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力翁
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1 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (3): 羟甲基糠醛与不同血清白蛋白的结合反应机制研究郭明 *, 何玲, 鲁小旺 ( 浙江农林大学化学系, 浙江临安 ) 摘要 : 利用光谱实验结合计算机模拟技术研究中药活性成分 5- 羟甲基糠醛 (5-HMF) 与人血清白蛋白 (HSA) 及牛血清白蛋白 (BSA) 的结合反应机制结果表明, 5-HMF 与 HSA 及 BSA 均结合生成静态复合物, 但结合强度存在一定的差异, 5-HMF 与 HSA 及 BSA 分子的结合距离不同, 且 r 值均很小, 说明发生了能量转移现象药物分子与血清白蛋白 (SA) 相互作用过程中, 药物分子对 HSA 及 BSA 构象均产生影响, 使结合位域的疏水性发生改变, 但对不同血清白蛋白影响程度迥异应用荧光相图法解析出 5-HMF 与 BSA 及 HSA 反应构象形态的变迁均为二态模型金属离子 Co (Ⅱ) 介导药物与 SA 相互作用的程度随 SA 种类不同而存在差别依据计算机模拟建立的分子对接结果显示, 5-HMF 与血清白蛋白的相互作用主要为疏水作用和氢键, 分子模拟结果与光谱实验结果一致, 此为 5-HMF 的药理作用机制研究提供一定理论参考关键词 : 5- 羟甲基糠醛 ; 血清白蛋白 ; 相互作用机制 ; 光谱实验 ; 分子模拟中图分类号 : O641.3; R914 文献标识码 : A 文章编号 : (2012) Binding mechanism of traditional Chinese medicine active component 5-hydroxymethyl-furfural and HSA or BSA GUO Ming *, HE Ling, LU Xiao-wang (Department of Chemistry, Zhejiang Agriculture & Forestry University, Lin an , China) Abstract: A combination of spectral experiment and molecular modeling techniques has been used to characterize the binding mechanism between an active component 5-hydroxymethyl-furfural (5-HMF) of traditional Chinese medicine and human serum albumin (HSA) or bovine serum albumin (BSA). The interaction mechanism of 5-HMF binding with HSA/BSA is analyzed. Although the drug can bind with HSA/BSA to form stable complexes, there are some differences in the bond strength. The values of binding distances (r) are different and low, which indicated the occurrence of energy transfer. The drug had conformational effect on HSA/BSA, which resulted in different changes of hydrophobic environment of the binding domain in HSA/BSA. The phase diagram of fluorescence revealed that the changes on the conformational pattern of proteins have been affected by drug conformed to the all-or-none pattern. The interactions between drug and protein influenced by Co(Ⅱ) were also discussed. Its effects acting on 5-HMF-HSA/BSA interactions are different. The computational modeling method was used to study the interaction between 5-HMF and HSA/BSA. The results of molecular model studies revealed that the binding modes for drug-serum albumin systems are mainly hydrophobic interactions and hydrogen bonding. These results are in accordance with spectral results. The research results have given a better theoretical reference for the study of pharmacological mechanism of 5-hydroxymethyl-furfural. Key words: 5-hydroxymethyl-furfural; serum albumin; interaction mechanism; spectrum experiment; molecular modeling 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( ). * 通讯作者 Tel: , Fax: , guoming@zafu.edu.cn

2 386 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (3): 血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质, 具有贮运内源代谢产物和外源药物分子等重要生理功 [1, 能 2], 是药物分子与蛋白质分子相互作用研究中的理想模型分子开展不同种类血清白蛋白与药物分子相互作用机制的研究, 有助于药物与不同血清白蛋白相互作用的共性特征提取和个性特征应用人血清白蛋白 (human serum albumin, HSA) 与牛血清白蛋白 (bovine serum albumin, BSA) 是两种基本组成相似但高级结构有差异的血清白蛋白 HSA 由 585 个氨基酸组成, 仅在 214 位有 1 个色氨酸残基, BSA 由 582 个氨基酸残基组成, 二者均由 3 个结构域组成, 与 HSA 不同的是, BSA 缺失 HSA 氨基酸序列 116 位和末端位的残基, 以及 BSA 在 134 及 212 位各含 1 个色 [3, 氨酸残基 BSA 与 HSA 均具有广泛的应用价值 4] 5- 羟甲基糠醛 (5-hydroxymethyl-2-furfural, 5- HMF) 是广泛存在于中药 ( 如当归等 ) 中的有效成分 5-HMF 及其衍生物在治疗白血病内毒素血症抗氧化及降血压等方面具有良好的功效 [5] 金属离子钴是血液中血红蛋白的重要组成部分, 也是维生素 B 12 组成部分, 机体缺乏钴会导致贫血生物体内所含的 Co(Ⅱ) 必然会影响到 5-HMF 与 SA 的相互作用, 因此, 研究 Co(Ⅱ) 在 5-HMF-BSA/HSA 结合过程中所起的介导作用机制亦有重要的实际意义 [6] 5-HMF 作为一种有效中药成分与血清白蛋白相互作用的研究报道较少, 故对其与血清白蛋白相互作用机制的研究非常必要材料与方法试剂与仪器 5- 羟甲基糠醛 ( 上海景颜化工, 98%); BSA ( 98%), HSA ( 98%), 三羟甲基氨基甲烷 (Tris, GR) 均购自上海华美生物工程公司 ; 其他试剂均为分析纯, 实验用水为亚沸蒸馏去离子水配制 0.1 mol L 1, ph 7.43 Tris-HCl 缓冲溶液 ( 内含 0.10 mol L 1 NaCl 维持离子强度 ), 用此缓冲溶液配制 mol L 1 BSA/HSA 及 mol L 1 5-HMF 5-HMF-Co(Ⅱ) ( 物质的量之比为 1 1) 和 Co(Ⅱ) 贮备溶液日本 Hitachi F-4500 荧光光度计 ; 日本 Shimadzu UV-2450 紫外可见分光光度计 ; SGI O2 计算机图形工作站实验方法荧光光谱及同步荧光光谱测定 : 移取 mol L 1 BSA/HSA 2.5 ml 于 1 cm 石英比色皿中, 微量进样器逐次加入 mol L 1 5- 羟甲基糠醛溶液进行荧光滴定, 于 282 nm 激发波长下进行荧光扫描, 记录 280~700 nm 波长内的发射光谱 ; 荧光光谱仪扫描激发波长和发射波长之间波长差 (Δλ) 分别为 15 nm 和 60 nm 的上述溶液体系的同步荧光光谱以上实验均用 Tris-HCl 缓冲溶液做荧光空白校正, 同时测定一系列不同配比浓度 5-HMF- Co(Ⅱ)-BSA/HSA 溶液体系的荧光光谱和同步荧光光谱荧光相图 (phase diagram) 绘制 : 实验测定 5- HMF-BSA/HSA 体系及 5-HMF-Co(Ⅱ)-BSA/HSA 体系的荧光光谱, 提取上升及下降阶段的荧光强度值, 绘制荧光相图紫外吸收光谱测定 : 移取 Tris-HCl 缓冲溶液 2.5 ml 于 1 cm 石英比色皿中, 微量进样器加入 mol L 1 5- 羟甲基糠醛溶液, 使其浓度为 mol L 1, 测定 500~190 nm 紫外吸收光谱, 缓冲溶液校正基线同样测定 5-HMF-Co(Ⅱ) (1 1) 溶液的紫外吸收光谱分子模拟利用 SGI O2 工作站的 DOCK 程序包进行药物与蛋白质结合位域和相互作用模型的计算研究受体蛋白质 HSA 的晶体结构从 PDB 蛋白质晶体数据库获得, 编码 1h9z; 配体 5- 羟甲基糠醛结构来源于剑桥晶体数据库 (CSD) 分子模拟按照以下步骤进行 : 1 确定 5- 羟甲基糠醛结合位点 ; 2 在配体结合位点填充球簇以映射受体结合腔穴性质 ; 3 尝试匹配不同小球中心的距离和配体中不同原子的距离, 进行配体在受体活性位点处的构象搜索 ; 4 对配体的不同取向进行定位, 以经验势能函数作为评 [7, 价函数, 找到配体与受体的最佳结合方式 8] 结果与讨论 1 5- 羟甲基糠醛及 Co(Ⅱ) 介导下与 HSA/BSA 相互作用的荧光光谱及结合反应机制实验测定不同浓度 5- 羟甲基糠醛对 BSA/HSA 的荧光猝灭光谱, 谱图见图 1 牛血清白蛋白在 343 nm 附近有很强的荧光峰, 人血清白蛋白在 340 nm 附近有很强的荧光峰, 而以同样激发波长测定 5- 羟甲基糠醛溶液, 在实验设定发射波长范围没有荧光峰, 说明 5- 羟甲基糠醛不产生与 BSA/HSA 相互干扰的荧光金属离子能与蛋白质分子发生结合反应, 这种结合反应可能会对药物与蛋白质分子的结合反应产生影响为了考察这种影响, 本实验选定 Co(Ⅱ) 作为对象不同浓度 5-HMF-Co(Ⅱ) (1 1) 对 BSA/HSA 的荧光猝灭光谱见图 2, Co(Ⅱ)-BSA/HSA 二元体系的

郭明等 : 5- 羟甲基糠醛与不同血清白蛋白的结合反应机制研究 387 Figure 1 Effect of 5-hydroxymethyl-2-furfural (5-HMF) on fluorescence spectra of BSA/HSA. c (BSA) = c (HSA) = 1.

3 郭明等 : 5- 羟甲基糠醛与不同血清白蛋白的结合反应机制研究 387 Figure 1 Effect of 5-hydroxymethyl-2-furfural (5-HMF) on fluorescence spectra of BSA/HSA. c (BSA) = c (HSA) = mol L 1 ; c (5-HMF)/10 5 mol L 1 1 to 16: 0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0, 2.4, 2.8, 3.2, 3.6, 4.0, 4.4, 4.8, 5.2, 5.6, 6.0 荧光光谱见图 2 右上图 Co(Ⅱ)-BSA/HSA 二元体系的荧光光谱与 Co(Ⅱ)-5-HMF-BSA/HSA 三元体系的荧光光谱对比说明, 在 Co(Ⅱ)-5-HMF-BSA/HSA 三元体系中, 金属离子钴与药物可能存在竞争结合反应从图 1 和图 2 可见, 由于 HSA 只有 1 个色氨酸残基, 所以在同样条件下其荧光强度小于 BSA; 加入 5-HMF 后, BSA 及 HSA 的内源荧光强度均有规律猝灭, 且 BSA 的最大发射峰位置发生微弱蓝移 (0.6 nm), 而 HSA 的最大发射峰位置无明显位移 ; 加入 Co(Ⅱ)-5-HMF 后, BSA 及 HSA 均发生了猝灭现象, 随着 Co(Ⅱ) 浓度的增大, 其猝灭程度相对减小, 且 BSA 的最大发射峰位置发生微弱蓝移 (0.8 nm) 荧光猝灭从机制可分为静态猝灭和动态猝灭其中, 动态猝灭过程符合 Stern-Volmer 方程为确定 5-HMF 对血清白蛋白荧光的猝灭机制, 首先按 Stern-Volmer [9] 方程处理上述体系 : F 0 /F = 1 + K q τ 0 [D] = 1 + K SV [D] (1) 式中 F 0 与 F 分别为猝灭剂加入前后荧光分子的荧光强度, [D] 为猝灭剂浓度, K q 为双分子猝灭过程速率常数, τ 0 为猝灭剂不存在时荧光分子的平均寿命 (τ 0 为 s) [10], K SV 为 Stern-Volmer 猝灭常数, 即双分子猝灭速率常数与单分子衰变速率常数的比率 5-HMF 及 Co(Ⅱ)-5-HMF 对 BSA/HSA 荧光猝灭的 Stern-Volmer 图如图 3 所示由实验数据通过 Stern-Volmer 图计算 5-HMF 及 Co(Ⅱ)-5-HMF 对 BSA/HSA 的猝灭常数 K SV 及双分子猝灭过程速率常数 K q, 结果列于表 1 Figure 3 The Stern-Volmer curve of 5-HMF/Co(Ⅱ)-5-HMF binding with BSA/HSA 对于生物大分子与活性小分子相互作用的猝灭研究中, 常用两种方法判定荧光猝灭机制, 一种是通过比较 K q 与猝灭剂对生物大分子最大碰撞速率常数 ( L mol 1 s 1 ) 来间接判断 [11] ; 另一种是通过 Figure 2 Effect of Co(Ⅱ) and Co(Ⅱ)-5-HMF on fluorescence spectra of BSA/HSA. A: Co(Ⅱ)-5-HMF-BSA; B: Co(Ⅱ)-5-HMF-HSA; a: Co(Ⅱ)-BSA; b: Co(Ⅱ)-HSA. c (BSA) = c (HSA) = mol L 1 ; c (Co(Ⅱ)-5-HMF) /10 5 mol L 1 1 to 16: 0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0, 2.4, 2.8, 3.2, 3.6, 4.0, 4.4, 4.8, 5.2, 5.6, 6.0; c (Co(Ⅱ))/ 10 5 mol L 1 1 to 9: 0, 0.4, 1.2, 2.0, 2.8, 3.6, 4.4, 5.2, 6.0

4 388 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (3): Table 1 The quenching constants of drug and drug-ion to BSA/HSA System K SV K q Equation R 5-HMF-BSA y = x HMF-HSA y = x HMF-Co(Ⅱ)-BSA y = x HMF-Co(Ⅱ)-HSA y = x 变温实验来直接推断 [12], 本研究采用间接比较法判断荧光猝灭机制由结果可知, 5-HMF 及 Co(Ⅱ) 介导下对 BSA/HSA 荧光猝灭的 Stern-Volmer 曲线均有良好的线性关系, K q 值远大于 L mol 1 s 1, 因此 5-HMF 及 Co(Ⅱ) 介导下对 BSA/HSA 的猝灭均是由于形成了复合物而引起的静态猝灭同时, 分析实验所得结果, 得出如下规律 : 1 由于 BSA 及 HSA 蛋白质分子结构的不同, 5-HMF 对 BSA 及 HSA 荧光光谱的猝灭程度有差异 5-HMF- HSA 体系的 K SV 及 K q 值大于 5-HMF-BSA 体系, 说明 5-HMF 导致 HSA 的猝灭程度大于 BSA 2 金属离子介导下, 5-HMF-Co(Ⅱ)-BSA/HSA 的猝灭参数均有所减小, 说明金属离子介导减弱了药物与血清白蛋白的相互作用, 导致 5-HMF-BSA/HSA 体系猝灭程度减小 3 金属离子介导下, 5-HMF-Co(Ⅱ)-HSA 体系的猝灭程度大于 5-HMF-Co(Ⅱ)-BSA 此结果说明, 由于不同血清白蛋白的结构差异, 造成 5-HMF 与 BSA/HSA 体系相互作用有一定差别, Co(Ⅱ) 介导 5-HMF 与 BSA/HSA 体系相互作用强度有差别 2 结合常数和结合位点数的计算由实验数据分析得到 5-HMF/5-HMF-Co( Ⅱ ) 与血清白蛋白的静态荧光猝灭机制, 对于静态猝灭过程, 荧光分子与猝灭剂分子之间的结合常数可由荧光强度与猝灭剂的关系表达式求出 [13] : lg[(f 0 F) / F] = lgk + nlg[d t ] (2) 式中 F 0 与 F 分别为猝灭剂加入前后荧光分子的荧光强度, K 是结合常数, n 是结合位点数, [D t ] 是猝灭剂的总浓度以 lg[d t ] 对 lg[(f 0 F)/F] 作图 ( 图 4) 可求得 K 和 n, 由实验数据计算的结合参数列于表 2 由表 2 可知, 药物与血清白蛋白分子的结合常数均较大, 说明药物分子药物分子 -Co( Ⅱ ) 均与 BSA/ HSA 形成了较稳定的复合物, 也侧面证实了 BSA/ HSA 的荧光猝灭机制为静态猝灭但两种蛋白质分子的结构差别反映在二者结合常数的差异上, 5-HMF 和 HSA 的结合相对容易同时, 分析实验所得结果可见, Co( Ⅱ ) 介导均对 5-HMF-HSA/BSA 体系的结合常数和结合位点数产生一定影响, 但不同血清蛋白质分子的结构差别, 导致 Co(Ⅱ) 介导 5-HMF-HSA/ Figure 4 The plot of lg[(f 0 F)/F] vs. lg[d t] for 5-HMF/ Co(Ⅱ)-5-HM-BSA/HSA solution system Table 2 The binding parameters of drug and drug-ion binding with BSA/HSA System K/L mol 1 n Equation R 5-HMF-BSA y = x HMF-HSA y = x HMF-Co(Ⅱ)-BSA y = x HMF-Co(Ⅱ)-HSA y = x BSA 反应体系的程度不同, 造成相互作用的差别 3 5- 羟甲基糠醛 - 血清白蛋白体系的能量转移参数测定按照 Föster 能量转移理论 [14], 可以求出药物分子蛋白质分子间的能量转移效率及药物分子与蛋白质分子中荧光发射残基的距离据此理论, 荧光发射体和荧光猝灭体之间能量转移效率 (E) 与两者之间的距离 (r) 及临界能量转移距离 (R 0 ) 相关 : E = R /( R + ) (3) 0 0 r 其中 R 0 是 E = 50% 时的临界能量距离 (nm): R 6 25 K 2 N 4 0 = φj (4) 式中 K 2 为偶极空间取向因子 (K 2 = 2/3); N 为介质的折射指数 (N = 1.36); Φ 为授体的光量子效率 (Φ = 0.13); J 为授体 ( 蛋白质 ) 荧光发射光谱与受体 ( 药物 ) 吸收光谱间的光谱重叠积分, cm 3 L mol 1 其中 J= F λελλ dλ F λ dλ (5) 4 ( ) ( ) ( ) 0 0 式中 F (λ) 为荧光授体在波长 λ 处的荧光强度 ; ε (λ) 为受体在波长 λ 处的摩尔吸收系数 (L mol 1 cm 1 ) 则能量转移效率 E 可按式 (6) 确定 :

5 郭明等 : 5- 羟甲基糠醛与不同血清白蛋白的结合反应机制研究 389 E = 1 F / F 0 (6) 根据实验数据按式 (5) 计算 5-HMF/Co( Ⅱ) -5-HMF 与 BSA/HSA 结合反应的光谱重叠积分 J HSA-5-HMF J HSA-Co( Ⅱ) -5-HMF J BSA-5-HMF J BSA-Co( Ⅱ) -5-HMF, 代入公式 (4) (6) 求得 5-HMF/Co( Ⅱ) -5-HMF 与 BSA/HSA 的 R 0 及 E, 进而由式 (3) 求出 5-HMF/Co( Ⅱ) -5-HMF 与 BSA/HSA 间的 r, 相应能量转移参数一并列于表 3 Table 3 The energy transfer parameters between quencher and BSA/HSA System J /cm 3 dm 3 mol 1 R 0 E r /nm 5-HMF-BSA HMF-HSA HMF-Co(Ⅱ)-BSA HMF-Co(Ⅱ)-HSA 由表 3 可见, 5-HMF 及 5-HMF-Co(Ⅱ) 与 BSA/ HSA 分子的结合距离均小于 7 nm, 说明药物与两种血清白蛋白之间发生了非辐射能量转移同时, 分析实验所得结果, 得出如下规律 : 1 由于 BSA 与 HSA 分子结构的不同, 5-HMF-HSA 体系的能量转移效率高于 5-HMF-BSA 体系, 并且前者的结合距离略小于后者, 说明 5-HMF-HSA 的结合更紧密和稳定 ; 2 金属离子介导均对 5-HMF-HSA/BSA 体系的能量转移参数产生一定影响, 但不同血清蛋白质分子的结构差别, 导致 Co(Ⅱ) 介导 5-HMF-HSA/BSA 反应体系的程度不同, 造成非辐射能量转移参数的差别 4 5- 羟甲基糠醛 - 血清白蛋白体系的同步荧光光谱蛋白质的同步荧光光谱中, Δλ = 15 nm 显示酪氨酸残基的特征, Δλ = 60 nm 显示色氨酸残基的特征 [15] 5-HMF 与 HSA/BSA 结合反应的同步荧光光谱如图 5 和图 6 所示可以看出, 血清白蛋白分子中的酪氨酸残基和色氨酸残基的特征荧光光谱峰均随 5-HMF 浓度的增加而产生猝灭 ; 同时, 随着 5-HMF 浓度的增大, BSA 及 HSA 的酪氨酸残基特征荧光光谱峰位均发生微弱红移 ( 分别为 2.2 nm 0.8 nm), BSA 及 HSA 的色氨酸残基特征荧光光谱峰位均发生了微弱蓝移 ( 分别为 2.2 nm 5.0 nm), 说明 5-HMF 均使 BSA 及 HSA 的构象发生了变化, 使其酪氨酸残基所处的微区环境极性增大, 疏水性减少, 使其色氨酸残基所处的微区环境极性减小, 疏水性增大由于 BSA 和 HSA 分子结构的差异, 5-HMF 导致 BSA 在 Δλ = 15 nm 的同步荧光光谱最大发射波长的红移程度大 Figure 5 Effect of 5-HMF on synchronous fluorescence spectra of BSA. A: Δλ = 15 nm; B: Δλ = 60 nm. c (BSA) = mol L 1 ; c (5-HMF) /10 5 mol L 1 1 to 16: 0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0, 2.4, 2.8, 3.2, 3.6, 4.0, 4.4, 4.8, 5.2, 5.6, 6.0 Figure 6 Effect of 5-HMF on synchronous fluorescence spectra of HSA. A: Δλ = 15 nm; B: Δλ = 60 nm. c (HSA) = mol L 1 ; c (5-HMF) /10 5 mol L 1 1 to 16: 0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0, 2.4, 2.8, 3.2, 3.6, 4.0, 4.4, 4.8, 5.2, 5.6, 6.0

6 390 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (3): 于 HSA, 说明 5-HMF 造成 BSA 分子中酪氨酸残基所处微区环境极性的增加程度强于 HSA; 5-HMF 导致 HSA 在 Δλ = 60 nm 同步荧光光谱最大发射波长的蓝移程度明显大于 BSA, 说明 5-HMF 造成 HSA 分子中色氨酸残基所处微区环境疏水性的增加程度强于 BSA 本实验同时测定了 Co(Ⅱ) 介导下 5-HMF 对血清白蛋白构象的影响固定血清白蛋白浓度, 逐渐增加 Co(Ⅱ)-5-HMF 溶液浓度, 得到类似 5-HMF-HSA/BSA 体系的同步荧光光谱图由同步荧光光谱可知, 随着 Co(Ⅱ)-5-HMF 浓度的增加, 酪氨酸残基的最大发生峰发生微弱红移, 而色氨酸残基的最大发射峰发生了微弱的蓝移现象, 说明金属离子钴介导下 5-HMF 的加入均造成 BSA 及 HSA 的构象发生变化, 使其酪氨酸残基所处的微区环境的极性增大, 疏水性减小, 使其色氨酸残基所处的微区环境的极性减小, 疏水性增大, 并且 Co(Ⅱ)-5-HMF 导致 BSA 及 HSA 在 Δλ = 15 nm 的同步荧光光谱最大发射波长红移程度相当 ( 均为 0.4 nm), 但是 Co(Ⅱ)-5-HMF 导致 HSA 在 Δλ = 60 nm 的同步荧光光谱最大发射波长蓝移程度大于 BSA ( 分别为 2.0 nm 1.2 nm), 说明 Co(Ⅱ)-5-HMF 造成 HSA 分子中色氨酸所处微区环境疏水性的增加程度强于 BSA, 由于 BSA 及 HSA 分子结构不同, 药物导致不同血清白蛋白的构象改变程度有强弱之分 5 BSA/HSA-5-HMF/5-HMF-Co(Ⅱ) 结合反应对 BSA/HSA 构象形态变迁的影响为了解药物与血清白蛋白结合反应对 BSA/HSA 构象形态变迁的动力学机制, 采用荧光相图法作进一步分析 [16] 荧光相图法是在发射波长 λ 1 和 λ 2 下测定蛋白质在不同实验条件下荧光强度 I (λ 1 ) 和 I (λ 2 ) 的变化来描述蛋白质的结构变化结果由于荧光强度是一种广度性质, 因此存在以下关系 : I (λ 1 ) = a + b I (λ 2 ) (7) 对于蛋白质的构象形态变迁过程, 若关系式 (7) 表现为线性, 则表示相应的构象形态转变过程符合二态模型 ; 反之若为非线性, 表明蛋白质的构象形态转变过程是一个序变过程 ; 若关系式 (7) 表现为两条或多条直线, 其中每一条直线都描述一个全或无的蛋白质结构变化过程, 则符合多态模型本工作采用荧光相图法检测 5-HMF/5-HMF- Co(Ⅱ) 与 HSA/BSA 相互作用中 HSA/BSA 构象形态的变迁信息, 图 7 为根据实验数据作出的相应荧光相图从图 7 可以看出, 5- 羟甲基糠醛与 HSA 及 BSA 结合反应的荧光相图均呈线性, 说明 5-HMF 与 BSA/ HSA 发生非共价结合作用时, BSA/HSA 中构象形态变迁过程不是一序变过程, 是一个二态模型 5- HMF-Co(Ⅱ) 与 HSA 及 BSA 结合反应的荧光相图也均呈线性 (BSA-5-HMF-Co(Ⅱ) 体系 : y = x, r = ; HSA-5-HMF-Co(Ⅱ) 体系 : y = x, r = ), 说明 5-HMF-Co(Ⅱ) 与 BSA/HSA 发生非共价结合作用时, BSA/HSA 中构象形态变迁过程也是一个二态模型 6 分子模拟研究基于 BSA 和 HSA 的高序列同源性 (76.52%), 本实验选用 HSA 结构数据进行 5- 羟甲基糠醛与血清白蛋白分子的计算机模拟研究研究表明 HSA 能在不同的结合位点结合多种配体, 其中两个药物主要结合位域 (Sudlow s sites I 和 II) 包含 6 个结合位点 (FAT1, FAT2, FAT3, FAT4, FAT5, FAT6) 及药物经典结合位点考虑到 5- 羟甲基糠醛的分子结构特点, 分子对接模拟计算研究时, HSA 晶体结构取自蛋白质晶体数据库中 HSA 晶体结构 ( 编号 lh9z), 考虑华法林结合口袋为活性位点分子对接中通过参数对比来寻找 5-HMF 的最优结合位点与模式, 分子模拟结果见图 8 结果显示, HSA 分子活性对接位点对接 Figure 7 The fluorescence phase diagrams of BSA/HSA-5-HMF a: BSA-5-HMF; b: HSA-5-HMF. c (5-HMF) / c (5-HMF-Co(Ⅱ)) /10 5 mol L 1 1to16: 0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0, 2.4, 2.8, 3.2, 3.6, 4.0, 4.4, 4.8, 5.2, 5.6, 6.0

7 郭明等 : 5- 羟甲基糠醛与不同血清白蛋白的结合反应机制研究 391 Figure 8 Interaction mode between 5-hydroxymethyl-2-furfural (5-HMF) and HSA (A: residues around 10.0 Å of the ligand, B: residues around 20.0 Å of the ligand). The residues of HSA and the ligand structure are represented using stick model, thereinto red sticks represented oxygen. The hydrogen bond between the ligand and the protein is represented using red dashed line 5-HMF 获得最优结果, 图 8 清晰展现出 5-HMF 与 HSA 的结合位域及相互作用力由图 8 可以看出, 5-HMF 分子结合在 HSA 的表面活性口袋处, 整个分子处于被包围状态 5-HMF 分子距 HSA 酪氨酸残基 (Tyr150) 及苯丙氨酸残基 (Phe156) 很近, 这很好解释了 5-HMF 能够猝灭 HSA 内源荧光的现象同时, 5-HMF 分子与 HSA 结合过程中, 5-HMF 醛基上的氧原子与 Arg257 及 His288 发生氢键相互作用, 且 5-HMF 羟甲基上的氧原子与 His288 发生氢键相互作用 ; 另一方面, 5-HMF 非共价结合在 HSA 活性位点域, 其结合口袋周围主要由 Ala151 Ala254 Ala258 Ala261 Pro152 Pro282 Leu155 Leu283 Leu284 His288 Phe156 Ile290 氨基酸残基形成一个疏水区域, 可以清楚观察到 5-HMF 结合位点处的疏水相互作用, 即疏水作用在 5-HMF-HSA 复合物形成中起重要作用, 是药物和蛋白质分子结合的主要驱动力由分子模拟结果可知 5-HMF 与 HSA 之间的主要作用力为疏水作用及氢键, 这与其他类似实验的结果相一致 [17] 光谱实验结果显示 HSA 中色氨酸残基所在微区位域与 5-HMF 分子之间具有明显的相互作用, 实验测得 5-HMF-HSA 分子的结合距离为 2.04 nm, 而由图 8A 可见在配体周围 10.0 Å (1 Å = 0.1 nm) 范围内没有色氨酸残基, 因此将 HSA-5-HMF 周围 20.0 Å 的氨基酸残基通过分子对接图显示出来 ( 没有改变 HSA-5-HMF 内核结构及相互作用力 ), 见图 8B 从图 8B 可见, 在该结合距离范围, 确实存在色氨酸残基 Trp214, 并且对接结果显示的 Trp214 与 5-HMF 分子的距离与实验所测得的结合距离相符, 这充分提供了 5-HMF 猝灭 HSA 内源荧光的证据同步荧光光谱中, 5-HMF 导致 HSA 在 Δλ = 15 nm 的同步荧光光谱最大发射波长红移, 说明 5-HMF 嵌入酪氨酸残基结构位域改变了酪氨酸残基周围的微区构象, 使得肽链的伸展程度增加, 微区疏水腔相对展开, 结构位域中酪氨酸残基更大程度暴露于极性溶剂环境中, 造成周围的疏水性降低, 即 Tyr 残基周围微区的亲水性增加 ; 而色氨酸残基 Trp 在相对距离较远的邻近位域, 5-HMF 在造成 Tyr 残基结构位域微区构象改变的同时, 由于 HSA 分子倾向于保持整体能量最低的溶液紧缩形态, 药物分子嵌入 Tyr 残基结构位域中势必会压缩邻近微区位域使其肽链受到挤压, 分析 HSA 结构, 作者推测, 由于蛋白质分子的别构效应, 造成 Trp 结构位域一定程度紧缩, Trp 位域含疏水氨基酸残基, 造成疏水性增加, 故导致 Δλ = 60 nm 同步荧光光谱最大发射波长蓝移, 即分子模拟结果与光谱实验结果一致从 HSA-5-HMF 分子模拟结果可以推测, 5-HMF 与 BSA 之间的主要作用力为疏水作用及氢键 ; 同时, 分子模拟 HSA-5-HMF 复合物模型还能为今后基于晶体结构基础进一步研究 BSA-5-HMF 结合模型提供一定的参考小结本文利用光谱实验结合分子模拟技术研究了 5- 羟甲基糠醛与 BSA/HSA 之间的相互作用, 测定了结合常数和结合位点数, 实验结果表明, 药物分子与两种血清白蛋白之间的反应机制均为静态猝灭, 5- 羟甲基糠醛与 BSA/HSA 发生了非辐射能量转移现象通过光谱实验, 也证明 5- 羟甲基糠醛的加入可以引起 BSA/HSA 构象形态的转变, 且 BSA/HSA 的构象形态变迁符合二态模型金属离子介导对药物- 血清白蛋白相互作用存在一定的影响, 但 5- 羟甲基糠醛与 BSA/HSA 的相互作用占主导作用在实验基础上

8 392 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (3): 的分子模拟研究, 获得了药物结合位域非共价相互作用结合位点以及起主要作用的氨基酸残基等结构信息, 并获得了直观的结合反应模型, 相关结果可为中药活性成分 5- 羟甲基糠醛的药理作用机制研究提供一定的理论参考 References [1] Liu M, Zhu LY, Qu XK, et al. Thermodynamic study on interaction of paeonol and its two isomers with bovine serum albumin [J]. Acta Chim Sin ( 化学学报 ), 2007, 65: [2] Tan T, Huang R, Xia ZN. Studies on interaction between drugs with serum album in by modified fluorescence spectroscopy [J]. Chin J Anal Chem ( 分析化学 ), 2007, 35: [3] Fabrice F, Irina K, Igor N. Interactions of lactone, carboxylate and self-aggregated forms of camptothecin with human and bovine serum albumins [J]. FEBS Lett, 2002, 406: [4] Huang BX, Kim HY, Dass C. Probing three-dimensional structure of bovine serum albumin by chemical cross-linking and mass spectrometry [J]. J Am Soc Mass Spectrom, 2004, 15: [5] Yong G, Zhang YG, Ying JY. Efficient catalytic system for the selective production of 5-hydroxymethylfurfural from glucose and fructose [J]. Angew Chem, 2008, 120: [6] Guo M, Xu XT, W ZW. Binding mechanism of rhaponticin and human serum albumin [J]. Acta Pharm Sin ( 药学学报 ), 2011, 46: [7] Ma GZ. The Computational Chemistry Research on the Interaction of Quinolone Drugs with Biological Macromolecules ( 喹诺酮药物与生物大分子相互作用的计算化学研究 ) [D]. Hangzhou: Zhejiang University, [8] Zhao Q. The Research on Ligand-Protein Interaction Using Molecular Docking ( 基于分子对接技术的小分子 - 蛋白质相互作用研究 ) [D]. Wuxi: Jiangnan University, [9] Shang YH, Li H, Sun JJ, et al. Studies on the interaction between anticancer drug hydroxycamptothecin and bovine serum albumin by fluorescence spectroscopy [J]. Chin J Pharm Anal ( 药物分析杂志 ), 2010, 30: [10] Jiang CQ, Gao MX, He JX. Study of the interaction between terazosin and serum albumin synchronous fluorescence determination of terazosin [J]. Anal Chim Acta, 2002, 452: [11] Zheng MD, Yang JY, Hao J, et al. Study on the interactions of Chinese medicine component deoxyschizandrin and its metal ion complexes with serum albumin [J]. J Anal Sci ( 分析科学学报 ), 2010, 26: [12] Ni YN, Wang SS, Kokot S. Spectrometric study of the interaction between alpinetin and bovine serum albumin using chemometrics approaches [J]. Anal Chim Acta, 2010, 663: [13] Wu PG, Brand L. Resonance energy transfer: methods and applications [J]. Anal Biochem, 1994, 218: [14] Liu XH. Studies on the Interactions between Serum Albumins and Small Molecules of Flavonoid Compounds Using Spectral Technology ( 黄酮类药物小分子与血清蛋白间相互作用的光谱法研究 ) [D]. Liuzhou: Guangxi Normal University, [15] Xu XM. Study of the Interaction between Some Small Substances and Protein ( 某些小分子物质与蛋白质相互作用的研究 ) [D]. Lanzhou: Lanzhou University, [16] Kuznetsova IM, Stepanenko OV, Turoverov KK, et al. Unraveling multistate unfolding of rabbit muscle creatine kinase [J]. Biochim Biophys Acta, 2002, 1596: [17] Wang N, Liu ZY, Hu XL, et al. Interaction between Scutellaria baicalensis Georgi and human serum albumin [J]. Chem J Chin Univ ( 高等学校化学学报 ), 2011, 32:

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doc 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (11): 1503 1510 1503 转铁蛋白转运培氟沙星的分子作用机制研究郭明 *, 鲁小旺, 冉晓云, 胡润淮 ( 浙江农林大学化学系, 浙江临安 311300) 摘要 : 利用光谱实验结合计算机模拟技术研究转铁蛋白 (Transferrin, Tf) 转运药物培氟沙星 (pefloxacin mesylate,