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束任
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1 AxyPrep 总 RNA 小量制备试剂盒本试剂盒用于从各种动物组织植物组织细胞细菌酵母和丝状真菌中提取总 RNA 提取的总 RNA 分子完整纯度高, 适用于 Northern Blot RT-PCR 体外翻译 Primer Extension S1 核酸酶作图 RNase 保护测定构建 cdna 文库等各种分子生物学实验一试剂盒组成贮存稳定性 Cat. No. AP-MN-MS-RNA-4 AP-MN-MS-RNA-50 AP-MN-MS-RNA-250 Kit size 4 preps 50 preps 250 preps Spin/vac mini column ml Microfuge tube ml Microfuge tube Buffer R-Ⅰ 3 ml 25 ml 125 ml Buffer R-Ⅱ 1 ml 10 ml 50 ml Buffer W1A concentrate 2.4 ml 24 ml 120 ml Buffer W2 concentrate 2.4 ml 24 ml 2 72 ml Buffer TE 1 ml 6 ml 30 ml Protocol manual Spin/vac mini column: 小量制备管 Buffer R-Ⅰ: 细胞裂解液室温密闭贮存 Buffer R-Ⅱ: 中和液室温密闭贮存 Buffer W1A concentrate: 洗涤液使用前, 根据瓶上指定的体积加入乙醇, 混合均匀, 室温密闭贮存可用无水乙醇或 95% 乙醇 Buffer W2 concentrate: 去盐液使用前, 根据瓶上指定的体积加入乙醇, 混合均匀, 室温密闭贮存可用无水乙醇或 95% 乙醇 Buffer TE : 洗脱液 10 mm Tris-HCl,0.1 mm EDTA,pH 7.5 室温密闭贮存二注意事项 Buffer R-Ⅰ 和 Buffer W1A 含刺激性化合物, 操作时要戴乳胶手套和眼镜, 避免沾染皮肤眼睛和衣服, 谨防吸入口鼻若沾染皮肤眼睛时, 要立即用大量清水或生理盐水冲洗, 必要时寻求医疗咨询三实验准备 1. 第一次使用时, 在 Buffer W1A concentrate 和 Buffer W2 concentrate 中按试剂瓶上指定体积加入无水乙醇或 95% 乙醇 2. 所有试剂用 DEPC 处理过的溶剂配制请选用 RNase-free 枪头和离心管, 以避免提取过程中 RNA 被 RNase 降解 Page 1

2 四操作步骤不同的样品提取总 RNA 的操作中略有区别, 具体步骤分述如下 : 从动物组织中提取总 RNA 1. 取 mg 组织, 转移至预冷的研钵中, 加液氮研磨成粉末 * 请按下面说明使用组织的量 : RNA 丰富的组织 ( 如肝脏 ) RNA 含量低的组织 ( 如肌肉 ) 当使用的组织量小于 20 mg 时当使用的组织量大于 40 mg 时不超过 30 mg 不超过 100 mg R-Ⅰ,R-Ⅱ 和异丙醇的使用量都减半 R-Ⅰ,R-Ⅱ 和异丙醇的使用量按比例增加 2. 加入 400 μl Buffer R-Ⅰ, 用装有号针头的注射器反复抽吸 8-10 次, 转入 1.5 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中 3. 加入 150 μl Buffer R-Ⅱ, 漩涡振荡 s,12,000 g 离心 5 min 4. 取上清至 1.5 ml 离心管中, 加入 250 μl 异丙醇, 混和均匀 5A. 将制备管置于 2 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中, 转移步骤 4 中的混合液到制备管中,6,000 g 8A. 弃滤液, 将制备管置回到 2 ml 离心管中,12,000 g Page 2

3 8B. 将制备管置于一个 2 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中,12,000 g 从植物组织中提取总 RNA 1. 取 mg 组织, 转移至预冷的研钵中, 加液氮研磨成粉末 * 请按下面说明使用组织的量 : 植物叶子植物纤维组织当植物叶组织量小于 30 mg 时当植物叶组织量大于 80 mg 时当植物纤维组织量大于 150 mg 时通常用量 mg 通常用量 mg R-Ⅰ,R-Ⅱ 和异丙醇的使用量都减半 R-Ⅰ,R-Ⅱ 和异丙醇的使用量按比例增加 R-Ⅰ,R-Ⅱ 和异丙醇的使用量按比例增加 2. 加入 400 μl Buffer R-Ⅰ, 用装有号针头的注射器反复抽吸 8-10 次, 转入 1.5 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中 3. 加入 150 μl Buffer R-Ⅱ, 漩涡振荡 s,12,000 g 离心 5 min 4. 取上清至 1.5 ml 离心管中, 加入 250 μl 异丙醇, 混和均匀 5A. 将制备管置于 2 ml( 试剂盒内提供 ) 离心管中, 转移步骤 4 中的混合液到制备管中,6,000 g Page 3

4 8A. 弃滤液, 将制备管置回到 2 ml 离心管中,12,000 g 离心 1min 8B. 将制备管置于一个 2 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中,12,000 g 从细胞中提取总 RNA 步骤 1-4 根据细胞培养的方式不同可以选择 a 或 b 两种实验方法 a. 悬浮培养的动物细胞或从培养皿培养瓶中获得的细胞悬浮液或新鲜分离的动物组织单细胞悬浮液 : 1a. 收集的细胞,2,000 g 离心 5 min, 弃上清 2a. 加入 400 μl Buffer R-Ⅰ, 用装有号针头的注射器反复抽吸 8-10 次, 转入 1.5 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中 3a. 加入 150 μl Buffer R-Ⅱ, 漩涡振荡 s,12,000 g 离心 5 min 4a. 取上清至 1.5 ml 离心管中, 加入 250 μl 异丙醇, 混和均匀 Page 4

5 b. 96- 孔, 24- 孔,12- 孔, 或 6- 孔培养板上贴壁培养的细胞 : 1b. 从 96- 孔,24- 孔,12- 孔或 6- 孔培养板里收集细胞, 尽量弃去培养基, 每孔加入 300 μl Buffer R-Ⅰ, 用移液枪上下吹打 8-10 次 2b. 转移上述细胞悬浮液到 1.5 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中, 用装有号针头的注射器反复抽吸 8-10 次 3b. 加入 110 μl Buffer R-Ⅱ, 漩涡振荡 s,12,000 g 离心 5 min 4b. 取上清至 1.5 ml 离心管中, 加入 200 μl 异丙醇, 混和均匀 5A. 将制备管置于 2 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中, 转移步骤 4 中的混合液到制备管中,6,000 g 8A. 弃滤液, 将制备管置回到 2 ml 离心管中,12,000 g Page 5

6 8B. 将制备管置于一个 2 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中,12,000 g 从细菌中提取总 RNA 1. 收集的细菌,6,000 g 离心 10 min, 弃上清用 50 μl PBS 充分悬浮菌体并转移至预冷的研钵中, 加液氮研磨成粉末 * 请进行细菌计数, 对于大肠杆菌而言, /ml 细菌的 OD 如果细菌量小于 ,R-I,R-II 和异丙醇用量减半如果细菌量大于 ,R-I,R-II 和异丙醇按比例增加 2. 加入 400 μl Buffer R-Ⅰ, 用装有号针头的注射器反复抽吸 8-10 次, 转入 1.5 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中 3. 加入 150 μl Buffer R-Ⅱ, 漩涡振荡 s,12,000 g 离心 5 min 4. 取上清至 1.5 ml 离心管中, 加入 250 μl 异丙醇, 混和均匀 5A. 将制备管置于 2 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中, 转移步骤 4 中的混合液到制备管中,6,000 g 8A. 弃滤液, 将制备管置回到 2 ml 离心管中,12,000 g Page 6

7 8B. 将制备管置于一个 2 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中,12,000 g 从酵母中提取总 RNA 本方案用于从的酵母细胞中提取 RNA 请进行酵母细胞计数, 也可用如下方法估算 : 对于一般酵母培养物而言, /ml 酵母细胞的 OD 如果酵母量小于 ,R-I,R-II 和异丙醇用量减半如果酵母量大于 ,R-I,R-II 和异丙醇按比例增加酵母的破碎和裂解方法有两种 : 机械法 ( 如下 a) 和酶法 ( 如下 b) 机械法采用加液氮研磨的方法, 酶法用 Lyticase 破壁形成原生质体步骤 1-4 根据酵母的破碎和裂解方式不同可以选择 a 或 b 两种实验方法 a. 机械法 1a. 收集的酵母细胞,6,000 g 离心 10 min, 弃上清用 50 μl PBS 充分悬浮酵母细胞并转移至预冷的研钵中, 加液氮研磨成粉末 2a. 加入 400 μl Buffer R-Ⅰ, 用装有号针头的注射器反复抽吸 8-10 次, 转入 1.5 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中 3a. 加入 150 μl Buffer R-Ⅱ, 漩涡振荡 s,12,000 g 离心 5 min 4a. 取上清至 1.5 ml 离心管中, 加入 250 μl 异丙醇, 混和均匀 b. 酶法配置 Buffer YE: 1 M 山梨糖醇 0.1 M EDTA, ph 7.5 使用前加入 0.1% (V/V) 的 β- 巯基乙醇 Page 7

8 1b. 收集的酵母细胞到 1.5 ml 离心管中,6,000 g 离心 10 min, 弃上清用 1 ml 含有 Lyticase 的 Buffer YE 充分悬浮酵母细胞 30 C 保温 min, 并不时轻柔颠倒以形成原生质体 3,000 g 离心 5 min, 弃上清 * Lyticase 用量按每酵母细胞加 50 单位计算 2b. 加入 400 μl Buffer R-Ⅰ, 用装有号针头的注射器反复抽吸 8-10 次, 转入 1.5 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中 3b. 加入 150 μl Buffer R-Ⅱ, 漩涡振荡 s,12,000 g 离心 5 min 4b. 取上清至 1.5 ml 离心管中, 加入 250 μl 异丙醇, 混和均匀 5A. 将制备管置于 2 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中, 转移步骤 4 中的混合液到制备管中,6,000 g 8A. 弃滤液, 将制备管置回到 2 ml 离心管中,12,000 g Page 8

9 8B. 将制备管置于一个 2 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中,12,000 g 从丝状真菌中提取总 RNA 1. 取 mg 菌丝体, 转移至预冷的研钵中, 加液氮研磨成粉末 * 请按下面说明使用组织的量 : 当使用的组织量小于 30 mg 时当使用的组织量大于 100 mg 时 R-I,R-II 和异丙醇的使用量都减半 R-I,R-II 和异丙醇的使用量按比例增加 2. 加入 400 μl Buffer R-Ⅰ, 用装有号针头的注射器反复抽吸 8-10 次, 转入 1.5 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中 3. 加入 150 μl Buffer R-Ⅱ, 漩涡振荡 s,12,000 g 离心 5 min 4. 取上清至 1.5 ml 离心管中, 加入 250 μl 异丙醇, 混和均匀 5A. 将制备管置于 2 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中, 转移步骤 4 中的混合液到制备管中,6,000 g 8A. 弃滤液, 将制备管置回到 2 ml 离心管中,12,000 g Page 9

10 8B. 将制备管置于一个 2 ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中,12,000 g Page 10

11 五操作流程图加入样品和 400 μl Buffer R-I 裂解加入 150 μl Buffer R-II 12,000 g 离心 5 min 中和加入 250 μl 异丙醇结合加入 500 μl Buffer W1A 加入 700 μl Buffer W2 加入 700 μl Buffer W2 结合洗涤加入 μl Buffer TE ( 或 RNase-free 水 ) 洗脱 Page 11

Microsoft Word - RNA大量制备试剂盒 ver301.doc

Microsoft Word - RNA大量制备试剂盒 ver301.doc AxyPrep 总 RNA 大量制备试剂盒本试剂盒用于从各种动物组织植物组织细胞细菌酵母和丝状真菌中提取总 RNA 提取的总 RNA 分子完整纯度高, 适用于 Northern Blot RT-PCR 体外翻译 Primer Extension S1 核酸酶作图 RNase 保护测定构建 cdna 文库等各种分子生物学实验一试剂盒组成贮存稳定性 Cat. No. AP-MX-MS-RNA-2