上述经 BsmBⅠ 酶切的重链可变区片段和 BsmBⅠ 酶切的载体片段, 在 100 ng/10 μl 总连接体系中, 按摩尔数比为 1 1 的比例混合, 在 T 4DNA 连接酶作用下 16 水浴连接过夜将上述经 SfiⅠ 酶切的轻链片段和 SfiⅠ 酶切的载体片段参照上述方法连接过夜分别构建重链抗体基因库和轻链抗体基因库将连接产物进行化学转化构建抗体库, 自行制备的化学感受态细菌每管转化 1ul 连接产物, 将转化后的菌液涂于含有氨苄青霉素的 LB 细菌培养皿上,37 温箱培养过夜, 根据细菌生长的克隆数计算重链基因库库容量并回收菌落, 并随机挑取 10 个单克隆进行摇菌过夜, 质粒小提后进行基因测序并瞬时转染 FCHO 细胞按照同样的方法转化构建轻链基因库, 挑取 10 个单克隆进行分析单克隆瞬时转染 FCHO 细胞转染前 1 d, 按每孔个细胞的密度将常规培养的 FCHO 细胞接种于 12 孔细胞培养板重链基因库的 10 个单克隆质粒 DNA, 各与已知的阳性轻链 pdgb-hc-hukappa 配对, 各 1 μg 加入 100 μl 的 DMEM 中, 静置 2~3 min, 将其缓慢加入含 6 μl Dgen Transfect Reagent 的 100 μl DMEM 中, 混匀后室温静置 25~30 min, 将混合物直接加入细胞培养孔中轻链基因库的 10 个单克隆各与已知的阳性重链 pdgb-hc-tm 配对, 按照同样方法转染 12 孔板的 FCHO 细胞 pdgb-hc-tm 和 pdgb-hc-hukappa 配对转染 FCHO 做阳性对照, 不加任何质粒的 FCHO 细胞做阴性对照转染后 6 h 更换培养液,48 h 后染色进行流式细胞仪检测染色流式细胞仪检测瞬时转染的 12 孔板 FCHO 细胞, 去除培养基后, 用 1 PBS 洗涤两遍,0.5 μmol/l 的 EDTA+EGTA 溶液 150 μl 消化, 加 1 ml 染色缓冲液吹打细胞转移至 1.5 ml EP 管离心,50 μl 染色缓冲液重悬, 加入 2 μl 的标记鼠抗人 kappa 型轻链抗体 ( 我们前期的实验证明, 利用该方法联合转染 FCHO 细胞, 只要在细胞表面检测到轻链抗体存在, 那么同时也会存在重链抗 [20-21, 24-26] 体 ), 冰上孵育 30 min 后离心, 去除上清后用染色缓冲液洗涤细胞 1 次,400 μl 染色缓冲液重悬, 立刻进行流式细胞仪检测二级抗体基因库的构建在上述已构建的全长人源抗膀胱癌特异性抗体初级基因库的基础上, 分别提取重链库和轻链库的 DNA, 用 BsmBⅠ 和 SfiⅠ 分别酶切重链库 DNA 和轻链库 DNA, 电泳后用 DNA 凝胶回收试剂盒分别回收重链库可变区基因片段 (0.45 kb) 和轻链库全长基因片段 (0.75 kb); 用 BsmBⅠ 和 SfiⅠ 同时酶切通用载体 pdgb4, 得到四个片段, 分别为 kb, 电泳后用 DNA 凝胶回收试剂盒回收其中的 5 kb 和 3 kb 片段 ; 将酶切回收的轻链库重链库基因与通用载体 pdgb4 的 5 kb 和 3 kb 片段进行四片段连接, 按摩尔数比为的比例混合, 每个 1.5 ml EP 管采用 10 μl 98 ng(11.25 ng( )+6.75 ng( )+50 ng+30 ng=98 ng) 的连接体系, 共 10 个 EP 管, T 4DNA 连接酶作用下 16 连接 24 h 后将连接产物进行化学转化构建抗体库 ; 按照标准程序自行制备的化学感受态细菌每管 50 μl, 转化 1 μl 连接产物, 将转化后的菌液涂于含有氨苄青霉素的 LB 细菌培养皿上,37 温箱培养过夜, 根据生长出的细菌克隆数计算基因库容量, 并回收平皿上所有菌落, 即为同时包含轻重链的抗体基因库二级抗体基因库单克隆转染 FCHO 细胞染色及流式细胞仪检测将上述 10 个单克隆的质粒转染 12 孔板中的 FCHO 细胞, 并单独转染 pdgb4 的一个孔作为对照具体过程如 1.2.5,1.2.6 所述 2 结果 2.1 提取总 RNA 提取总 RNA 共分离到个 PBMC, 按个细胞加入 600 μl RLT 的比例裂解细胞, 混合后取约 1 ml 混合液提取到约 3.5 μg 总 RNA 2.2 RT-PCR PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳 ( 图 3), 重链和轻链引物扩增目的条带大小分别为 0.45 kb 和 0.75 kb, 与预计的重链可变区和轻链全长条带大小相符将目的条带进行 DNA 凝胶回收, 重链和轻链的各组 PCR 引物各取 700 ng 进行混合凝胶电泳, 杂质 DNA 条带明显减少, 回收目的 DNA 片段 0.45 kb 0.75 kb 图 3 RT-PCR 产物电泳分析 Fig.3 Analysis of RT-PCR products. VH: 0.45 kb; LCκ: 0.75 kb.

2.3 成功构建膀胱癌特异性的重链和轻链抗体基因库一级抗体库用效率为 1.5 107 的化学感受态细胞转化连接产物每μg重链连接产物转化效率达到2.2 106 根据培养皿上克隆数计算重链基因库的库容量达到1.7 106 每 6 μg 轻链连接产物效率达到 2.7 10 根据培养皿上克隆数计算轻链基因库的库容量可达 3.1 105 理论上膀胱癌特异性的抗体基因库库容量可达到 1.

4 基因测序及流式细胞仪检测随机挑取重链10个单克隆进行基因测序其中7个 687 重链单克隆含有正确的重链可变区编码序列编码7个特异的氨基酸序列图4A 将这7个重链单克隆质粒与已知表达轻链的质粒配对共转染FCHO细胞后均可在细胞表面检测到抗体的表达图5 随机挑取的轻链 10个单克隆有9个含有正确的轻链全长编码序列编码 9 个特异的氨基酸序列图 4B 转染 FCHO 细胞后均

4 2.3 成功构建膀胱癌特异性的重链和轻链抗体基因库一级抗体库用效率为的化学感受态细胞转化连接产物每μg重链连接产物转化效率达到根据培养皿上克隆数计算重链基因库的库容量达到每 6 μg 轻链连接产物效率达到根据培养皿上克隆数计算轻链基因库的库容量可达理论上膀胱癌特异性的抗体基因库库容量可达到 = 基因测序及流式细胞仪检测随机挑取重链10个单克隆进行基因测序其中7个 687 重链单克隆含有正确的重链可变区编码序列编码7个特异的氨基酸序列图4A 将这7个重链单克隆质粒与已知表达轻链的质粒配对共转染FCHO细胞后均可在细胞表面检测到抗体的表达图5 随机挑取的轻链 10个单克隆有9个含有正确的轻链全长编码序列编码 9 个特异的氨基酸序列图 4B 转染 FCHO 细胞后均可在细胞表面检测到抗体的表达图5 结合单克隆测序和流式细胞分析结果我们所构建的膀胱癌特异性抗体库可表达库容量为 [( %) ( %)] 2.5 成功构建膀胱癌特异性的二级抗体基因库 A B 图4 重链和轻链单克隆氨基酸序列的比对分析 Fig.4 Analysis of amino acid sequences of VH (A) and LCκ (B) clones. 用BsmBⅠ和SfiⅠ分别酶切重链库DNA和轻链库 DNA 电泳后用DNA凝胶回收试剂盒分别回收重链库可变区基因片段 0.45 kb 图6A 和轻链库全长基因片段 0.75 kb 图 6B 用 BsmBⅠ和 SfiⅠ同时酶切通用载体 pdgb4 得到四个片段分别为 kb 电泳后用DNA凝胶回收试剂盒回收其中的5 kb和3 kb 片段图 7 用效率为的化学感受态细菌转化连接产物每μg 连接产物转化效率达到根据培养皿上克隆数计算二级抗体基因库的库容量达到二级抗体库单克隆在FCHO细胞表面的展示将挑取的10个单克隆的DNA转染FCHO细胞使

5 % 27.32% 4.28% Neg % Pos % A % B % C D % 6.4% E % F % G % H I J % 3.14% 8.18% K % L M % 7.66% N O P 图 5 流式细胞仪分析抗体在 FCHO 细胞表面的表达 Fig.5 FACS analysis of antibody expression on mammalian cell surfaces. The single cell clones were expanded, labeled with -K and analyzed by FACS. Neg: Negative cell clone; Pos: Positive cell clone; A-G: VH clones co-transfected with pdgb-hukappa; H-P: LCκ clones co-transfected with pdgb-hc-tm.

689 A B 用流式细胞仪对 FCHO 细胞表面的抗体表达进行分析, 结果如图 8 所示, 有 8 个单克隆能够检测到抗体的表达 ( 单克隆 2 3 4 5 7 8 9 10) 3 讨论由于鼠源抗体的异源性, 应用于人体时会产生人抗鼠抗体反应 (HAMA 反应 ) [8], 理想的治疗性抗体应为全长人源抗体目前广泛应用的噬菌体展示技术只能筛选抗体片段而非全长抗体,

6 689 A B 用流式细胞仪对 FCHO 细胞表面的抗体表达进行分析, 结果如图 8 所示, 有 8 个单克隆能够检测到抗体的表达 ( 单克隆 ) 3 讨论由于鼠源抗体的异源性, 应用于人体时会产生人抗鼠抗体反应 (HAMA 反应 ) [8], 理想的治疗性抗体应为全长人源抗体目前广泛应用的噬菌体展示技术只能筛选抗体片段而非全长抗体, 所用的载体细胞是细菌, 没有转录后修饰功能, 筛选到的抗体往往亲和力较低 [9-14] 由于细菌所用的密码子不同于哺乳动物细胞, 因此通过噬菌体展示技术筛选到的抗体, 在哺乳动物细胞内往往表达很低, 后期的改造难度大, 成功率低哺乳动物细 [15-20] 胞表面抗体展示技术是理想的筛选人源抗体的技术平台, 因为这个平台能够展示全长抗体, 可以提供蛋白质的正确折叠和转录后的修饰功能 0.45 kb 0.75 kb 图 6 用 BsmBⅠ 和 SfiⅠ 酶切分析重链库 DNA 和轻链库 DNA Fig.6 Restriction enzyme digestion of library DNA. A: BsmBⅠ digestion of VH library DNA; B: SfiⅠdigestion of LCκ library DNA. 图 7 BsmBⅠ 和 SfiⅠ 同时酶切分析载体 pdgb4 Fig.7 Restriction enzyme digestion of vector pdgb4. 5 kb 3 kb 0.75 kb 0.45 kb 在本研究中, 我们构建了大容量的膀胱癌特异性的抗体基因库, 并实现了在哺乳动物细胞表面的高效表达在构建抗体库的过程中, 我们选用了识别和切割非回文序列的限制性内切酶 BsmBⅠ 和 SfiⅠ, 可以减少自连实现定向克隆, 因而大大的提高了抗体基因的插入效率我们从经过病理确诊的膀胱癌患者的外周血单核细胞提取总 RNA, 通过设计的特异性引物扩增全套人源 IgG1 抗体重链可变区 (VH) 和 kappa 型轻链全长基因, 酶切后分别插入 pdgb-hc-tm 载体, 每 μg DNA 的连接效率分别达到了和利用该方法, 我们构建的重链基因库库容量达到 , 轻链基因库库容量达到 , 抗体库共转染哺乳动物细胞后, 可以通过哺乳动物细胞的天然配对机制进行随机配对, 理论上我们所构建的膀胱癌抗体库多样性可以达到 [( ) ( )] 并不是所有经 PCR 扩增并插入表达载体的抗体基因都能够在哺乳动物细胞表面表达并且被流式细胞仪检测到因此, 为验证所构建抗体库的扩容量, 我们参 [24-25] 照前期研究方法, 分别从重链库和轻链库中随机挑取 10 个单克隆进行培养扩增, 送 Ivitrogen 公司进行测序 10 个重链库克隆质粒 DNA 测序结果表明 7 个含有正确的重链可变区编码序列, 编码 7 个特异的氨基酸序列 ;10 个轻链库克隆质粒 DNA 测序结果表明 9 个含有正确的 LCκ 编码序列, 编码 9 个特异的氨基酸序列将上述重链库和轻链库的测序正确的单克隆分别与已知表达轻链或者重链的质粒共转染 FCHO 细胞, 用相应的荧光标记的抗体对细胞进行染色 ( 用量仅为生产厂家建议用量的 1/4 到 1/7), 结合流式细胞仪分析, 结果重链库 7 个克隆均可以在细胞表面检测到全长人源抗体的表达 ; 轻链库 9 个克隆均可以在细胞表面检测到全长人源抗体的表达所以我们的抗体库的可表达库容量达到 [( %) ( %)], 可以满足高亲和力高特异性抗体的筛选构建抗体库的目的是为了能够从中筛选获得特异性的抗体, 在完成抗体库的构建之后, 需要将全长抗体库稳定地展示在哺乳动物细胞表面才能用于抗体的直接筛选我们分别构建了大容量的膀胱癌特异性抗体重链基因库和抗体轻链基因库, 两个抗体库共同转染哺乳动物细胞时, 可方便地获得大容量的全长抗体库但这种用两个载体分别携带抗体重链与轻链的抗体库不便于用来稳定转染哺乳动物细胞 ; 若要用这两个抗体库来稳定转染哺乳动物细胞, 则需要在接受转染的哺乳动物细胞基因组中建立两个定点整合位点, 且需要这两个抗体库携带不同的选择性基因, 这将增加实际操作的难度因此, 我们考虑利用哺乳动物细胞表达载体 pdgb4 [22] 同时携带抗体的重链基因和抗体的轻链基因, 用于稳定转染哺乳动物细胞, 使细胞表面稳定展示全长抗体哺乳动物细胞表达载体 pdgb4 含有双启动子, 能够同时表达抗体重链和抗体轻链, 由接受转染的细胞来完成抗体重链和轻链的组合 ; 同时, 载体 pdgb4 含有 Flip-In 定点整合位点, 可经质粒 pog44 表达的 Flip-In

7 % 16.64% 4 1.9% Neg 10 1 Pos % 3.09% 7.07% % 1.5% 3.84% % % 3.23% 图 8 pdgb4 载体所构建的抗体库的单细胞克隆流式细胞仪分析 Fig.8 FACS analysis of antibody expression on single cell clones. Neg: Negative cell clone; Pos: Positive cell clone; 1-10: FCHO cells transfected with 10 clones' DNA respectively, and 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, and 10 can express the antibody. 重组酶催化, 将所携带的基因定点整合至宿主细胞的基因组中, 并且只有经过正确整合之后, 载体 pdgb4 所携带的选择性抗生素抗性基因才可成功表达, 从而保证获得定点整合的宿主细胞能够在含有对应抗生素的培养 [26] 基中生存 Li 等用 pdgb4 载体成功构建乙肝病毒特异性抗体库 ( 二级抗体库 ), 并从此抗体库中筛选到乙肝病毒表面抗原特异性单克隆抗体本研究使用的接受稳定转染的哺乳动物细胞是购自英韦创津 (Invitrogen) 公司的含有 Flip-In 定点整合位点的中国仓鼠卵巢 (Chinese hamster ovary) 细胞 (FCHO 细胞 ), 由于每个 FCHO 细胞的基因组中只含有一个与载体 pdgb4 相匹配的整合位点, 故经稳定转染后所获得的细胞群体中每个细胞只能整合一个载体的基因, 从而保证每个细胞只表达一种抗体因此, 本实验通过 4 片段连接的方法, 将抗体库轻重链同时插入双表达载体 pdgb4, 成功构建了膀胱癌二级抗体基因库, 库容量达到转染 FCHO 后, 随机挑选的 10 个单克隆有 8 个能够表达出可被检测到的抗体, 可表达库容量达到 , 为下一步筛选膀胱癌特异性抗体奠定了基础抗体库的库容量越大, 筛选获得特异性抗体的几率就越大为提高筛选获得特异性抗体的几率, 应在现有条件下充分增大抗体库的库容量在下一步工作中, 我们将进一步扩大二级抗体库的库容量, 重点开展特异性抗体的筛选工作, 并及时分析筛选到的抗体的特异性和亲和

8 691 力, 争取早日获得新的有中和活性的抗体综上所述, 本研究通过前期构建的真核表达载体 pdgb-hc-tm [21], 成功构建了一个膀胱癌特异性抗体库, 通过单克隆测序和转染 FHCO 细胞后流式细胞仪检测, 我们所构建的抗体库库容量高达 , 通过真核细胞双表达载体 pdgb4 [22] 构建了二级抗体基因库, 库容量达到 , 通过流式细胞仪分析可检测到抗体的表达, 为下一步筛选全长人源抗膀胱癌抗体打下良好的基础参考文献 : [1] Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. Cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2008, 62(1): [2]Tolley DA, Parmar MK, Grigor KM, et al. The effect of intravesical mitomycin C on recurrence of newly diagnosed superficial bladder cancer: a further report with 7 years of follow up[j]. J Urol, 1996, 155(4): [3]Sylvester RJ, van der Meijden AP, Oosterlinck W, et al. Predicting recurrence and progr-ession in individual patients with stage Ta T1 bladder cancer using EORTC risk tables: a combined analysis of 2596 patients from seven EORTC trials[j]. Eur Urol, 2006, 49(3): [4] Stenzl AN, De Santis MA. The updated EAU guidelines on muscle-invasive and metastatic bladder cancer[j]. Eur Urol, 2009, 55(4): [5] Luedke E, Jaime-Ramirez AC, Bhave N, et al. Monoclonal antibody therapy of pancreatic cancer with cetuximab: potential for immune modulation[j]. J Immunother, 2012, 35(5): [6] Barth M, Raetz E, Cairo MS, et al. The future role of monoclonal antibody therapy in childhood acute leukaemias[j]. Br J Haematol, 2012, 159(1): [7] Chen KS, Mitchell DA. Monoclonal antibody therapy for malignant glioma[j]. Adv Exp Med Biol, 2012: [8] Oei AL, Sweep FC, Massuger LF, et al. Transient human anti-mouse antibodies (HAMA) interference in CA 125 measurements during monitoring of ovarian cancer patients treated with murine monoclonal antibody[j]. Gynecol Oncol, 2008, 109(2): [9] Lamdan H, Ayala M, Rojas G, et al. Isolation of a novel neutralizing antibody fragment against human vascular endothelial growth factor from a phage-displayed human antibody repertoire using an epitope disturbing strategy[j]. J Biotechnol, 2011, 151(2): [10]Zhao Y, Amer S, Wang J, et al. Construction, screening and identification of a phage display antibody library against the Eimeria acervulina merozoite[j]. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 393(4): [11]Solforosi L. Mancini N, Canducci F, et al. A phage display vector optimized for the generation of human antibody combinatorial libraries and the molecular cloning of monoclonal antibody fragments[j]. New Microbiol, 2012, 35(3): [12]Sommavilla R, Lovato V, Villa A, et al. Design and construction of a naïve mouse antibody phage display library[j]. J Immunol Methods, 2010, 353(1-2): [13]Groves MA, Nickson AA. Affinity maturation of phage display antibody populations using ribosome display[j]. Methods Mol Biol, 2012, 805: [14]Wu G, Fan X, Wu H, et al. Bioscreening of phage display antibody library and expression of a humanized single-chain variable fragment antibody against human connective tissue growth factor (CTGF/CCN2)[J]. Biotechnol Appl Biochem, 2010, 56(3): [15]Kim JS, Jang IK, Fan C, et al. Evaluation in 3 months duration of neointimal coverage after zotarolimus-eluting stent implantation by optical coherence tomography: the ENDEAVOR OCT trial[j]. JACC Cardiovasc Interv, 2009, 2(12): [16]Beerli RR, Bauer M, Buser RB, et al. Isolation of human monoclonal antibodies by mammalian cell display[j]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(38): [17]Akamatsu Y, Pakabunto K, Xu Z, et al. Whole IgG surface display on mammalian cells: application to isolation of neutralizing chicken monoclonal anti-il-12 antibodies[j]. J Immunol Methods, 2007, 327(1-2): [18]Sun PY, Zhang YL, Jing YM, et al. A comparative analysis of the methods for tittering adenoviruses[j]. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao, 2011, 31(2): [19]Akamatsu Y, Pakabunto K, Xu Z, et al. Whole IgG surface display on mammalian cells: Application to isolation of neutralizing chicken monoclonal anti-il-12 antibodies[j]. J Immunol Methods, 2007, 327(1-2): [20]Zhou C, Jacobsen FW, Cai L, et al. Development of a novel mammalian cell surface antibody display platform[j]. MAbs, 2010, 2(5): [21]Zhou Y, Chen ZR, LI CZ, et al. A novel strategy for rapid construction of libraries of full-length antibodies highly expressed on mammalian cell surfaces[j]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2010, 42(8): [22]Zhou I, Zhang ZH, LI CZ, et al. Four-way ligation for construction of a mammalian cell-based full-length antibody display library[j]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2011, 43(3): [23]Katoh H, Shite J, Shinke T, et al. Delayed neointimalization on sirolimus-eluting stents: 6-month and 12-month follow up by optical coherence tomography[j]. Circ J, 2009, 73(6): [24] 周烨, 陈振瑞, 贺微, 等. 哺乳动物细胞表面展示全长类风湿关节炎抗体库的构建 [J]. 南方医科大学学报, 2011, 31(8): [25] 周志刚, 朱美华, 梁中锟, 等. 系统性红斑狼疮儿童特异性全长抗体基因库的构建与分析 [J]. 南方医科大学学报, 2012, 32(8): [26]Li CZ, Liang ZK, Chen ZR, et al. Identification of HBsAg-specific antibodies from a mammalian cell displayed full-length human antibody library of healthy immunized donor[j]. Cell Mol Immunol, 2012, 9(2): ( 编辑 : 陈望忠 )

连接

8 南方医科大学学报 J South ed Univ 0;(8) 基础研究系统性红斑狼疮儿童特异性全长抗体基因库的构建与分析周志刚朱美华梁中锟陈振瑞贺微李长征谭万龙姜世勃 5 刘叔文周烨 6 周辰, 7 广州医学院第二附属医院儿科广东广州 560 南方医科大学南方医院药学院中医药学院 6 基因工程研究所广东广州 555 5 复旦大学上海医学院分子病毒学教育部//卫生部重点实验室