Primer Manual and Validation Report I. 概述 II. 产品信息 III. 推荐的配套使用试剂 IV. 产品使用流程 V. 产品应用 VI. miprofile mirna qpcr Primer 验证报告 I. 概述 microrna mirna 是一类由大约2

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俵肝萧
5 years ago
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1 miprofile mirna qpcr Primer Manual and Validation Report For quantitative detection of mature mirna with All-in-One mirna qrt-pcr Detection Kit Catalog number: HmiRQP9071 GeneCopoeia, Inc. 广州复能基因有限公司地址广州高新技术产业开发区广州科学城掬泉路3号广州国际企业孵化器D区8楼定购热线技术支持传真网址邮编 For Research Use Only

2 Primer Manual and Validation Report I. 概述 II. 产品信息 III. 推荐的配套使用试剂 IV. 产品使用流程 V. 产品应用 VI. miprofile mirna qpcr Primer 验证报告 I. 概述 microrna mirna 是一类由大约22个核苷酸组成的单链非编码小分子RNA 参与多个生理活动过程的调控但由于长度太短一般难以检测 miprofile mirna qpcr Primer是特异mature mirna的qpcr检测上游引物其需配合All-in-One mirna qrt-pcr Detection Kit 主要应用于mature-miRNA的定量检测公司推出的miProfile mirna qpcr Primer都经过以cDNA为模板的qPCR实验验证 II. 产品信息 Catalog# Primer ID HmiRQT0001 Mature_Acc Mature_ID PCR size (bp) Positive Control cdna Mix Package Conc. Package size 10 Mix 3 rxn 储存条件: -20 C 保存避免反复冻融 III. 推荐的配套使用试剂 GeneCopoeia All-in-One mirna qrt-pcr Detection Kit (Cat Nos. AOMD-Q020 or AOMD-Q050) IV. 产品使用流程 1. 客户收到本产品时需在离心机上12000rpm 离心30sec 使其液体完全流到离心管底部 2. 本产品为特异mature mirna 的检测上游引物, 已用灭菌ddH2O稀释到使用浓度2µM 即为10 Primer 包装, 使用时客户仅需参考其PCR反应体系的大小吸取一定量的本产品使其终浓度达整个反应体系的1 量即终浓度为0.2µM 即可 3. 使用时客户仅需参考其PCR反应体系的大小吸取一定量的该产品引物, 使其终浓度为0.2µM即可该产品需推荐配合All-in-One mirna qrt-pcr Detection Kit使用具体使用方法敬请参考 miprofile mirna qpcr Primer验证报告中Page6的 mature mirna的qpcr检测部分 4. 产品中附有公司进行产品验证的Positive cdna Mix 模板客户如需要, 可参考 mirna qpcr Primer 验证报告中Page 6的 mature mirna的qpcr 检测部分对本产品进行质检 5. 本产品需配合含SYBR Green 的qPCR 试剂使用不一定适合探针法检测 1/9

3 6. 本产品中配有的Positive Control cdna Mix是采用All-in-One mirna qrt-pcr Detection Kit中特异的oligo-dT adaptor 引物进行反转录合成的, 其检测需配合miRNA qrt-pcr Detection Kit中的universal Adaptor PCR primer, 所以此cDNA不能应用于其它同类miRNA qrt-pcr Detection Kit V. 产品应用 miprofile mirna qpcr Primer为应用于mature mirna表达量检测的引物其配合All-in-One mirna qrt-pcr Detection Kit可对mature mirna进行定性定量的qPCR检测 VI. miprofile mirna qpcr Primer 验证报告 A 材料和方法 1. 验证实验仪器 iq5 Real Time PCR Detection System: Bio-Rad 2. 验证的实验材料及试剂 All-in-One mirna qrt-pcr Detection Kit ( Catalog Nos. AOMD-Q020 或AOMD-Q050) 验证模板人源十个不同的组织所制备的cDNA B. 验证流程 RNA抽提 1 样品处理取一定量的十个不同的人源组织标本至冷冻的研钵中加入液氮研磨至细粉最后转移至有1ml TRIzol的离心管中反复振荡约5min 如为细胞样品则取约106~107左右的细胞数至1ml TRIzol中反复吹打至裂解 2 相分离室温放置10min左右后每1ml TRIzol 中加入氯仿为200µl 盖上盖子剧烈振荡约1min 室温静置2 5min 然后12000g 冷冻离心15min 6 C 小心取出样品通过观察可以发现样品分三层其中最上层含有RNA样品 3 RNA沉淀小心吸取上清液约450µl 每1ml TRIzol 的吸取量至含有600µl冷冻异丙醇的新离心管中混匀 -20 C放置约10min 12000g 冷冻离心10min 6 C 2/9

4 4 RNA洗涤去上清加入500µl冷冻的75 乙醇弹起沉淀后 12000g 冷冻离心5min 6 C 去上清再稍离吸去上清液 5 RNA溶解风干约5 10min 注意不能风太干只需要沉淀泛白即可加入DEPC水约30µl 贴上标签后-80 C 保存 6 RNA浓度测定吸取1µl 抽提的RNA 用DEPC水稀释10倍后在Nanodrop上测定RNA浓度以DEPC水做空白对照同时记录RNA浓度及其A 260/OD280 7 RNA电泳检测 7.1 变性胶制备取1g Agarose + 75ml 去离子水煮沸冷却至70 C左右加入10ml 10 Mops和15ml 甲醛及EB 倒胶至宽口梳子的胶板上盖上盖子 7.2 电泳缓冲液配制(1 Mops) 取50ml 10 Mops 用去离子水稀释至500ml 倒入电泳槽中再在电泳缓冲液中添加EB. 7.3 RNA样品处理取RNA样品3µl 补充DEPC水至18µl 65 C变性10min后立即冷却加入2µl 10 RNA loading buffer 即可电泳 7.4 RNA电泳先把RNA胶放入电泳槽中 100V作用电泳约5min 再在点样孔中点入处理过的RNA样品 100V左右电泳至溴酚蓝至胶的1/3处取胶拍照 8 RNA 检测结果 3/9

8.1 十个不同组织的RNA电泳图取各3µl RNA 样品各泳道所对应的样品信息见下表8.2 8.2 RNA电泳的各泳道所对应的样品及其样品浓度和A260/OD280 泳道组织 Concentration (ng/µl) OD A260/A280 1 脑 2385 1.9 2 肺 2430 1.94 3 肝 2521 1.91 4 肾 3444 1.94 5 乳腺 2785 1.

5 8.1 十个不同组织的RNA电泳图取各3µl RNA 样品各泳道所对应的样品信息见下表 RNA电泳的各泳道所对应的样品及其样品浓度和A260/OD280 泳道组织 Concentration (ng/µl) OD A260/A280 1 脑肺肝肾乳腺睾丸胎盘脾心脏胰腺 Note: 抽提的RNA必须含有小分子RNA才能进行miRNA的检测所以所选的试剂盒必须为总RNA抽提试剂盒或小分子RNA抽提试剂盒同时RNA抽提的质量是进行下游实验的关键敬请严格按照所使用的RNA抽提试剂盒要求进行抽提抽提结束后敬请电泳检测RNA抽提质量 mirna 反转录反应 1. 融解miRNA反转录所需的试剂上下轻微颠倒混匀短暂离心后放置冰上待用 2. mirna反转录反应液的配制在冰上的预冷RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积25µl 4/9

6 试剂组分体积终浓度 Total RNA 2 µg 2.5 U/µl Poly A Polymerase 1 µl RTase Mix 1 µl 5X Reaction Buffer 5 µl ddh2o (RNase/DNase free) 补至25µl 2.5 U 1X Note:在反应中使用的total RNA必须含有小分子RNA; Total RNA使用量可在1ng 5µg之间调整, 如使用纯化的小分子RNA 其使用量可在0.1ng 1µg之间调整 3.反转录反应混匀配制的反应mix 短暂离心后在37 C反应60min 结束后再进行85 C 5min灭活处理所得的反转录产物可用灭菌水稀释5倍进行下游qPCR实验混匀配制的反应mix 短暂离心后在37 C反应60min 结束后再进行85 C 5min灭活处理所得的反转录产物可用灭菌水稀释5倍进行下游qPCR实验 Mature mirna 的qPCR 检测 1. 融解All-in-One mirna qrt-pcr Detection Kit中的2 All-in-One qpcr mix上下轻微颠倒混匀短暂离心后放置冰上待用 2. 冰上进行qPCR反应液的配制所有miRNA进行复孔测试同时进行单孔NTC No template control 测试试剂组分体积终浓度 2 All-in-One qpcr Mix 10 µl 1 miprofile mirna qpcr Primer (2 µm) 2 µl 0.2 µm Universal Adaptor PCR Primer (2 µm) 2 µl 0.2 µm 1 strand cdna (5倍稀释液) 2 µl ddh2o 4 µl Final Volume 20 µl st Note 在实验中设计了NTC No Template Control 其为阴性对照即用水来代替模板cDNA 其它试剂不变从而来质控是否体系有污染实验中如需更改反应体积敬请保持最适条件下各组分的比例试剂盒中的50 Rox Reference Dye 使用在需用Rox 校正的仪器如ABI的定量PCR仪 3. 充分混匀qPCR反应液添加至PCR反应管中短暂离心确保所有试剂到反应管底部 4. qpcr 反应使用标准的三步法进行检测以Bio-Rad 的iQ5进行实验的设计 5/9

7 循环数步骤温度时间检测 1 预变性 95 C 10min 否变性 95 C 10sec 否退火参考结果 20sec 否延伸 72 C 10sec 是 40 反应结束后立即进行融解曲线分析检测温度范围升温速率恒温时间检测 66 C ~ 95 C 0.5 C/ 次 6 sec/ 次是 30 sec 否 30 C Note 以上的反应条件主要参考的为Bio-Rad 的iQ5定量PCR仪器如使用的为不同公司的定量PCR仪请按照不同的仪器要求调整qPCR反应的延伸时间及其融解曲线分析的条件各miRNA的退火温度可能例有差别具体请参考测试结果部分 C.引物验证结果 1. SNORD68 (hsnrna U68 primer) 推荐退火温度为60 C 6/9

8 SNORD68 Amplification curve SNORD68 melting analysis curve 7/9

9 Electrophoresis Result in lane (contains two positive controls and two NTC)(5 µl of the PCR of products, run on 3% agarose gel) 8/9

10 该产品仅限于实验科学研究用若有任何单位或个人将该产品用于临床诊断治疗等其他国家专门规定的特殊用途本公司概不承担任何责任 GeneCopoeia Products are for Research Use Only Copyright 2016 GeneCopoeia, Inc Trademarks: iq5 (Bio-Rad); GeneCopoeia, OmicsLink, All-in-One, (GeneCopoeia Inc.); Trizol (Invitrogen); NanoDrop (Thermo Scientific) AOPM1309 9/9

Microsoft Word - Human miRNA qPCR 引物验证报告.doc

Microsoft Word - Human miRNA qPCR 引物验证报告.doc All-in-One TM mirna qpcr Primer Manual and Validation Report For quantitative detection of mature mirna with All-in-One TM mirna qrt-pcr Detection Kit Catalog number: HmiRQP9001 GeneCopoeia, Inc.; 广州复能基因有限公司