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舍旬穰
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1 南京医科大学学报 ( 自然科学版 ) 28 年 9 月 ACTA UNIVERSITATIS MEDICINALIS NANJING(Natural Science) 25 光谱法研究头孢米诺钠与牛血清白蛋白的相互作用 * 刘里, 李爱丽 2, 成飞翔曲靖师范学院化学与环境科学学院, 2 云贵高原化学功能材料与污染治理研究中心, 云南曲靖 655 [ 摘要 ] 目的 : 研究在实验选定的最佳条件下头孢米诺钠 (cefminox sodium,cmns) 与牛血清白蛋白 (bovine serum albumin, BSA) 之间的相互作用方法 : 用荧光光谱法联合紫外光谱法研究 CMNS 与 BSA 的相互作用机制结果 : 通过 Stern Volmer 方程分析荧光猝灭数据, 表明静态猝灭机制存在热力学参数表明静电相互作用力是稳定 CMNS BSA 复合物的主要分子间作用力计算结合位点的数目 (n) 和有效结合常数 (K b) CMNS 与 BSA 的结合是自发过程, 有个结合位点 BSA 的亚螺旋域 ⅡA 是主要结合位置, 离酪氨酸残基更近 CMNS 对 BSA 构象产生影响, 使 BSA 腔内疏水环境的极性增强结论 :CMNS 与 BSA 有药物负协同作用, 该研究结果为 CMNS 的临床研究提供一定的参考依据 [ 关键词 ] 头孢米诺钠 ; 荧光猝灭 ; 相互作用 [ 中图分类号 ] R969.2 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (28) doi:.7655/nydxbns2899 Study on the interaction between cefminox sodium and bovine serum albumin by spectrometry Liu Li *,Li Aili,Cheng eixiang 2 College of Chemistry and Environmental Science, 2 Yunan Guizhou Plateau Chemical unctional Materials and Pollution Governance Research Center,Qujing Normal University,Qujing 655,China [Abstract] Objective:This study was designed to examine the interaction of cefminox sodium(cmns)with bovine serum albumin (BSA)under the optimum conditions. Methods:The mechanism of the interaction between CMNS and BSA was studied by spectroscopic techniques combination with absorption spectroscopy. Results:Stern Volmer analysis of fluorescence quenching data showed the presence of the static quenching mechanism. The thermodynamic parameters indicated that the electrostatic interactions were the predominant intermolecular forces stabilizing the complex. The number of binding sites(n)and binding constant(k b)was calculated. The binding process was spontaneous. The obtained data for binding sites of n approximately equal to indicated that there was a single class of binding site for the BSA with CMNS. The primary binding site for CMNS was located at sub domain ⅡA of BSA and nearby tyrosine residue. The conjugation reaction would affect the conformation of BSA,leading to the polarity around BSA strengthened. Conclusion:There was almost some negative cooperative effect between CMNS and BSA. The obtained results provided references for its clinical application. [Key words] cefminox sodium;fluorescence quenching;interaction [Acta Univ Med Nanjing,28,38(9):25 29] 头孢菌素类药物对细菌的选择性好, 具有抗菌作用强抗菌谱广耐青霉素酶过敏反应较青霉素类少见等优点, 被广泛应用于临床 [] 虽然头孢菌素类药物有诸多优点, 但有一些不良反应, 如神经 [ 基金项目 ] 云南省教育厅科学研究基金 (25C9Y); 国家自然科学基金 (2269) 通信作者 (Corresponding author),e mail:m @63. com 系统毒性反应, 造血系统毒性反应, 肝肾毒性反应 [] 以及胃肠道反应等由于头孢菌素类药物对人体的不良反应, 所以对头孢菌素类药物与循环系统中含量非常丰富的血清蛋白的相互作用研究就显得尤其重要头孢米诺钠 (cefminox sodium,cmns) 是一种新型广谱抗生素, 用于治疗敏感细菌引起的呼 [2] 吸系统泌尿系统腹腔和盆腔感染但至今还未见光谱法研究 CMNS 与牛血清白蛋白 (bovine serum

2 26 南京医科大学学报第 38 卷第 9 期 28 年 9 月 albumin,bsa) 相互作用的报道 BSA 是动物血浆中最主要的高分子物质, 占总蛋白质 6% 以上, 浓度可达 42 g/ml [3] 因为 BSA 在医学上的重要性, 含量丰富, 成本低, 易于纯化, 极好的配体结合性能和稳 [4] [5] 定性, 且与人血清白蛋白属同源蛋白质, 因此 BSA 常被选作蛋白质模型由于荧光和紫外可见吸收光谱的灵敏度重现性和便利性等特点, 它们是研究小分子与蛋白质相互作用的有效技术这些方法可以揭示药物小分子与蛋白的亲和力, 有助于理解它们的猝灭机制本研究使用几种光谱方法来获得 CMNS 与 BSA 的猝灭机制热力学参数特异结合位点和对 BSA 二级结构的影响, 从而揭示药物与血清白蛋白内部之间结构活性关系的重要信息材料和方法. 材料 phs 3C 型精密酸度计 ( 上海虹益仪器仪表有限公司 ),HWS2 型超级恒温水浴 ( 上海一恒科技有限公司 ), 46 型荧光光谱仪 ( 日立公司, 日本 ), Cary 5 型紫外可见光谱仪 ( 瓦里安技术中国有限公司, 美国 ) 牛血清白蛋白 (98%, 上海生工生物工程股份有限公司 ),CMNS(97%, 北京百灵威科技有限公司 ), 其他试剂均为分析纯, 实验用水为超纯水.2 方法在 ml 比色管中依次加入 BSA( 终浓度为 mol/l), 不同体积 -4 mol/l 的 CMNS 溶液,NaCl 溶液 ( 终浓度为. mol/l),tris HCl 缓冲溶液 ( 终浓度为 2 mol/l), 定容后分别在 29.6 K 3 K 3.6 K 温度下反应 4 min 后扫描荧光光谱, 记录不含 CMNS 的空白溶液的荧光强度 ( ) 和含有 CMNS 溶液的荧光强度 (),Δ= - 按照上述方法配制溶液后扫描 CMNS BSA 体系的吸收光谱 2 结果 2. 荧光猝灭光谱 BSA 的最大激发波长 (λ ex) 和最大发射波长 (λ em) 位于 28 nm/345 nm 处, 随着 CMNS 浓度的增大, 荧光强度逐渐减小,λ em 未见明显位移 ( 图 ), 表明在实验条件下 CMNS 对 BSA 的荧光有猝灭,CMNS 与 BSA 发生了相互作用 2.2 反应条件的优化 CMNS 与 BSA 相互作用的最佳条件如图 2 所示, 缓冲溶液为 ph7.4,2 mol/l Tris HCl,BSA 的最佳浓度为 mol/l, 反应时间为 4 min, 最佳 ~:BSA mol/l,cmns mol/l igure 加入顺序为 BSA CMNS Tris HCl NaCl 2.3 猝灭类型的判断 [6] CMNS 与 BSA 的猝灭过程用 Stern Volmer 方程进行分析 /=+K qτ [CMNS]=+K sv[cmns], 式中 [CMNS] 为 CMNS 浓度,K q 为生物分子猝灭速率常数, 动态猝灭时, 最大值为 2. L/(mol s);τ 为 BSA 平均寿命, -8 s 数量级 [7-8],K s(=k qτ ) 为 Stern Volmer 猝灭常数由 Stern Volmer 方程计算各类常数于表中 Lineweaver Burk 方程 [8-] :( -) - = - +(K LB [CMNS]) -, 式中 K LB 为静态猝灭结合常数, 常用来表征静态猝灭过程用 ( -) - 和 [CMNS] - 作不同温度下的 Lineweaver Burk 曲线, 计算 K LB 值列于表 2 中紫外吸收光谱法是推断猝灭机制的另一种重要方法 [], 在不同浓度 CMNS 存在下, 记录 BSA 的紫外吸收光谱, 如图 3 所示 2.4 结合常数和结合位点数对于静态猝灭, 荧光猝灭强度与猝灭剂的浓度之间遵循双对数方程 [9] :lg[( -)/]= lgk b+nlg [CMNS] 式中,K b 为结合常数,n 为药物分子与每个 BSA 分子结合位点的数量 lg[( -)/] 对 lg [CMNS] 作图,n 和 K b 值, 通过由直线的截距和斜率求出 ( 表 3) 图 2.5 热力学分析 CMNS BSA 体系的吉布斯自由能变 ΔG, 焓变 ΔH 及熵变 ΔS 可通过 van t Hoff 方程 :ln(k b2/k b)=(/t - /T 2)ΔH/R 和 Gibbs Helmholtz 公式 :ΔG=ΔH- TΔS=-RTlnK b [9-2] 来计算求得, 结果列于表药物协同性 CMNS 对 BSA 的猝灭光谱 Quenching spectra of BSA by CMNS Hill 方程 :lgy(ym-y)=lgk+n Hlg[CMNS] [-2] 是

3 28 年 9 月刘里, 李爱丽, 成飞翔. 光谱法研究头孢米诺钠与牛血清白蛋白的相互作用 [J]. 南京医科大学学报 ( 自然科学版 ),28,38(9): A B C 不同的缓冲溶液 ph 值 Tris HCl(mol/L) D E BSA( -6 mol/l) A: 缓冲溶液的优化,:K2HPO4 KH2PO4;2:B(OH)3 Borax;3:K2HPO4 Citric acid;4:tris HCI;5:NaAc HAc B:pH 值的优化 C: 缓冲溶液用量的优化 D:BSA 浓度的优化 E: 试剂加入顺序的优化,:Tris HCl NaCl BSA CMNS;2:Tris HCl NaCl CMNS BSA;3:BSA CMNS Tris HCl NaCl;4:CMNS BSA Tris HCl NaCl : 反应时间的优化 igure 图试剂加入顺序反应条件的优化 Optimization of reaction conditions 反应时间 (min) 温度 (K) 表 Stern Volmer 方程与相关参数 Table Stern Volmer equation and correlation coefficient Stern Volmer 方程 K sv(l/mol) K q[l/(mol s)] /=4 834[CMNS] /=4 29[CMNS] /=3 886[CMNS] r 值.99 9 表 2 Lineweaver Burk 方程与相关参数 Table 2 Lineweaver Burk equation and correlation coeffi cient 温度 (K) Lineweaver Burk 方程 K LB(L/mol) r 值 29.6 ( -) - = -7 [CMNS] ( -) - =2-7 [CMNS] ( -) - =3-7 [CMNS] 分析配体协同作用的常用公式, 以 lgy(ym-y) 对 lg[cmns] 作图, 斜率为 n H(Hill 系数 );K 为结合常数 ;Y 为饱和分数,Y=( -)/ ; 以 /Y 对 /[CMNS] 作图, 截距为 /Ym n H 值列于表 4 中 2.7 结合位置的确定 BSA 由 582 个氨基酸残基组成个单链, 其中包括 3 个相似的结构域 Ⅰ Ⅱ 和 Ⅲ 每个结构域又含两个亚螺旋域 A 和 B [8-] 药物小分子与 BSA 的结吸光度值.4.2 ~3:BSA mol/l,cmns mol/l 图 3 igure CMNS BSA 的紫外吸收光谱 UV absorption spectra of CMNS BSA 合位点主要在亚螺旋域 Ⅱ A 和 Ⅲ A [8- ] 遵循 [3-5] Sulkowska 等的研究方法, 绘制图 4 3

4 28 南京医科大学学报第 38 卷第 9 期 28 年 9 月 Table 3 表 3 双对数方程 Double logarithm equations 温度 (K) 双对数方程 lg[( -)/]=.292[CMNS] lg[( -)/]=.244[CMNS]+5.64 lg[( -)/]=.939[CMNS]+3.62 K b(l/mol) n r 值表 4 热力学参数和 n H 值 Table 4 Thermodynamic parameters and the value of n H 温度自由能 ΔG 焓 ΔH 熵 ΔS (K) (J/mol) (J/mol) [J/(mol K)] n H r 值 A / λ=28 nm λ=295 nm B 图 BSA 构象的研究固定 BSA 的浓度, 改变 CMNS 的浓度, 绘制 CMNS BSA 体系同步荧光光谱 ( 图 5) 3 讨论 [CMNS]/[BSA] λ ex=28 nm/295 nm 时 CMNS BSA 的荧光光谱 igure 4 luorescence spectra of CMNS BSA at λ ex=28 / 295 nm 首先通过对 CMNS BSA 体系荧光光谱的研究, 确定了在实验条件下 CMNS 能猝灭 BSA 的荧光, CMNS 与 BSA 发生了相互作用其次, 通过对 ph 值缓冲溶液种类和浓度 BSA 浓度反应时间和试剂加入顺序进行优化,CMNS 与 BSA 相互作用的最佳条件被确定然后详细探讨了 CMNS 对 BSA 荧光的猝灭机制动态猝灭主要受分子扩散程度影响温度升高时, 分子运动加速, 同时溶液黏度下降, 其结果将使分子扩散系数增大, 从而增大 K sv 值反之, 静态猝灭时, 荧光分子与猝灭剂之间形成不发光的基态配合物, 温度升高可能引起药物蛋白质缔合物的稳定度下降, 从而减小 K sv [8] 表中 K q 值比最大猝灭常 A:Δλ=5 nm;b:δλ=6 nm ~:BSA mol/l,cmns mol/l 图 5 CMNS BSA 的同步荧光光谱图 igure 5 Synchronous fluorescence spectrometry of CMNS BSA 数大两个数量级, 表明 CMNS 与 BSA 之间是非动态猝灭机制而且随着温度升高,K sv 降低, 与静态猝灭机制吻合 K LB 为 4 数量级, 表明 CMNS BSA 稳定性较好 K LB 随温度升高而逐渐下降, 表明高温有利于分解 CMNS BSA 复合物静态猝灭过程中基态配合物的生成往往将引起荧光物质吸收光谱的改变 [] 相反, 动态猝灭并不改变荧光物质即 BSA 的吸收光谱 [] 由图 3 可知,CMNS BSA 体系的吸收峰从 28 nm 移到 27 nm, 吸收峰的强度也增加了, 推断 CMNS 与 BSA 静态猝灭机制是合理的结合常数和结合位点数的确定从表 3 中可以看出,K b 随温度增加而略有减小, 但 n 值约等于表明 CMNS 与 BSA 形成复合物并且 CMNS BSA

5 28 年 9 月刘里, 李爱丽, 成飞翔. 光谱法研究头孢米诺钠与牛血清白蛋白的相互作用 [J]. 南京医科大学学报 ( 自然科学版 ),28,38(9): 复合物随温度增加而部分分解温度从 29.6 K 升高到 3 K 时,K b 和 n 值减小的程度很小, 温度从 3 K 升高到 3.6 K 时,K b 值减小了两个数量级, 表明温度低于 3 K 时, 温度的变化几乎不影响 CMNS 与 BSA 的相互作用 ; 当温度高于 3 K 时, 温度的改变对 CMNS 与 BSA 的相互作用十分敏感在配体与蛋白质之间发挥关键作用的非共价作用力主要有 4 种类型, 即氢键范德华力静电和 [2] 疏水作用力作用力可根据 Ross 等研究来判断由表 4 可知,ΔG< 且 ΔH< 表明 BSA 与 CMNS 的结合是自发进行的放热反应 ΔH< 且 ΔS>, 表明主要作用力为静电作用力由表 4 可知, 各温度下的 n H 值都小于, 并随温度增加 n H 值减小, 表明 CMNS 分子之间呈现出负协同作用, 即一个 CMNS 结合到 BSA 结合位点上后, 会阻碍后继药物分子与蛋白质的结合, 温度越高, 药物小分子结合到 BSA 位点上越难, 导致后续 CMNS 对 BSA 的亲和性减弱由图 4 可知,λ ex=28 nm 曲线和 λ ex=295 nm 曲线没有重叠, 表明色氨酸和酪氨酸残基都参与其中 ; 而且 λ ex=295 nm 的 / 比 λ ex=28 nm 曲线明显大, 表明亚螺旋域 ⅡA 是主要结合位置同步荧光光谱是通过测量发射波长位移, 来获得氨基酸残基在结构和构象变化方面的信息当 Δλ=5 nm 时,BSA 同步荧光光谱揭示酪氨酸残基的特征信息 ; 而当 Δλ=6 nm, 提供色氨酸残基的特征信息 [-2] 由图 5A 可知, 随 CMNS 浓度的增大, 酪氨酸残基的 λ em 由 285 nm 移动到 287 nm, 而色氨酸残基的 λ em 由 279 nm 移动到 28 nm( 图 5B), 说明 CMNS 的加入改变了 BSA 构象, 导致 BSA 腔内疏水环境极性增强, 疏水性减弱酪氨酸残基的荧光猝灭程度大于色氨酸残基的猝灭程度, 表明 CMNS 与 BSA 相结合的位点偏向于酪氨酸综上, 通过荧光和紫外光谱法研究 CMNS 与 BSA 的相互作用由于形成 CMNS BSA 复合物, CMNS 通过静态猝灭机制对 BSA 的荧光产生猝灭两者通过静电作用力结合形成一个位点有药物负协同作用, 结合位置在 BSA 的亚螺旋域 ⅡA 中, 靠近酪氨酸残基 CMNS 能改变 BSA 构象这些重要信息为头孢类抗生素的研发提供了理论依据 [ 参考文献 ] [] 杨烨. 头孢米诺治疗感染的疗效观察 [J]. 中国医院用药评价与分析,26,6():4-5 [2] 肖连光, 毛艺惠, 陈娟. 头孢米诺钠静脉滴注配合内服中药治疗 AECOPD[J]. 中国实验方剂学杂志,24, 2(3):23-25 [3] Bolattin MB,Nandibewoor ST,Chimatadar SA. Biomolecu lar interaction study of hydralazine with bovine serum al bumin and effect of cyclodextrin on binding by fluores cence,3d,synchronous,cd,and Raman spectroscopic methods[j]. J Mol Recognit,26,29(7):38-37 [4] Rudra S,Dasmandal S,Patra C,et al. Binding affinities of Schiff base e(Ⅱ)complex with BSA and calf thymus DNA:Spectroscopic investigations and molecular docking analysis[j]. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, 26,66:84-94 [5] Ma XL,Yan J,Wang Q,et al. Spectroscopy study and co administration effect on the interaction of mycophenolic acid and human serum albumin[j]. Int J Biol Macromol, 25,77: [6] Lakowicz RJ. Principles of fluorescence spectroscopy[m]. 3rd ed. New York:Springer Press,26: [7] 许金钩, 王尊本. 荧光分析法 [M]. 北京 : 科学出版社, 26:64-8 [8] 刘里, 成飞翔. 光谱法研究头孢克肟与牛血清白蛋白的相互作用 [J]. 中国药理学通报,25,3(8):83-84 [9] Zeng HJ,Qi TT,Yang R,et al. Spectroscopy and molecu lar docking study on the interaction behavior between nobi letin and pepsin[j]. J luoresc,24,24(4):3-4 [] Jiang M,Xie MX,Zheng D,et al. Spectrocopic studies on the interaction of cinnamic acid and its derivatives with human serum albumin[j]. J Mol Struct,24,692(/3): 7-8 [] Cyril L,Earl JK,Sperry WM. Biochemists Handbook[M]. Epon Led Press:London,96:254 [2] Ross PD,Subramanian S. Thermodynamic of protein asso ciation reactions:forces contributing to stability[j]. Bio chemistry,98,2(): [3] Sulkowska A,Bojko B,Rownicka J,et al. Paracetamol and cytarabine binding competition in high affinity binding sites of transporting protein[j]. J Mol Struct,26,792 (SI): [4] Bojko B,Sulkowska A,Maciazek Jurczyk M,et al. The in fluence of dietary habits and pathological conditions on the binding of theophylline to serum albumin[j]. J Pharm Biomed Anal,2,52(3): [5] Maciazek Jurczyk M,Sulkowska A,Bojko B,et al. luo rescence analysis of competition of phenylbutazone and methotrexate in binding to serum albumin in combination treatment in rheumatology[j]. J Mol Struct,29,924 (SI): [ 收稿日期 ]

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第 39 卷第 2 期 2016 年 6 月南京师大学报 ( 自然科学版 ) JOURNAL OF NANJING NORMAL UNIVERSITY(Natural Science Edition) Vol. 39 No. 2 June,2016 doi:10.3969/j.issn.1001-4616.2016.02.010 光谱法研究尼美舒利与牛血清白蛋白的相互作用刘里, 成飞翔 ( 曲靖师范学院化学化工学院,