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- 吕召 东
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1 概述 Muta-direct 定点突变试剂盒使用说明 Muta-direct 定点突变试剂盒可以在克隆于质粒 DNA 序列的特定位点诱导突变, 理论上可以保证突 变率达到 100%, 整个实验过程简单快捷 只有两步, 而不需要用到 M13 载体和甲基化步骤 该试剂盒 可以诱导某个已知基因的特定碱基进行定点突变 再突变成野生型 密码子突变 插入或者缺失等, 因 此可以用于功能基因组学和蛋白质组学的研究 另外由于试剂盒能够诱导特异基因突变, 又可以应用于 蛋白质工程学研究领域 定点突变试剂盒操作十分简单 ( 根据我们提供的引物设计原则设计引物 ; 用 Muta-direct 酶进行 15~18 个循环的 PCR 扩增反应 ;Mutazyme 酶处理选择突变克隆 ; 转化 ) 理论上在 LB 平板上的克隆 100% 是突变克隆, 通过对突变克隆的测序分析, 正确的突变可以应用于后续实验 PCR amplified Mutated Not Mutated Step 1. Inducing mutation PCR reaction Using Muta-direct Enzyme Step2. Selection Using Mutazyme Enzyme Not digested Digested by Mutazyme Not Transformed Step 3. Transformation Using competent cell (Nick recovering) Transformed Figure 1. Steps of Muta-direct Site-Directed Mutagenesis Kit 产品特点 i. 操作简便, 无需特殊的实验技能 ii. 2~3 天即可完成基因的定点突变
2 a) 整个实验过程只需要用到两种酶 :Muta-direct 酶和 Mutazyme 酶 b) 广泛的使用范围 : 可以用于点突变 (Point mutation), 缺失突变 (Deletion) 和插入突变 (Insertion) 等 c) 100% 的突变效率 贮存条件 请将试剂盒中提供的各种试剂于 -20 贮存 由于试剂盒中提供的反应缓冲液及 dntp 是为反应专门 优化的, 所以不要用其它的反应缓冲液及 dntp 代替 试剂盒组成 试剂盒提供的对照模板及引物, 可以完成 5 次对照实验 包括对照反应在内, 本试剂盒共可进行 15 次基因定点突变反应 ( 每次反应体系 50μl) 组成 次量 Muta -Direct Enzyme (2.5U/μl) 15μl Muta-Direct Reaction Buffer (10 ) 100μl dntp Mixture 30μl Mutazyme Enzyme (10U/μl) 15μl puc18 Control Plasmid (10ng/μl) 10μl Control Primer Mix (20pmol/µl) 15µl Competent cells Not provided 定点突变对照实验试剂盒中提供的对照质粒为 puc18, 通过它可以判断实验的成功与否 puc18 质粒包含 lac Z 基因, 用试剂盒中提供的对照引物可以诱导 puc18 中丝氨酸 (TCG) 突变为终止密码子 (TAG), 这样会导致 lacz 基因失活, 因此 LB 平板上的克隆必须都为白色才证明突变成功 对于首次做突变实验的用户, 可以通过对照反应观察实验是否成功 引物设计 首先需要进行引物设计, 设计时请参考如下原则 通常引物长度为 25~45mer, 我们建议引物长度为 30~35mer 注 : 突变位点应该设计在引物的中央位置 如果设定的引物长度为 30mer, 接下来需要计算引物的 Tm 值, 看是否达到 78 (GC 含量应大于 40%) 如果 Tm 值低于 78, 则适当改变引物的长度以使其 Tm 值达到 78 (GC 含量应大于 40%) 1 设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置 2 计算引物的 Tm 值, 看是否达到 78, 如果 Tm 值低于 78, 则适当改变引物的长度以使其 Tm 值达到 78 (GC 含量应大于 40%) 3 最好使用经过纯化的引物 Tm 值计算公式 :Tm=0.41 (% of GC) 675/L+81.5 注 :L: 引物碱基数 ;% of GC: 引物 GC 含量
3 引物设计实例 以 GCG ACG 为例 : 5 -CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3 1 首先设计 30mer 长的上下游引物, 并将 A(T) 设计在引物的中央位置 Primer #1: 5 -CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3 Primer #2: 5 -GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3 2 引物 GC 含量为 40%, L 为 30, 将这两个数值带入 Tm 值计算公式, 得到其 Tm=75.5 (Tm= / ) 通过计算可以看出其 Tm 低于 78, 这样的引物是不合适的, 所以必须 调整引物长度 3 重新调整引物长度 Primer #1: 5 -CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3 Primer #2: 5 -CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3 在引物两端加 5mer( 斜体下划线处 ), 这样引物的 GC 含量为 45.7%,L 值为 35, 将这两个数值带入 Tm 值计算公式, 得到其 Tm 为 (Tm= / ), 这样的引物就可以用于突变实验了 实验前注意事项 试剂盒提供了优化的实验方案, 按步骤操作诱导目的基因突变率几乎可达 100% 白色菌落的形成与突变效率是不同的, 在实验过程中重要的是出现白色单菌落而不是菌落出现的数量 如果出现白色菌落则证明在目的基因上已经发生了突变 有时由于 Mutazyme 处理步骤的失误, 残留的模板质粒也能形成白色菌落 但如果您操作无误, 这种情况一般不会发生 白色菌落的数量与突变率是没有直接关系的, 而与 PCR 反应条件和感受态细胞转化效率有关 如果突变没有出现在目的核苷上时, 请检测合成引物的纯度 当 PCR 反应完成后,Mutazyme 酶的用量就会影响到实验结果 若模板过量会产生阴性结果, 因此 Mutazyme 和质粒模板的用量必须适当 试剂盒适用于 15kb 甚至大于 15kb 的模板突变, 但是当所用的质粒模板大于 10kb 时, 白色菌落数量会减少, 不过这与突变效率没有关系 定点突变操作步骤 [A] 诱导突变基因 (PCR 反应 ) 以待突变的质粒为模板, 用设计的引物及 Muta-direct 酶进行 PCR 扩 增反应, 诱导目的基因突变 设计点突变引物 [ 注 ] 参考引物设计指导 准备模板质粒 DNA [ 注 ] 用 dam + 型菌株 ( 例如 DH5α 菌株 ) 作为宿主菌 在 end + 型菌株中常有克隆数低的现象, 但是对 突变效率没有影响 提取质粒 DNA 时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒 [ 选项 ] 对照反应体系 (50μl 反应体系 ) 10 Reaction Buffer puc18 control plasmid(10ng/μl, total 20ng) 5μl
4 Control primer mix(20pmol/μl) dntp mixture(each 2.5mM) ddh2o Muta-direct Enzyme 样品反应体系 (50μl 反应体系 ) 10 Reaction Buffer Sample plasmid(10ng/μl,total 20ng) Sample primer (F)(10pmol/μl) Sample primer (R)(10pmol/μl) dntp mixture(each 2.5mM) ddh2o Muta-direct Enzyme PCR 反应条件 38μl 5μl 38μl [ 注 ] 按如下参数设置 PCR 扩增条件 Cycles Temperature Reaction Time 1cycle 95 30sec 15cycle sec 1min 1min per plasmid Kb PCR 扩增反应完成后冰育 5 分钟, 然后置于室温 ( 避免反复冻融 ) [ 注 ] 按下列提供的 PCR 条件进行扩增, 控制 PCR 循环数 注意当突变点位点超过 4 个时会发生突变 率降低的现象 Mutation 1~2Nucleotide 3Nucleotides Cycles 15cycles 18cycles [B] 突变质粒选择 PCR 反应结束后使用 Mutazyme 酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒 DNA 1. 准备 PCR 反应产物 2. 加入 (10U/μl)Mutazyme 酶 37 温育 1 小时 [ 注 ] 当质粒 DNA 用量过多时 Mutazyme 酶可能发生与样品反应不完全的现象 因此我们建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作 如果突变率低, 可以适当延长反应时间或增加 Mutazyme 酶用量 [C] 转化反应完毕后在质粒 DNA 上会产生缺口, 当把这个质粒 DNA 转入 E.coli 中时请选择 dam + 型菌株, 例如 DH5α 1. 将 10μl 样品加到 50μl 感受态细胞里, 然后放置在冰上 30 分钟 2. 接下来可以参照一般的转化步骤进行
5 序列分析 通常当 LB 平板上出白色菌落则表明发生了突变 为了证实这一结果, 我们建议对白色单菌落进行测序分析 突变实例 以 GGC GAC 为例 [ 突变反应体系 ] 10 Reaction Buffer Sample plasmid(6.3kb,10ng/μl,total 20ng) Sample primer(f)( 10pmol/μl) Sample primer(r)( 10pmol/μl) dntp mixture(2.5mm each) dh 2O Muta-direct Enzyme 5μl 38μl [PCR 条件 ] [ 序列分析 ] 突变质粒测序结果 Cycles Temperature Reaction Time 1cycle 95 30sec 15cycle sec 1min 1min per plasmid Kb
6 常见问题 无单菌落出现 突变率低 错误突变 通过电泳检测 PCR 反应体系 解决方案 如果是 PCR 反应的问题可以通过调节退火温度进行解决 检测感受态细胞的转化效率 Mutazyme 酶处理不当 增加 Mutazyme 酶用量或延长反应时间 检查模板质粒用量 质粒用量过多会引起突变率降低 检测合成引物的质量
产品简介体外定点突变技术是当前生物 医学各领域研究中的一种重要实验手段, 多用于改造 优化目的基因 ; 探索启动子的调节位点 ; 以及研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系 本试剂盒采用目前领先技术, 可在目标载体上直接对靶基因进行单点突变, 多点突变及插入或缺失突变, 并且单点突变的突变率可达 90%
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