Microsoft Word - A D.doc

Size: px

Start display at page:

Download "Microsoft Word - A D.doc"

岸任
7 years ago
Views:

1 2009 年第 67 卷化学学报 Vol. 67, 2009 第 14 期, 1609~1614 ACTA CHIMICA SINICA No. 14, 1609~1614 研究论文激光光散射与荧光光谱法研究大豆苷与牛血清白蛋白作用及聚集态吴志生章靓陈旺胡娟 * ( 福建中医学院药学系福州 ) ( 福建省高校中药学重点实验室福州 ) 摘要荧光光谱法和动态光散射法研究大豆苷与牛血清白蛋白在生理条件下的相互作用. 研究表明, 大豆苷与牛血清白蛋白能形成 2 l 复合物, 荧光猝灭属于静态猝灭过程 ; 大豆苷与牛血清白蛋白分子间主要的结合作用力为疏水作用 ; 310 K 下, 两者结合常数和结合位点数分别为 7.4 l0 4 L mol 1 和 1.75; 大豆苷使牛血清白蛋白的构象发生了变化 ; 动态光散射数据探讨了牛血清白蛋白与大豆苷分子产生聚集与之相互作用, 进一步证实了牛血清白蛋白在大豆苷水溶液中的构象变化. 实验结果为进一步研究大豆苷对心血管疾病的药理作用, 特别是对血浆蛋白构象的影响提供了重要依据. 关键词激光光散射 ; 荧光光谱 ; 大豆苷 ; 牛血清白蛋白 ; 聚集态 Studies on the Aggregation and Interaction of Daidzin with Bovine Serum Albumin by Fluorescence Spectrum and Laser Light Scattering Wu, Zhisheng Zhang, Jing Chen, Wang Hu, Juan* (Department of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou ) (Key Laboratory of Chinese Pharmacies for Fujian Higher Education, Fuzhou ) Abstract The interaction between daidzin and bovine serum albumin (BSA) has been studied with fluorescence spectrum, dynamic light scattering (DLS) under physiological conditions. The experimental results demonstrated that the combination reaction of daidzin with BSA was a static quenching process because of forming a 2 l complex. And the dominant binding force was hydrophobic interaction. At 310 K, the binding constant and the number of binding sites were 7.4 l0 4 L mol -1 and 1.75, respectively. And the conformation of BSA was changed due to the presence of daidzin. Furthermore, the DLS data suggested that aggregation between BSA and daidzin molecules could render the interactions with them. It was also demonstrated that conformation of BSA was changed in daidzin aqueous solution. These provide important information for the study of cardiovascular pharmacological effects of daidzin and the influence of daidzin on the configuration change of BSA. Keywords laser light scattering; fluorescence spectrum; daidzin; bovine serum albumin; aggregation 当药物进入生物体内后, 需通过血浆的贮存和转运到达受体部位进而发挥药理作用. 而血清白蛋白是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白, 它能与许多内源性和外源性化合物相结合, 起到储运内源性代谢产物和外源性药物小分子 ( 离子 ) 的作用. 因此, 近年来药物与血清白蛋白相互作用的研究受到人们的广泛关注, 特别是中药活性分子与生物大分子的相互作用 [1~5]. 大豆苷 (daidzin) 是豆科属植物葛根异黄酮的主要活 * huj@fjtcm.edu.cn Received January 14, 2009; revised February 18, 2009; accepted March 25, 陈可冀中西医结合发展基金暨福建省高校中药学重点实验室开放课题基金 (No. ckj ) 资助项目.

2 1610 化学学报 Vol. 67, 2009 性成分之一, 具有扩张冠状动脉和脑血管, 增加心脑血流量和降低心肌耗氧量, 抗动脉粥样硬化和促进血液循环等作用 [6], 其结构式见图 1. 笔者采用两种光谱技术研究大豆苷分子与血清白蛋白相互作用机理, 为大豆苷分子在心血管疾病方面的进一步研究提供重要参考作用. 限公司 ). 使用 mol L 1, ph=7.40 Tris-HC1 缓冲溶液 ( 内含 0.10 mol L 1 NaC1); 牛血清白蛋白 (BSA, Sigma 公司 ); BSA 储备液 1.0 l0-5 mol L 1 用上述缓冲溶液配制, 并在 0~4 下存放 ; 大豆苷 ( 中国药品生物制品鉴定所提供 ), 储备液 2.4 l0-4 mol L 1 也均用上述缓冲溶液配制 ; 实验用水均为二次蒸馏水. 1.2 实验方法荧光分析样品准备图 1 大豆苷的分子结构 Figure 1 Molecular structure of daidzin 本文采用荧光光谱法研究了大豆苷与牛血清白蛋白 (Bovine Serum Albumin, BSA) 的相互作用的光谱特征, 确定了静态猝灭是大豆苷对 BSA 荧光猝灭的原因. 求得了大豆苷与 BSA 的表观结合常数 K 0, 结合位点数, 根据热力学参数确定了大豆苷与 BSA 之间的作用力以疏水相互作用为主, 并用同步荧光光谱技术考察了大豆苷对 BSA 的构象影响. 这些基础数据对于阐明大豆苷在体内的运输过程及其作用机理具有重要意义. 多角度激光光散射, 包括动态光散射技术 (DLS) 和静态光散射技术 (SLS). 本文采用 DLS 方法, DLS 是一种研究宏观大分子体系的有力工具, 尽管其解析能力不如 X 射线晶体学方法和 NMR 波谱法, 但是它可以提供粒子在溶液中平动和转动的信息, 这些性质对分子的大小形状以及分子间的相互作用非常敏感, 因此常用于表征蛋白质 DNA 等生物大分子整体尺寸和构象的变化 [7,8] [9,10]. Taboada 及其同事通过激光光散射法研究青霉素 - 人血清白蛋白复合物年 Zhang [11] 也报道激光光散射法研究咖啡酸与人血清白蛋白相互作用. 本文在用荧光光谱法研究大豆苷与 BSA 相互作用机理的基础上, 也利用激光光散射中的动态光散射法研究大豆苷分子 -BSA 复合物, 进一步阐明大豆苷分子与 BSA 相互作用机理. 1 实验部分 1.1 仪器和试剂激光光散射仪 ( 配有 BI-200SM goniometer 和 BI- TurboCorr digital correlator, Brookhaven Inc.). 激光光源为 100 mw 的固态激光 (GNI, 长春, 中国 ), 使用波长为 532 nm 荧光分光光度计 ( 日本日立公司 ); CP225D 电子天平 ( 德国赛多利斯有限公司 ); PHS-3C 型酸度计 ( 上海雷磁仪器厂 ). SK-1 型快速混匀器 ( 常州国华电器有向一系列 l ml 比色管中分别加入 0.10 ml 1.0 l0-5 mol L 1 的 BSA 溶液, 再加入一定量的 2.4 l0-4 mol L 1 的大豆苷溶液, 用缓冲溶液定容至刻度, 摇匀静置 10 min 后, 在一定温度下测定. 测定条件 : 液池厚为 l cm, 激发和发射狭缝宽度均为 5 nm, 激发光波长 A=280 nm, 测定样品在 290~510 nm 的荧光发射光谱. 同步荧光测定条件 : λ=15 nm 或 λ=60 nm ( λ= λ em -λ ex ), 激发和发射狭缝均为 5 nm 激光光散射样品准备准确量取 1.00, 8.00 ml 大豆苷储备液于 10 ml 容量瓶中, 分别加入 0.10 ml 1.0 l0-5 mol L 1 的 BSA 溶液 1 ml, 用 Tris-HC1 缓冲溶液定容至刻度, 摇匀静置 10 min 后, DLS 检测. 为了减少灰尘的干扰, 溶液均用 0.22 µm 滤膜过滤器 (Millipore filters) 过滤. 数据分析使用 CONTIN 程序 [12]. 2 结果与讨论 2.1 荧光光谱蛋白质分子中由于色氨酸 (Trp) 酪氨酸(Tyr) 等残基的存在使其具有内源性荧光. 由图 2 可知大豆苷使 BSA 的荧光发生猝灭, 且随大豆苷溶液浓度的增加 BSA 荧光强度逐步降低, 降低的幅度越来越小, 这表明两者之间存在着相互作用, 且随大豆苷浓度的增加二者的结合趋向饱和. 2.2 荧光猝灭机理荧光猝灭速率常数其它分子与荧光分子相互作用引起荧光强度降低的过程称为荧光猝灭, 可分为动态猝灭和静态猝灭. 动态猝灭是猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间的相互作用过程, 其作用过程遵循 Stern-Volmer 方程. 静态猝灭指当猝灭剂与荧光物质分子在基态时生成不发光的复合物, 使荧光物质的荧光强度降低. 动态猝灭是一种能量转移或电子转移过程, 不影响蛋白质的结构和生理活性 ; 静态猝灭则是由于发生了结合作用, 产生了不发射荧光的复合物, 对蛋白质的二级结构产生影响, 并可

3 No. 14 吴志生等 : 激光光散射与荧光光谱法研究大豆苷与牛血清白蛋白作用及聚集态 1611 数据说明每一个 BSA 分子与两个大豆苷分子结合形成 1 2 复合物. 表 2 荧光强度与大豆苷浓度用公式 (2) 拟合的参数 Table 2 Fitting parameters of fluorescence intensities and daidzin concentrations using Eq. (2) T/K 10-4 K 0 /(L mol -1 ) n R 热力学参数和作用力类型图 K 时大豆苷对 BSA 发射光谱的影响 Figure 2 Effect of daidzin on emission spectra of BSA at 298 K c BSA : mol L 1, c Daidzin : 2.4 l0-4 mol L 1 ; 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 µl, from curve 1 to curve 10 影响其生理活性. 假设大豆苷对 BSA 的荧光猝灭是动态猝灭, 则荧光强度可用下面的 Stern-Volmer 方程式处理 : F 0 /F=1+K q τ 0 c daidzin =1+K sv c daidzin (1) 式中 F 0 为未加大豆苷时 BSA 的荧光强度, F 表示加入大豆苷作用后 BSA 的荧光强度, K q 为双分子猝灭过程速率常数, τ 0 为猝灭剂不存在时的荧光寿命, K sv 为动态猝灭常数, c daidzin 为猝灭剂大豆苷的浓度. 以 F 0 /F 对 c daidzin 作 Stern-Volmer 曲线拟合, 结果见表 l. 按生物大分子荧光平均寿命一般为 10-8 s [13] 计算, 则在 298, 303, 310 K 时双分子猝灭过程速率常数分别为 , , L mol -1 s -1, 大于猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数 2 l0 10 L mol -1 s -1 [14,15], 由此说明大豆苷对 BSA 的荧光猝灭不是动态双分子猝灭过程, 而是由于大豆苷与 BSA 结合形成了复合物引起的静态猝灭. 表 1 荧光强度与大豆苷浓度用公式 (1) 拟合的参数 Table 1 Fitting parameters of fluorescence intensities and daidzin concentrations using Eq. (1) T/K 10-4 K sv /(L mol -1 ) R 结合常数 K 0 和结合位点数 n 对于静态猝灭, 荧光强度与猝灭剂浓度之间遵循下式 [16,17] : lg [(F 0 -F)/F]=lg K 0 +nlg c daidzin (2) K 0 为结合常数, n 为结合位点数. 以 lg [(F 0 -F)/F] 对 lg c daidzin 作图, 拟合参数及计算结果见表 2. 表中的拟合药物小分子与生物大分子的作用力类型包括氢键范德华力静电引力疏水性作用力等, 不同药物与蛋白质结合的作用力类型也不相同. 当温度变化不大时, 结合作用的焓变 H 和熵变 S 可以近似看作常数, 可按 van t Hoff 式 ln K 0 =- H/RT+ S/R 和 G= H -T S 计算, 根据表 2 中不同温度下的结合常数求出大豆苷与 BSA 作用的热力学参数 ( 表 3), 当 310 K 时 H=0.87 kj mol -1, G=-27.7 kj mol -1, S=96 J mol -1 [18]. Ross 等根据大量的实验结果, 总结了判断生物大分子与小分子结合作用力类型的热力学规律, 即疏水作用力使体系的 H 和 S 为正, 氢键或范德华作用力使体系的 H 和 S 为负, 静电作用力使体系的 H 0, S>0. 从上述结果可知, 大豆苷与 BSA 之间的作用力主要是疏水作用力, 进一步的推断是大豆苷通过疏水性基团苯环与 BSA 的疏水性部位相互作用. 表 3 大豆苷与 BSA 相互作用的热力学参数 Table 3 Thermodynamic parameters for the interaction between daidzin and BSA T/K H/(kJ mol -1 ) S/(J mol -1 K -1 ) G/(kJ mol -1 ) 大豆苷对 BSA 构象的影响利用同步荧光光谱可以分析蛋白质的构象变化. 对于蛋白质的同步荧光光谱, λ=15 nm 时只显示 Tyr 残基的特征光谱 [19], 而 λ=60 nm 时仅表现 Trp 残基的特征光谱. 因为残基的最大发射波长与其所处的环境有关, 因此由发射波长的改变可判断蛋白质构象的变化. BSA 结构中几乎所有疏水性氨基酸残基都包埋在圆筒内部, 构成疏水性空腔 [20]. 由同步荧光光谱 ( 图 3) 可以看出, 由于大豆苷的加入, Trp 残基和 Tyr 残基的发射峰明显红移, 且随浓度的增加逐步红移, 强度也逐步降低, 这表明 Trp 残基和 Tyr 残基所处的疏水环境的疏水性降低, BSA 的疏水性结构有所瓦解. 这可能是大豆苷分子中的苯环插入了 BSA 疏水性空腔, 使得 BSA 链有所伸

4 1612 化学学报 Vol. 67, 2009 图 K 时大豆苷对 BSA 同步荧光光谱的影响 Figure 3 Effect of daidzin on synchronous fluorescence spectra of BSA at 310 K (a) λ=15 nm; (b) λ=60 nm; c BSA : mol L 1, c Daidzin : 2.4 l0-4 mol L 1 ; 0, 100, 200, 300 µl, from curves 1 to 4 展所致. 2.6 动态光散射研究大豆苷 - 牛血清白蛋白复合物上述荧光光谱实验结果证实了大豆苷与 BSA 之间的相互作用. 在体系中复合物粒径大于 1 nm, 将使入射光发生散射, 溶液的浓度粒子的粒径和形状决定了散射光的光强强度 [21]. 因此通过动态光散射手段进一步研究大豆苷与白蛋白复合物, 图 4 为荧光光谱分析高低两种浓度的大豆苷水溶液与 BSA 相互作用的积分相关曲线图. 结果显示 : (1) 浓度为 1.0 l0-5 mol L 1 的单一 BSA 水溶液散射光强度弱, 为 32.7 kcps, 积分相关曲线形状较模糊, 衰减强度弱, 衰减突跃不明显 ( 图 4a). 另外通过 ΓG(Γ) 对 R h,app ( 流体动力学半径 ) 作图. 由图 5a 看出, 在 1~10 nm 处为单分子 BSA, 100 nm 附近宽而弱的分布峰为聚集态 BSA, 因此说明 BSA 水溶液中存在较弱的聚集现象 ; 通过 CONTIN 算法得到其 R h,app 为 81.6 nm. (2) 浓度为 2.4 l0-5 mol L -1 的大豆苷水溶液散射光强度仅为 1 kcps, 积分相关曲线形状模糊, 不成形, 衰减强度极弱, 未有衰减突跃 ( 图 4b); 因低浓度下单分子大豆苷流体力学半径太小, 通过 DLS 测试积分得到在大于 1 nm 处没有相关积分分布峰, 因而在图 5a 中未给出. 说明低浓度下大豆苷分子以单分子形式存在, 不存在聚集态大豆苷 ; 而浓度 2.16 l0-4 mol L -1 的大豆苷水溶液散射光强度为 16.5 kcps, 相关函数积分曲线形状和强度相对低浓度较好, 略有衰减突跃 ( 图 4c); 通过 ΓG(Γ) 对 R h,app 作图, 从图 5b 可见, 100 nm 附近也是出现宽而弱的分布峰, 计算求得 R h,app 为 72.6 nm, 说明该浓度下大豆苷分子本身存在聚集现象, 但光强弱, 峰形明显展宽, 进一步确定为分子本身之间形成比较松散的微弱的聚集态. (3) 浓度为 1.0 l0-5 mol L -1 BSA 加入大豆苷存在明显的聚集作用, 加入浓度为 2.4 l0-5 mol L -1 大豆苷时, 散射光强度为 71.3 kcps, 远远大于该浓度下单一 BSA 水溶液与单一大豆苷水溶液散射光的光强强度叠加值 (71.3 kcps>32.7 kcps+1 kcps), 见图 4d. 积分相关曲线形状清晰, 成形, 强度增强, 具有明显衰减突跃, 计算求得其 R h,app 为 88.6 nm, 大于该浓度下单一 BSA 水溶液与单一大豆苷水溶液的 R h,app 叠加值 (88.6 nm>81.6 nm+0 nm), 说明该浓度下大豆苷分子与 BSA 之间存在分子聚集态 ; 同样, 加入终浓度为 2.16 l0-4 大豆苷水溶液散射光的光强强度为 kcps, 大于同浓度下两者的叠加值 (100.3 kcps>32.7 kcps+16.5 kcps), 而且衰减突跃也更加明显成形 ( 图 4e), 计算求得其 R h,app 为 91.3 nm, 其粒径也明显增大, 但未大于同浓度下两者的叠加值, 该浓度下单一大豆苷水溶液与单一 BSA 水溶液都存在比较松散的微弱的聚集, 而当两者在同一体系中, 从图 5 中可以看出 100 nm 附近出现的分布峰, 峰形明显变尖锐强度高狭窄, 说明该浓度下两者分子相互之间插入松散聚集体中形成相对比较紧密的分子聚集体, 这也支持了同步荧光光谱的结论, 分子插入 BSA 中导致了 BSA 的构象变化 [22], 使得体系中的聚集体粒径尽管明显增大, 但未大于同浓度下两者本身聚集体的叠加值. 3 结论采用荧光光谱法动态光散射法研究了中药活性成分大豆苷与牛血清白蛋白的相互作用及形成分子聚集体的现象. 荧光光谱法的结果表明, 大豆苷与 BSA 通过疏水作用形成复合物引起 BSA 荧光发生静态猝灭, 静态猝灭对蛋白质的二级结构产生影响, 并可影响其生理活性 ; 310 K 下 BSA 与大豆苷的结合常数和结合位点数分别为 7.4 l0 4 L mol -1 和 1.75, 每一个 BSA 分子与两

5 No. 14 吴志生等 : 激光光散射与荧光光谱法研究大豆苷与牛血清白蛋白作用及聚集态 1613 图 4 大豆苷 - 牛血清白蛋白复合物相关曲线图 Figure 4 Representative autocorrelation functions from DLS. Laser power and integration times were comparable for all DLS experiments (a) Autocorrelation function of BSA. The average intensity was 32.7 kcps (kilocounts per second); (b) autocorrelation function of daidzin at 2.4 l0-5 mol L -1. The average intensity was 1 kcps; (c) autocorrelation function of daidzin at 2.16 l0-4 mol L -1. The average intensity was 16.5 kcps; (d) autocorrelation function of the BSA/daidzin complexes: daidzin at 2.4 l0-5 mol L -1. The average intensity was 71.3 kcps; (e) autocorrelation function of the BSA/daidzin complexes: daidzin at 2.16 l0-4 mol L -1. The average intensity was kcps

6 1614 化学学报 Vol. 67, 2009 图 5 大豆苷 - 牛血清白蛋白复合物 R h 分布图 Figure 5 Size distribution (R h ) of the BSA/daidzin complexes at 25 C, θ=20 (a) c daidzin =2.4 l0-5 mol L 1 ; (b) c daidzin =2.16 l0-4 mol L 1 个大豆苷分子结合形成 1 2 复合物. 动态光散射技术检测, 通过流体动力学半径变化峰形展宽变化光强度变化等信息, 探讨了大豆苷分子与 BSA 之间的聚集作用, 计算出聚集体粒径的大小, 从一个侧面反映了大豆苷分子与 BSA 相互作用的机理. 笔者采用两种光谱技术研究大豆苷分子与血清白蛋白相互作用机理, 为大豆苷分子在心血管疾病方面的进一步研究提供重要参考作用. 致谢作者感谢北京大学化学与分子工程学院梁德海课题组, 在激光光散射测试上给予大量的支持和指导. References 1 Zhao, Y.; Cao, Y.; Han, F.-M.; Chen, Y. Spectrosc. Spectral Anal. 2008, 28, 904 (in Chinese). ( 赵妍, 曹焱, 韩凤梅, 陈勇, 光谱学与光谱分谱分析, 2008, 28, 904.) 2 Yan, H.; Yang, J.-G.; Liang, H.-D.; Pan, F.-Y.; Zhao, S.-L.; Li, J.-J. Acta Phys.-Chim. Sin. 2008, 24, 543 (in Chinese). ( 闫华, 杨健国, 梁华定, 潘富友, 赵松林, 李晶晶, 物理化学学报, 2008, 24, 543.) 3 Cao, S.-X.; Zhao, Y.-F. Spectrosc. Spectral Anal. 2004, 24, 1197 (in Chinese). ( 曹书霞, 赵玉芬, 光谱学与光谱分析, 2004, 24, 1197.) 4 Xu, W.-X.; Pang, Y.-H.; Shuang, S.-M. Chin. J. Anal. Chem. 2004, 32, 1571 (in Chinese). ( 徐文祥, 庞月红, 双少敏, 分析化学, 2004, 32, 1571.) 5 Wu, G.-H.; Wang, C.-H. Spectrosc. Spectral Anal. 2005, 25, 246 (in Chinese). ( 吴根华, 汪春华, 光谱学与光谱分析, 2005, 25, 246.) 6 Mao, J.-Q.; Mi, H.-M. Chinese Traditional and Herbal Drugs 2000, 31, 61 (in Chinese). ( 毛峻琴, 宓鹤鸣, 中草药, 2000, 31, 61.) 7 Bolten, M.; Niermann, N. E. Biochemistry 1999, 38, Chen, F.-M. Biochemistry 1992, 31, Barbosa, S.; Taboada, P.; Mosquera, V. J. Chem. Phys. 2005, 310, Ruso, J. M.; Taboada, P.; Varela, L. M.; Attwood, D.; Mosquera, V. Biophys. Chem. 2001, 92, Zhang, Y.-H.; Yue, Y.-Y.; Li, J.-Z.; Chen, X.-G. J. Photochem. Photobiol., B 2008, 90, Provencher, S. W. Comput. Phys. Commun. 1982, 27, Lakavicz, J. R.; Weber, G. Biochemistry 1973, 12, Liu, J.-Q.; Tian, J.-N.; Zhang, J.-Y.; Hu, Z.-D.; Chen, X.-G. Anal. Bioanal. Chem. 2003, 376, Zhou, N.; Liang, Y.-Z.; Wang, P. J. Photochem. Photobiol., A 2007, 185, Feng, X.-Z.; Zhang, L.; Yang, L.-J.; Chen, W.; Bai, C.-L. Talanta 1998, 47, Yang, M.-M.; Yang, P.; Xi, X.-L. Chin. Sci. Bull. 1997, 42, 1276 (in Chinese). ( 杨曼曼, 杨频, 席小莉, 科学通报, 1997, 42, 1276.) 18 Ross, P. D.; Subramanian, S. Biochemistry 1981, 20, Ma, C.-Q.; Li, K.-A.; Zhao, F.-L.; Tong, S.-Y. Acta Chim. Sinica 1999, 57, 389 (in Chinese). ( 马春琪, 李克安, 赵风林, 童沈阳, 化学学报, 1999, 57, 389.) 20 Ulrich, K. H. Pharmacol. Rev. 1981, 33, Ahrer, K.; Buchacher, A.; Iberer, G.; Josic, D.; Jungbauer, A. J. Chromatogr. A 2003, 1009, Pileni, M. P. J. Phys. Chem. 1993, 97, (A Ding, W.)

Microsoft Word - 050771.doc

Microsoft Word - 050771.doc 2005 年第 25 卷有机化学 Vol. 25, 2005 第 7 期, 771~779 Chinese Journal of Organic Chemistry No. 7, 771~779 综述与进展紫草素的全合成研究进展徐德锋管鹏健毛志强李绍顺 * ( 上海交通大学药学院上海 200030) 摘要综述