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洲换柏
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1 第 34 卷第 9 期西南大学学报 ( 自然科学版 ) 2012 年 9 月 Vol.34 No.9 JournalofSouthwestUniversity (NaturalScienceEdition) Seṗ 2012 文章编号 : (2012) ,4,7,10 四氮杂环十二烷合铜与 1 牛血清白蛋白的相互作用刘凡, 李琼, 邹琼乐山师范学院化学学院, 四川乐山摘要 : 利用荧光光谱法研究了 1,4,7,10 四氮杂环十二烷合铜 (CycleṉCu(Ⅱ)) 配合物与牛血清白蛋白 (BSA) 的相互作用, 用 SterṉVolmer 方程 LineweaveṟBurk 方程确定了其荧光猝灭机理为静态猝灭, 得到 1,4,7,10 四氮杂环十二烷合铜配合物和 BSA 作用的结合常数结合点位数, 计算了在不同的 ph 值温度及表面活性剂溶液中的热力学参数, 实验结果表明其作用力主要为静电作用力. 还探讨了表面活性剂对 CycleṉCu(Ⅱ) 与 BSA 作用的影响, 实验结果显示表面活性剂使得 BSA 在 348nm 处的荧光峰蓝移约 12nm 并且其强度随表面活性剂浓度的增加而降低. 关键词 :1,4,7,10 四氮杂环十二烷合铜 ; 牛血清白蛋白 ; 荧光光谱 ; 表面活性剂中图分类号 :O657.3 文献标志码 :A 1,4,7,10 四氮杂环十二烷 (Cyclen) 是一种利用极广泛的螯合剂, 它可以与 Cu 2+,Zn 2+,Co 2+,Ni 2+, La 3+ 等金属离子形成配合物, 而这些金属配合物对磷酸酯羧酸酯 DNA 和 RNA 的水解有极高的催化活性 [1-4], 配体自身及其金属配合物也可以借助于胺基的质子化通过氢键或静电作用与羧酸根磷酸根核 [5-6] 苷酸等结合而形成超分子化合物, 达到分子识别的目的. 血清白蛋白是哺乳动物血浆中最丰富的载体, 可与许多内源性或外源性化合物结合而作为存储和转运蛋白, 特别是当药物分子进入血液后不同程度地与血清白蛋白结合, 可以运载控制药物向受体的释放, 是药物发挥药效的重要载体. 因此探讨 1,4,7,10 四氮杂环十二烷合铜配合物 (CycleṉCu(Ⅱ)) 与血清白蛋白的相互作用, 对于研究药物作用机制及药物分子设计等都具有重要的意义. 本文应用荧光光谱法研究了 CycleṉCu(Ⅱ) 与生物大分子牛血清白蛋白的相互作用, 以及溶液 ph 值温度和表面活性剂等对反应的影响, 利用 SterṉVolmer 方程 Lineweaveṟ Burk 方程确定了 CycleṉCu(Ⅱ) 对 BSA 的荧光猝灭机理为静态猝灭, 并得到其结合常数结合点位数 ; 通过热力学方程计算得到了 CycleṉCu(Ⅱ) 与 BSA 作用的热力学参数, 其作用力主要为静电作用力. 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 CaryEclipse 荧光分光光度计 ( 带恒温装置, 美国 VARIAN 公司 ),easy 酸度计 ( 梅特勒 ( 上海 ) 仪器有限责任公司 ). 牛血清白蛋白 (BSA, 上海伯奥生物科技有限责任公司 ),1,4,7,10 四氮杂环十二烷 ( 北京百灵威公司 ), 十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB 成都科龙试剂厂, 重结晶后使用 ), 十二烷基硫酸钠 (SDS, 进口分装 ), 1 收稿日期 : 基金项目 : 四川省教育厅科研基金资助项目 (08zc038). 作者简介 : 刘凡 (1964 ), 男, 高级实验师, 主要从事表面化学及化学动力学的研究.

2 2 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 34 卷聚氧乙烯醚 (Brij35,Sigma 公司 ); 三羟甲基氨基甲烷 (Tris) 硫酸铜氯化钠盐酸为分析纯, 实验用水为二次蒸馏水. [7] 1.2 Cyclen-Cu(Ⅱ) 的制备取 1,4,7,10 四氮杂环十二烷 17.2 mg 置于梨形烧瓶中, 加 ml 无水乙醇溶解, 缓慢地滴入含有 17.6mg 无水硫酸铜的 5.00mL 无水乙醇溶液中,60 加热回流 160min, 将乙醇蒸馏去除部分, 冷却, 过滤, 得到深蓝色的 CycleṉCu(Ⅱ) 配合物 ( 图 1), 固体再以无水乙醇洗涤, 干燥. 1.3 实验方法取 1.50mL 缓冲溶液于比色皿中, 加入 0.50 ml 牛血清白蛋白的氯化钠溶液及一定量的表面活性剂溶液, 并用水稀释至 3.00 ml, 再加入一定量的 CycleṉCu(Ⅱ) 水溶液 ( 不多于 100μL), 恒温 10 min, 以 290nm 为激发波长, 发射狭缝和激发狭缝均为 5nm, 测定该系列溶液的荧光发射光谱图, 并测量其荧光峰值的荧光强度. 2 结果与讨论图 1 Cyclen-Cu(Ⅱ) 的结构式 2.1 Cyclen-Cu(Ⅱ) 与 BSA 作用的荧光发射光谱蛋白质中因含有色氨酸酪氨酸及苯丙氨酸等残基而发射较强的内源荧光. 在激发波长为 290nm 时, 固定 BSA 的浓度, 而当不断加大溶液中的 CycleṉCu(Ⅱ) 浓度时,BSA 在 346nm 处荧光发射峰强度逐渐减弱, 荧光峰的峰位发生了较为明显的蓝移 ( 蓝移约 9nm)( 图 2). 2.2 Cyclen-Cu(Ⅱ) 与 BSA 作用的机理小分子对牛血清白蛋白的荧光猝灭分为动态猝灭和静态猝灭. 如果 CycleṉCu(Ⅱ) 对 BSA 荧光猝灭为动态猝灭机理, 即遵循 SterṉVolmer 方程 : 即 F0 [Dt]=1+Ksv[Dt] (1) F =1+Kqτ0 F0 -F F =Ksv [Dt] (2) 式中 :Ksv 为动态猝灭常数,K q 为散射碰撞猝灭速率常数,τ0 为没有猝灭剂存在下荧光分子平均寿命,Dt F0-F 为猝灭剂 CycleṉCu(Ⅱ) 的浓度. 以作图, 得到 F ~Dt SterṉVolmer 曲线 ( 图 3) 并对实验数据线性拟合得到线性回归方程, 计算得到动态猝灭常数 Ksv 及散射碰撞猝灭速率常数 K q ( 表 1). c[cycleṉcu(Ⅱ )]=0,0.67,1.00,1.33,1.67,2.00,2.67,3.33, 4.00 ( 10-4 mol/l),t=308k. 图 2 Cyclen-Cu(Ⅱ) 对 BSA 的荧光光谱猝灭 (c(bsa)= mol/l) -ph=9.00,*-ph=8.00, -ph=7.50, -ph=7.00; c(bsa)= mol/l,t=308k. 图 3 308K 水溶液中 Cyclen-Cu(Ⅱ) 与 BSA 作用的 Stern-Volmer 曲线

3 第 9 期刘凡, 等 :1,4,7,10 四氮杂环十二烷合铜与牛血清白蛋白的相互作用 3 表 1 在 308K 水溶液中 Stern-Volmer 曲线线性回归方程 ph 拟合方程 r Ksv K q 7.00 y= x y= x y= x y= x 条件 :T=308K,c[CycleṉCu(Ⅱ)]=0,0.67,1.00,1.33,1.67,2.00,2.67,3.33,4.00 ( 10-4 mol/l),c(bsa)= mol/l. 由表 1 中的结果可见 308K 时, 在不同的 ph 值溶液中 K q ( L/(mol s) 分别为 9.61,9.90, 12.5,10.4,K q 远大于最大散射碰撞猝灭速率常数 L/(mol s), 这表明 CycleṉCu(Ⅱ) 对 BSA 的荧光猝灭不是分子间碰撞而引起的动态荧光猝灭, 而应该是 CycleṉCu(Ⅱ) 和 BSA 结合形成多元复合物而引起的静态荧光猝灭. 2.3 Cyclen-Cu(Ⅱ) 与 BSA 作用的结合常数结合位点数与热力学参数 CycleṉCu(Ⅱ) 对 BSA 的荧光猝灭为静态猝灭时, 即遵循 LineweaveṟBurk 方程 : F0 -F ln F =lnka +nln [Dt] (3) 式中 :Ka 为 CycleṉCu(Ⅱ) 和 BSA 的结合常数,n 为结合位点数. 以 ln F0 -F F ~ln [Dt] 作图得到 Liṉ -ph=8.00, -ph=9.00, -ph=7.50, -ph=7.00; c[cycleṉcu(Ⅱ)]=0,0.67,1.00,1.33,1.67,2.00,2.67,3.33, 4.00 ( 10-4 mol/l),c(bsa)= mol/l,t=308k. 图 4 水溶液中 Cyclen-Cu(Ⅱ) 与 BSA 作用的双对数曲线 eweaveṟburk 双对数曲线 ( 图 4)(r ), 即可计算出结合常数 Ka 和结合位点数 n( 表 2). 表 2 水溶液中 Cyclen-Cu(Ⅱ) 和 BSA 的结合常数结合位点数及热力学参数 T ph n Ka ( 10 5 ) -ΔG -ΔH TΔS 条件 :c[cycleṉcu(Ⅱ )]=0,0.67,1.00,1.33,1.67,2.00,2.67,3.33,4.00 ( 10-4 mol/l),c(bsa)= mol/l. 此结合常数较大, 说明 CycleṉCu(Ⅱ) 与 BSA 之间有较强的结合力.Cu 2+ 离子的外层电子构型为 3s 2 3p 6 3d 9, 其空轨道可以形成 sp 3 d 2 的杂化轨道, 这样 Cyclen 中的 4 个氮原子的孤对电子填充在 Cu 2+ 离子的 sp 3 d 2 的杂化轨道中, 与 Cu 2+ 离子形成配位键并处于同一个平面上, 而余下的两个空的 sp 3 d 2 的杂化轨道可以接受 BSA 中 O 或 N 原子的孤对电子而形成配位键, 从而使得 CycleṉCu(Ⅱ) 与 BSA 结合较为紧密. 在相同的实验温度条件下,CycleṉCu(Ⅱ) 与 BSA 的结合常数随 ph 值成抛物线型变化, 当溶液的 ph 值较小时, 溶液中 BSA 的 N,O 的孤对电子与 CycleṉCu(Ⅱ) 中的 Cu 2+ 形成配位键而形成 CycleṉCu (Ⅱ)-BSA 三元复合物 ; 当溶液的 ph 值增大时,OH - 与 CycleṉCu(Ⅱ) 中的 Cu 2+ 形成配位键, 从而阻碍了 CycleṉCu(Ⅱ) 和 BSA 的结合并使其结合常数减小. 在相同的 ph 值条件下结合常数随静态猝灭随着温度的升高而减小, 即 CycleṉCu(Ⅱ) 和 BSA 复合物的稳定性下降. 当温度变化不大时, 反应的 ΔH 可以看作一个常数. 根据不同温度下的结合常数可计算得到热力学参数 :

4 4 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 34 卷 æ ö æ = 1-1 ö ç ΔH è ø èt1 T2 ø R (4) ΔG =-RTlnKa (5) ç ln Ka2 Ka 1 ΔG =ΔH -TΔS (6) 式中 :ΔH 为焓变,ΔG 为自由能变,ΔS 为熵变,R 为大气压常数,T1 和 T2 分别为两个状态下的热力学温度,Ka1 和 Ka2 分别为不同温度下的结合常数.CycleṉCu(Ⅱ) 与 BSA 结合后的 ΔH,ΔG 及 ΔS 的计算结果见表 2. 不同小分子物质与血清白蛋白结合力的类型是不同的,Ross [8-9] 等人总结出了判断小分子与生物大分子结合力性质和热力学规律 :ΔH>0,ΔS>0 为疏水作用力 ;ΔS<0,ΔH<0 为氢键和范德华力 ;ΔH< 0,ΔS>0 为静电引力. 从表 2 可见,ΔG<0,ΔS>0, 因此 CycleṉCu(Ⅱ) 与 BSA 的结合是一个自由能降低熵值增加的自发过程 ;CycleṉCu(Ⅱ) 与 BSA 结合的 ΔH<0,ΔS>0, 可以认为其分子间主要表现为静电作用力. 2.4 表面活性剂对 Cyclen-Cu(Ⅱ) 与 BSA 作用的影响表面活性剂溶液浓度对 CycleṉCu(Ⅱ) 与 BSA 作用的荧光光谱的影响血清白蛋白是由氨基酸构建成的共聚物大分子, 其既有极性基团, 又有非极性基团, 而对于血清白蛋白内部主要是疏水性的基团, 表面以亲水性的基团为主, 有极少的是疏水性的基团. 在血清白蛋白溶液中加入表面活性剂, 其一是血清白蛋白与表面活性剂之间发生缔合或结合的相互作用, 其二是表面活性剂在 [10] 血清白蛋白链上或附近的胶束化作用. 当在 CycleṉCu(Ⅱ) 与 BSA 溶液中加入表面活性剂, 并且其浓度大于其表面活性剂临界胶束浓度几倍或十数倍时, 则表面活性剂在血清白蛋白链构成独立的胶束团簇, 形成珍珠项链模型结构, 可以将 BSA 中的色氨酸酪氨酸或苯丙氨酸等相关非极性基团增溶于胶束的内部, 使得 BSA 的荧光的猝灭由 CycleṉCu(Ⅱ) 和表面活性剂共同作用而猝灭, 因此在 CycleṉCu(Ⅱ)-BSA 中加入表面活性剂使得荧光强度进一步降低 ( 图 5), 而且由于加入表面活性剂使得 BSA 的 α 螺旋向 β 折叠的转变, 构成 α 螺旋的肽链伸展开来, 转化为较为松散的二级结构 [9], 这样也使 BSA 溶液的荧光强度降低. 在实验条件下,c 表面活性剂 cbsa, 而在蛋白质溶液中表面活性剂的临界胶束浓度较其在水溶液中有较大的降低 [10],BSA 中的色氨酸酪氨酸的非极性基团大部分增溶于胶束的内部, 因此随表面活性剂浓度的增加, 由表面活性剂浓度的变化而引起的荧光强度的变化较小表面活性剂溶液中 CycleṉCu(Ⅱ) 与 BSA 作用的结合常数及位点数与热力学参数在 CycleṉCu(Ⅱ) 与 BSA 作用的溶液中加入表面活性剂溶液使得结合位点数结合常数与热力学参数都有一定的变化, 这是因为表面活性剂胶束与 BSA 结合形成珍珠项链结构, 包裹或屏蔽了 BSA 的色氨酸或酪氨酸等氨基酸残基, 阻碍了 CycleṉCu(Ⅱ) 与 BSA 的结合导致了结合常数结合位点数的下降 ( 图 6, 表 3). 从表 2,3 可见, 不论是在水溶液还是在胶束溶液中,CycleṉCu(Ⅱ) 与 BSA 的结合都是一个自由能降低熵值增加的自发过程 ; 其 CycleṉCu(Ⅱ) 与 BSA 分子间的作用力皆主要表现为静电作用力. c(bsa)= mol/l,c[cycleṉcu(Ⅱ)]= mol/l, c(brij35)=0,0,0.83,1.67,2.50,3.33,4.16,5.00( 10-4 mol/l), a h,ph=7.50,t=308k. 图 5 Brij35 浓度对 Cyclen-Cu(Ⅱ)-BSA 作用的影响 -SDS, -CTAB, -Brij35;pH=7.50,T=308K,c(BSA)= mol/l,c[cycleṉcu(Ⅱ)]=0,0.67,1.00,1.33,1.67,2.00, 2.67,3.33,4.00( 10-4 mol/l). 图 6 胶束溶液中 Cyclen-Cu(Ⅱ) 与 BSA 作用的双对数曲线

5 第 9 期刘凡, 等 :1,4,7,10 四氮杂环十二烷合铜与牛血清白蛋白的相互作用 5 表 3 当 ph=7.50 时胶束溶液中 Cyclen-Cu(Ⅱ) 和 BSA 的结合常数结合位点数及热力学常数 T n Ka ( 10 4 ) -ΔG -ΔH TΔS CTAB SDS Brij 条件 :c(ctab)= mol/l,c(sds)= mol/l,c(brij35)= mol/l,c[cycleṉcu(Ⅱ) 10 7 ]=0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0mol/L,c(BSA)= mol/l. 2.5 Cyclen-Cu(Ⅱ) 与 BSA 作用的同步荧光同步荧光具有简化光谱窄化谱带提高选择性和减小光散射干扰等优点而常用来探讨蛋白质中酪氨酸和色氨酸微环境的改变.Δλ=15nm 和 Δλ=60nm 所作同步荧光光谱分别显示酪氨酸残基及色氨酸残 [11] 基的光谱特征. 芳香氨基酸残基若最大发射波长改变, 说明残基所处的微环境发生了改变, 故由发射波长的改变可判断 BSA 中芳香氨基酸残基所处微环境的变化. 如图 7-8 为 Δλ=15nm 和 Δλ=60nm CycleṉCu(Ⅱ) 和 BSA 作用的同步荧光光谱图. 在 BSA 浓度固定为 mol/l 时,CycleṉCu(Ⅱ) 浓度的增加, 使在最大发射波长处的荧光强度逐渐降低 ( 图 7), 其酪氨酸残基的特征荧光光谱峰位发生了红移, 说明酪氨酸残基所处的微环境疏水性增加, 亲水性降低. 由图 8 可知, 色氨酸残基的最大发射波长在 283nm 附近并且强度较大, 说明 BSA 的荧光主要由色氨酸残基所贡献, 且色氨酸的特征荧光光谱峰形及最大位置也发生了红移, 说明 CycleṉCu(Ⅱ) 主要与 BSA 中的色氨酸残基形成了复合物. 图 7 与图 8 相比, 色氨酸残基的荧光强度降低比酪氨酸残基更显著, 说明 CycleṉCu(Ⅱ) 与 BSA 的结合位点更接近于色氨酸残基. c[cycleṉcu(Ⅱ)]=0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0, mol/l. 图 7 溶液中 Cyclen-Cu(Ⅱ) 与 BSA 的同步荧光光谱 (Δλ=15nm) c[cycleṉcu(Ⅱ)]=0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0, mol/l. 图 8 水溶液中 Cyclen-Cu(Ⅱ) 与 BSA 的同步荧光光谱 (Δλ=60nm) 3 结论在实验条件下,CycleṉCu(Ⅱ) 对 BSA 的荧光猝灭为静态猝灭,CycleṉCu(Ⅱ) 与 BSA 作用的热力学参数 ΔG<0,ΔS>0, 这表明其结合是一个自由能降低熵值增加的自发过程 ; 而且 ΔH<0,ΔS>0, 可以认为 CycleṉCu(Ⅱ) 与 BSA 分子间主要表现为静电作用力. 当溶液中加入表面活性剂后, 表面活性剂胶束与 BSA 相互作用形成珍珠项链结构, 包裹或屏蔽了 BSA 的色氨酸或酪氨酸残基, 使得 346nm 处的荧光光谱发生了强度降低荧光峰蓝移的现象.

6 6 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 34 卷参考文献 : [1] SUBAT M,WOINAROSCHYK,GERSTLC,etal.1,4,7,10-Tetraazacyclododecane MetalComplexesasPotentPromoters ofphosphodiesterhydrolysisunderphysiologicalconditions[j].inorganicchemistry,2008,47(10): [2] 向清祥, 陈稼轩, 杨孝容, 等. 单方酰化大环四胺金属配合物与 DAN 相互作用研究 [J]. 有机化学,2008,28(7): [3] SUBAT M,WOINAROSCHY K,ANTHOFERS,etal.1,4,7,10-Tetraazacyclododecane MetalComplexesasPotentPromotersofCarboxyesterHydrolysisUnderPhysiologicalConditions[J].InorganicChemistry,2007,46(10): [4] XIANG Qing-xiang.CatalyticHydrolysisofPhosphateDiester(BNPP)andPlasmidDNAby MononuclearMacrocyclic PolyamineMetalComplexes[J].ChinChem Let,2009,20: [5] ZHANGZhi-hui,LU Yaṉchun,GUOJiaṉhua.TheEfectofOrganicLinkersontheSupramolecularStructuresofTwo Ni(Ⅱ)Cyclen Complexes (Cyclen=1,4,7,10-Tetraazadodecane)[J].JournalofChemicalCrystalography,2006, 36(6): [6] XIANG Qing-xiang,YU Xiao-qi,WUJing,etal.MolecularRecognnitionofBasesandNuleosidesbyMono-substituted MononuclearComplexesof1,4,7,10-Tetraaza-Cyclododecane[J].ChineseJournalofChemistry,2003,21: [7] 向清祥. 新型大环多胺金属配合物的设计合成超分子识别与仿酶催化作用 [D]. 成都 : 四川大学,2002. [8] ROSSPD,SUBMMANIANS.ThermodynamicofProteinAssociationReactions:ForcesContributingtoStability[J]. Biochem,1981,20: [9] 刘敏, 孙德志, 林瑞森. 人血清白蛋白与季铵盐双子表面活性剂的相互作用 [J]. 化学学报,2007,65(2): [10]K 霍姆博格,B 琼森. 水溶液中的表面活性剂和聚合物 [M]. 韩丙勇, 张学军, 译. 北京 : 化学工业出版社,2006:241. [11] 许金钩, 王尊本. 荧光分析法 [M].3 版. 北京 : 科学出版社,2006: OntheInteractionofCyclen-Cu(Ⅱ)withBovineSerum Albumin LIU Fan, LI Qiong, ZOU Qiong ColegeofChemistry,LeshanNormalUniversity,LeshanSichuan614004,China Abstract:TheinteractionofcycleṉCu(Ⅱ)withbovineserumalbumin (BSA)wasinvestigatedwithfluorescencespectroscopy.TheresultsshowedthatCycleṉCu(Ⅱ)stronglyquenchedfluorescenceofBSA.UsingtheSterṉVolmerequationandtheLineweaveṟBurkequation,itwasprovedthatthefluorescence quenchingmechanism belongedtothestaticquenching.accordingtothelineweaveṟburkequationand thethermodynamicsequation,thebindingconstants,bindingstatesandthermodynamicsparameterswere obtainedatdiferenttemperaturesintheaqueoussolutionandthesurfactantsolutions.theelectrostatic forceplayedamainroleinthebindingofcycleṉcu(Ⅱ)withbsa.thewavelengthofthefluorescence spectrumapexeschangedtoshortwaveat348nminthesurfactantsolutions. Keywords:cycleṉCu(Ⅱ);bovineserumalbumin;fluorescencespectroscopy;surfactant 责任编辑潘春燕

7 第 9 期刘凡, 等 :1,4,7,10 四氮杂环十二烷合铜与牛血清白蛋白的相互作用 7

材料导报研究篇年月下第卷第期种球的制备单步溶胀法制备分子印迹聚合物微球洗脱处理种子溶胀聚合机理种球用量的影响

材料导报研究篇年月下第卷第期种球的制备单步溶胀法制备分子印迹聚合物微球洗脱处理种子溶胀聚合机理种球用量的影响水相中组氨酸单分散分子印迹聚合物微球的合成表征及其识别性能研究李思平等李思平徐伟箭较佳工艺条件下在水性体系中选用无皂乳液聚合法制得的单分散微米级聚苯乙烯微球为种球分别以组氨酸甲基丙烯酸或丙烯酸胺乙二醇二甲基丙烯酸酯为模板分子功能单体和交联剂合成了组氨酸分子印迹聚合物微球研究了形貌粒径及其分布以及模板分子与功能单体之间的相互作用分别以激光粒度分析仪紫外分光光度法和红外光谱表征功能单体与交联剂之间的共聚情况