No.2 李晓燕 : 用荧光和共振光散射光谱研究甲硝唑与牛血清白蛋白的相互作用 263 Fig.1 图 1 的同时, 用共振光散射光谱讨论 MET 与蛋白质的结合机理, 发现两种光谱得到的不同温度下 MET 对蛋白质的猝灭常数 K SV 静态猝灭结合常数 K LB 表观结合常数 K A 均在相同的

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曰钰真
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1 262 物理化学学报 (Wuli Huaxue Xuebao) Acta Phys. 鄄 Chim.Sin., 2007, 23(2): February [Note] 用荧光和共振光散射光谱研究甲硝唑与牛血清白蛋白的相互作用李晓燕 * ( 乐山师范学院化学与生命科学系, 四川乐山 ) 摘要 : 用荧光光谱和共振光散射光谱对甲硝唑与牛血清白蛋白的作用进行了对比研究, 测定了该反应的结合常数结合位点数. 探讨了甲硝唑对牛血清白蛋白荧光和共振光散射猝灭的机理援利用热力学参数确定了分子间的作用力性质 ; 根据非辐射能量转换机制, 确定了甲硝唑鄄牛血清白蛋白间的结合距离. 采用同步荧光技术考察了甲硝唑对牛血清白蛋白构象的影响援关键词 : 甲硝唑 ; 牛血清白蛋白 ; 荧光光谱 ; 共振光散射光谱中图分类号 : O644, O657.3, R969.2 Interaction ofmetronidazolewith BovineSerumAlbumin byusing Fluorescenceand ResonanceLightScatteringSpectra LI Xiao 鄄 Yan * (DepartmentofChemistry and Life Science,LeshanTeachers 忆 College, Leshan , SichuanProvince, P. R. China) Abstract: Bymeansoffluorescenceandresonancelightscatteringspectrometries,thecomparisonoftheinteractions wasmade between metronidazole and bovine serum albumin(bsa). The apparent binding constant K A was found to be 2.22 伊 10 4 L mol -1 and the binding sits n to be 1.06 依 0.02 at 298 Kby fluorescence quenching method. The quenching mechanism was discussed referring to metronidazole against the fluorescence and the resonance light scattering of BSA. The thermodynamic parameters of binding reaction were determined as follows: the molar change of enthalpy 驻 rh m =6.42 kj mol -1,the molar change of Gibbs function 驻 rg m =-23.0 kj mol -1,and the molar change of entropy 驻 rs m = 98.8 J mol -1 K -1 at298 K. The binding power between metronidazole and bovine serum albumin was also discussed. Furthermore,the binding distanceof3.16nmwasobtained between metronidazole and bovineserumalbumin based on the mechanism of F 觟 rster non 鄄 radiation energy transfer. The effect of metronidazole on the conformation of BSA was analyzed by using the synchronousfluorescence spectroscopy. KeyWords: Metronidazole; Bovineserumalbumin; Fluorescence spectrum; Resonance lightscattering spectrum 甲硝唑 (MET) 是当前结构简单 ( 结构见图 1), 应用广泛且价廉的抗厌氧菌的药物, 用于抗厌氧菌感染, 如腹腔消化道女性生殖器下呼吸道皮肤及软组织骨和关节等部位的厌氧菌感染, 还用于抗滴虫和抗阿米巴原虫. 血清白蛋白是血浆中最为丰富的蛋白质, 它能与许多内源及外源化合物结合. 研究药物与血清白蛋白的作用有助于阐明药物在体内的存储和转运过程, 也能为药物的设计与开发及药理研究提供有价值的信息, 是当今生命科学化学 [1,2] 和临床医学研究中所共同关注和感兴趣的课题. 荧光光谱是研究生物大分子与有机小分子相互 [3] 作用的重要手段之一. 共振光散射光谱是一种新的分子光谱技术, 由于这种技术在研究生物大分子识别组装和聚集时呈现出灵敏而丰富的信号, 已广 [4] 泛用于生物大分子的定量分析. 但应用共振光散射光谱研究药物与生物大分子作用机理未见报道. 本文用荧光光谱在模拟人体生理 ph 值条件下研究甲硝唑与牛血清白蛋白 (BSA) 之间的相互作用机理 Received: August 11, 2006; Revised: November,2006. * Correspondingauthor. ddli0833@163.com; Tel: 鄄乐山师范学院自然科学基金 (Z0625) 资助项目鬁 Editorial officeofacta Physico 鄄 ChimicaSinica

2 No.2 李晓燕 : 用荧光和共振光散射光谱研究甲硝唑与牛血清白蛋白的相互作用 263 Fig.1 图 1 的同时, 用共振光散射光谱讨论 MET 与蛋白质的结合机理, 发现两种光谱得到的不同温度下 MET 对蛋白质的猝灭常数 K SV 静态猝灭结合常数 K LB 表观结合常数 K A 均在相同的数量级范围内,MET 在蛋白质上的结合位点数均近似为 1. 本文还报道了 MET 与 BSA 间的热力学参数作用力作用距离等重要信息及 MET 对 BSA 构象的影响, 试图从分子水平了解蛋白质分子与小分子间相互作用机制, 为生命科学研究提供有用的信息. 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 RF 鄄 5301PC 型荧光分光光度计 ( 日本岛津公司 ); PHS 鄄 3C 型精密 ph 计 ( 上海雷磁仪器厂 );UV 鄄 530 型紫外鄄可见分光光度计 ( 日本 JASCO 公司 );FC 鄄 204 电子分析天平 ( 上海天平仪器厂 );501 型超级恒温器 ( 上海实验仪器厂 ). 甲硝唑的分子结构 Molecularstructureofmetronidazole (MET) 甲硝唑 (MET, 纯品原料药, 由四川乐山长征制药厂提供 ) 工作液 :2.60 伊 10-3 mol L -1 ; 牛血清白蛋白 (BSA, 上海伯奥生物科技有限公司 ) 溶液 :5.20 伊 10-5 mol L -1 ;NaCl 溶液 :0.5mol L -1 ;ph=7.40 的 Tris 鄄 HCl 缓冲溶液. 除 MET BSA 外, 其余试剂均为分析纯, 实验用水为二次去离子水, 经检验无荧光杂质. 1.2 实验方法在 10 ml 比色管中依次加入 0.5 mol L -1 的 NaCl 溶液 2.00 ml BSA 溶液 2.00 ml 及一定量的 MET 工作液, 以 Tris 鄄 HCl 缓冲溶液定容为 10.0 ml, 用狭缝宽度分别为 3nm 的 RF 鄄 5301 荧光分光光度计在激发和发射光谱, 测定一定温度时 BSA 及 BSA 在 MET 作用下的荧光光谱同步荧光光谱共振光散射光谱 ; 用 UV 鄄 530 型紫外鄄可见分光光度计测定 MET 的紫外吸收光谱. 2 结果和讨论 2.1 光谱特征 MET 对 BSA 的荧光光谱的影响蛋白质的荧光猝灭可用于研究药物与蛋白质的结合信息 [5,6], 当激发波长为 280 nm 时, 蛋白质表现的是色氨酸和酪氨酸残基的荧光. 而激发波长为 295 nm 时, 仅仅表现色氨酸残基的荧光. 图 2 表明了蛋白质的荧光强度随 MET 浓度的增加而熄灭的过程. 在两种激发波长下.MET 在 nm 范围内并无荧光, 从图 2 可见, 当 MET 和 BSA 发生作用后,BSA 的荧光发射波长发生红移, 且发射波长红移的值随 MET 浓度的增加而增加, 当 MET 和蛋白质的摩尔比达到 30.0 时, 蛋白质荧光发射波长移动了 25 nm. 红移表明蛋白质里的色氨酸残基被带到了一个更亲水的环境 [7,8] MET 对 BSA 共振光散射光谱的影响图 3 为 MET 对 BSA 共振光散射光谱的影响, 由图 3 知, 随着 MET 浓度的增大, 其蛋白质的共振光散射峰红移, 且发生共振光散射强度猝灭的现象. 图 2 298K 时甲硝唑对 BSA 荧光光谱的影响 Fig.2 Effectofmetronidazole(MET)on fluorescencespectraofbsaat298k (A) 姿 ex=280nm,(b) 姿 ex=295nm, c BSA=1.04 伊 10-5 mol L -1 ;molarratioofmettobsa: 1)0.00,2)1.00,3)2.00, 4)3.00, 5)4.00, 6)5.00,7)6.00,8)7.00,9)8.00, 10)9.00,11)20.0,12)30.0(from 1tol2).

3 264 Acta Phys. 鄄 Chim. Sin., 2007 Vol.23 图 3 甲硝唑对 BSA 共振光散射光谱的影响 Fig.3 Effectofmetronidazole(MET)onthe resonancelightscatteringspectraofbsa c BSA=1.04 伊 10-5 mol L -1 ;molarratioofmte to BSA:1)0.00, 2)1.10, 3)2.10,4)3.20,5)4.20,6)5.30,7)6.60,8)7.90, 9)9.20,10)10.5,11) 21.0,12)31.6; T=298K 2.2 荧光猝灭机理及结合常数结合位点数的确定荧光猝灭通常可分为动态猝灭和静态猝灭. 动态猝灭过程遵循 Stern 鄄 Volmer 方程 : F 0 /F=1+K q 子 0c Q =1+K sv c Q (1) 静态猝灭过程遵循 Lineweaver 鄄 Burk 方程 : (F 0 -F) -1 =F KLBF c -1 Q (2) 其中 c Q 是猝灭剂的浓度, K q 为双分子猝灭过程速率常数, K SV 为动态猝灭常数, 子 0 为猝灭剂不存在时荧光分子寿命. 生物大分子的荧光平均寿命约为 10-8 s [9]. F 0 为无猝灭剂时 BSA 的荧光, F 为有猝灭剂时 BSA 的荧光. K LB 为静态荧光猝灭结合常数. 在不同温度下, 用 MET 作猝灭剂, 以 343nm 处的荧光强度作 Stern 鄄 Volmer 曲线和 Lineweaver 鄄 Burk 双倒数曲线, 见图 4. 由图 4 可见, 当药物和蛋白质的摩尔比超过 10.5 时, 动态猝灭曲线不呈线性关系, 且随 c MET 的增加, 呈现出向上弯曲的现象. 而静态猝灭曲线则呈现良好的线性关系, 初步说明 MET 对蛋白质荧光的猝灭过程为静态猝灭, 为进一步证实其猝灭过程, 对图 4a 的线性部分及图 4b 进行线性拟合, 由直线斜率求得猝灭常数 K SV 双分子猝灭常数 K q 静态猝灭结合常数 K LB, 见表 1. 在动态猝灭过程中, 一般情况下各类猝灭剂对生物大分子荧光寿命衰减速率影响的 K q 值不大于 2.00 伊 L mol -1 s -1[9]. 因此, 甲硝唑对蛋白质的猝灭不是动态猝灭, 而是甲硝唑与蛋白质结合引起的静态猝灭. 药物与蛋白质之间的相互作用一般采用位点结 [10] 合模型来描述, 依据文献 [11] 推导出的荧光强度 (F) 猝灭剂浓度(c Q ) 与表观结合常数 (K A ) 及结合位点数 (n) 之间的关系 : lg(f 0 -F)/F=lgK A +nlgc Q (3) 以 lg (F 0 -F)/F 对 lgc Q 作图,MET 为猝灭剂, 由直线斜率可得 298 K 时,MET 与蛋白质的结合位点数 n=1.06 依 0.02( 曲线的相关系数为 r=0.9981), 表明 1 分子的甲硝唑和 1 分子的蛋白质结合. 即甲硝唑与 BSA 作用时具有 1 个独立的结合部位. 由直线截距可计算出在 298K 下甲硝唑与蛋白质的表观结合常数 K A =2.22 伊 10 4 L mol 共振光散射光谱猝灭机理及结合常数的确定在蛋白质溶液中, 随着甲硝唑浓度的增加, 其蛋白质的共振光散射强度依次降低, 这可能是由于甲硝唑在血清白蛋白表面结合后, 破坏了白蛋白表面的保护水层, 使原来较为分散的蛋白质更加分散, 即所谓的解聚作用, 引起蛋白质粒径减小, 共振散射的 Fig.4 图 4 基于荧光猝灭的 MET 对 BSA 的 Stern 鄄 Volmer 曲线和 Lineweaver 鄄 Burk 双倒数曲线 TheStern 鄄 Volmer curves and Lineweaver 鄄 Burk curves ofthereaction ofmet with BSAbasedon the fluorescencequenching a)stern 鄄 Volmercurves; b)lineweaver 鄄 Burkcurves; c BSA=1.0 伊 10-5 mol L -1

4 No.2 李晓燕 : 用荧光和共振光散射光谱研究甲硝唑与牛血清白蛋白的相互作用 265 Table1 Table2 表 2 表 1 基于荧光猝灭计算 MET 的 Stern 鄄 Volmer 常数和 Lineweaver 鄄 Burk 常数 Stern 鄄 Volmer quenchingconstantand Lineweaver 鄄 Burk quenchingconstantfromthedataoffig.4 T/K 10-4 K SV K q Correlation coefficient 10-4 K LB/(L mol -1 ) Correlation coefficient RSD(n=3)(%) 基于共振光散射猝灭计算 MET 的 Stern 鄄 Volmer 常数和 Lineweaver 鄄 Burk 常数 Stern 鄄 Volmer quenchingconstantand Lineweaver 鄄 Burkquenchingconstantfromthedata offig.5 T/K 10-4 K SV K q Correlation coefficient 10-4 K LB/(L mol -1 ) Correlation coefficient RSD(n=3)(%) [12] 截面积减小, 导致共振散射强度下降. 当反应体系中共振光散射为蛋白质产生时, 设 I 0 为无猝灭剂时 BSA 的散射光强度, I 为有猝灭剂时 BSA 的散射光强度, 以 349 nm 处散射光强度作 Stern 鄄 Volmer 和 Lineweaver 鄄 Burk 曲线, 见图 5. 并由图 5 可求得猝灭常数 K SV 和静态猝灭结合常数 K LB, 见表 2. 将 (3) 式用于此体系得出在 298K 时, 甲硝唑与蛋白质的结合位点数 n=1.10 依 0.06( 曲线的相关系数 r=0.9902), 甲硝唑与蛋白质的表观结合常数 K A =3.48 伊 10 4 L mol -1. 将图 5 与图 4 相比较可发现, 用 Stern 鄄 Volmer 方程和 Lineweaver 鄄 Burk 方程处理散射体系与处理荧光体系得到的结果非常相似, 比较表 1 和表 2, 所得猝灭常数 K SV 静态猝灭结合常数 K LB 都在相同的数量级范围内. 两种光谱得到的结合位点数及表观结合常数也非常接近. 说明荧光猝灭理论同样适合药物对蛋白质共振光散射强度的猝灭. 2.4 甲硝唑与 BSA 作用力的确定药物与生物大分子的作用力包括氢键范德华力静电引力疏水作用力等. 药物不同, 与蛋白质作用力类型不同, 当温度变化不大时, 反应焓变驻 H 可看作是一常数, 由式驻 rg m = 驻 rh m -T 驻 rs m (4) 驻 rg m =-RTlnK LB (5) ln(k 2 /K 1 )=( 驻 rh m /R) (1/T 1-1/T 2 ) (6) 和表 1 的静态猝灭结合常数可求得 MET 的驻 rg m 驻 rh m 驻 rs m, 见表 3. 由于驻 rh m >0, 驻 rs m >0. 从热力学角度看,MET 主要通过疏水作用与 BSA 发生结合 [13] 反应. 2.5 甲硝唑与蛋白质的结合距离通过测定甲硝唑吸收光谱并与 BSA 发射光谱比较, 发现两者有较大部分重叠, 如图 6 所示, 说明两者之间存在着能量传递过程. 按照 F 觟 rster 偶极鄄偶极无辐射能量转移机理, 供能体与受能体之间的结合距离 (r) 临界能量转移距离(R 0 ) 及能量转移效率耘符合以下关系 : E=R 6 0/(R 6 0+r 6 ) (7) Fig.5 图 5 基于共振光散射猝灭的 Stern 鄄 Volmer 曲线和 Lineweaver 鄄 Burk 双倒数曲线 TheStern 鄄 Volmercurves and Lineweaver 鄄 Burk curves ofthereaction ofmetronidazolwith BSAbased on theresonancerayleigh lightscatteringquenching a)stern 鄄 Volmercurves; b)lineweaver 鄄 Burkcurves

5 266 Acta Phys. 鄄 Chim. Sin., 2007 Vol.23 Table3 表 3 而临界能量转移距离 (R 0 ) 又与偶极空间取向因子 K 2, 供能体荧光量子产率准介质折射指数 n 有关 : R 0 =8.8 伊 (K 2 准 -1 n J) (8) 其中 J 是供能体的荧光发射光谱与受能体吸收光谱的重叠积分甲硝唑与 BSA 作用力的热力学参数 Thermodynamic parameters ofthereaction ofbsawith metronidazole T/K 驻 rh m/(kj mol -1 ) 驻 rs m/(j mol -1 K -1 ) 驻 rg m/(kj mol -1 ) J=[ 移 F( 姿 ) 着 ( 姿 ) 姿 4 驻姿 ]/[ 移 F( 姿 ) 驻姿 ] (9) F( 姿 ) 为荧光供能体在波长姿处的荧光强度, 着 ( 姿 ) 为受能体在波长姿处的摩尔吸收系数, 将图 6 中 MET 的吸收光谱与 BSA 的荧光发射光谱的重叠部分分割成极小的矩形, 按式 (9) 积分, 得到 J=6.49 伊 cm 3 L mol -1. 取向因子取授体鄄受体各项随机分布的平均值 K 2 =2/3;BSA 中色氨酸残基的量子产率准 = 0.118; 折射指数取水和有机物的平均值 n=1.336; 由式 (8) 得到能量转移临界距离 R 0 =2.28 伊 10-7 cm; 能量转移效率 E 由 (10) 式计算 E=1-F/F 0 (10) 得 E=0.124, 再根据 (7) 式进一步求出 MET 与 BSA 的结合距离 r 值为 3.16nm. 2.6 甲硝唑对 BSA 构象的影响对于蛋白质的同步荧光光谱, 驻姿 =15 nm 只表现出酪氨酸残基的荧光, 驻姿 =60 nm 时只表现出色氨酸残基的荧光 [9]. 因为氨基酸残基的最大发射波图 6 甲硝唑吸收光谱 (a) 和 BSA 的荧光发射光谱 (b) 的重叠图 Fig.6 Overlapoftheabsorption spectrumof metronidazole(a)with thefluorescenceemission spectrumofbsa(b) c MET=1.04 伊 10-5 mol L -1, c BSA=1.04 伊 10-5 mol L -1 长与其所处环境的疏水性有关, 因此由发射波长的改变可判断蛋白质构象的变化. 图 7 为甲硝唑对蛋白质同步荧光光谱的影响, 可见酪氨酸残基的最大发射波长基本保持不变, 而色氨酸残基的最大发射波长红移, 表明甲硝唑的加入使 BSA 的构象发生变化, 色氨酸残基所处环境的疏水性降低,BSA 内部的疏水结构有所瓦解, 肽链的伸展程度增加 [10]. 3 结论研究结果表明, 荧光猝灭理论仍然适用于药物对蛋白质共振光散射的猝灭. 甲硝唑对蛋白质的荧光猝灭属于静态猝灭, 甲硝唑以疏水作用力与蛋白质相结合, 可以在蛋白质中运输和储存, 并有明显的生理活性, 甲硝唑对蛋白质的构象有一定的影响, 它们的结合服从位点结合模型, 在 298 K 时近似形成一个结合位点. References 图 7 BSA 的同步荧光光谱 Fig.7 SynchronousfluorescencespectraofBSA a) 驻姿 =15 nm; b) 驻姿 =60 nm, c BSA=1.04 伊 10-5 mol L -1 ;molar ratio of METtoBSA: 1)0.00,2)1.00,3)2.00, 4)3.00, 5)4.00, 6)5.00, 7)6.00, 8)7.00, 9)8.00,10)9.00,11)20.0, 12) Erland,J. F.D. Anal Biochem., 1999, 267:366 2 Mauricio, S. B.; GuiIherme,L. I. J 援 Phys 援 Chem., 1998, 102: 4678

6 No.2 李晓燕 : 用荧光和共振光散射光谱研究甲硝唑与牛血清白蛋白的相互作用 Anna,S. J.Mol.Struct., 2002, 614: Li,Y.F.;Huang,C.Z.; Hu,X.L. ChineseJournal of Analytical Chemistry, 1998,26(12): 1508 [ 李原芳, 黄承志, 胡小莉. 分析化学, 1998, 26(12):1508] 5 Eftink, M.R.; Ghiron,C.A. Biochemistry, 1976, 15: Lehres, S. Biochemistry, 1971, 10: Callis, P.R. MethodsEnzymol, 1997, 237: Kljnert, B.; Stanislawska, L.; Bryszewska, M.; Palecz, B. Biochim. Biophys.Acta, 2003,1648: Ma,C.Q.; Li,K. A.; Zhao,F.L. Acta Chimica Sinica, 1999, 57(4): 389 [ 马春骐, 李克安, 赵风林. 化学学报, 1999, 57(4):389] 10 Huang,B.; Zou,G.L.; Yang,T.M. ActaChimica Sinica, 2002, 60 (10):1867 [ 黄波, 邹国林, 杨天鸣. 化学学报, 2002, 60(10): 1867] 11 Jiang,M.; Xie,M. X.; Zheng,D.; Liu,Y.; Li, X. Y.; Cheng,X. J.Mol.Struct., 2004, 692: Song, C.;Liang,H. JournalofGuangxiNormalUniversity(Natural ScienceEdition), 2002, 20(4): 68 [ 宋, 梁宏. 广西师范大学学报 ( 自然科学版 ), 2002, 20(4): Shao, S.; Ma, B. Y.; Wang, X.J.; Zhang,J. J.; Li,X.F.; Qin, Q. ActaPhys. 鄄 Chim.Sin., 2005, 21(7): 792 [ 邵爽, 马博英, 王学杰, 张佳捷, 李雪锋, 秦青. 物理化学学报, 2005,21(7): 792]

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第 36 卷摇 215 年 12 月第 12 期发摇光摇学摇报 CHINESE JOURNAL OF LUMINESCENCE Vol 郾 36 No 郾 12 Dec., 215 文章编号 : 1 鄄 732(215)12 鄄 1458 鄄 6 硝基羟乙唑与溶菌酶反应机制的荧光光谱研究刘保生 *, 韩摇荣, 李志云, 李彤彤, 李改霞 ( 河北大学化学与环境科学学院河北省分析科学技术重点实验室,