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豹伏
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1 第 34 卷第 8 期 2015 年 8 月环境化学 ENVIRONMENTAL CHEMISTRY Vol. 34, No. 8 August 2015 DOI: / j.issn 孙梅香, 刘文, 高嘉苓, 等. 荧光光谱法研究草甘膦与腐殖酸的相互作用 [J]. 环境化学,2015,34(8): SUN Meixiang, LIU Wen, GAO Jialing, et al. Study on the interaction between glyphosate and humic acid using fluorescence spectrometry and parallel factor analysis method[ J].Environmental Chemistry,2015,34(8): 荧光光谱法研究草甘膦与腐殖酸的相互作用孙梅香刘文高嘉苓吴曼张业中戴捷 ( 长江大学化学与环境工程学院, 荆州, ) 摘要应用荧光光谱法研究了草甘膦 ( PMG) 与腐殖酸 ( HA) 的相互作用. 荧光猝灭实验表明,PMG 对 HA 的荧光产生静态猝灭 ; 通过对不同温度下反应热力学参数的计算, 发现二者相互间作用力主要是氢键和范德华力. 受到 PMG 作用的影响,HA 的同步荧光光谱出现了蓝移现象, 初步说明 HA 在作用后共轭度降低. 采用平行因子分析技术对加入 PMG 前后的 HA 三维荧光光谱进行解析, 发现加入 PMG 后 HA 荧光组分不仅出现在区域 Ⅴ( 难降解有机物荧光区 ) 中, 而且有部分出现在了区域 Ⅲ( 可降解有机物荧光区 ) 中, 总荧光强度明显减弱, 而且组分 C3 C4 有明显的蓝移现象. 三维荧光光谱分析验证了荧光猝灭及同步荧光的研究结果, 并进一步表明,PMG 与 HA 的相互作用使 HA 共轭度降低, 并且可能有可降解物质生成. 关键词腐殖酸, 草甘膦, 平行因子分析, 荧光光谱. Study on the interaction between glyphosate and humic acid using fluorescence spectrometry and parallel factor analysis method SUN Meixiang LIU Wen GAO Jialing WU Man ZHANG Yezhong DAI Jie ( College of Chemical and Environmental Engineering, Yangtze University, Jingzhou, , China) Abstract: The interaction between glyphosate ( PMG) and humic acid ( HA) were investigated by fluorescence spectroscopy method. The fluorescence quenching experiment indicated that fluorescence intensity of HA was decreased by PMG owing to a static quenching process. The binding constants and thermodynamics parameters of PMG with HA were obtained at different temperatures, and the results showed that hydrogen bonds and Van der Waals forces played a main role in the binding of PMG with HA. The blue shift of synchronous fluorescence spectra showed that the binding with PMG reduced the conjugation of HA. In addition, parallel factor ( PARAFAC) analysis was employed to analyze the three dimensional fluorescence spectra of the HA. Firstly, the results displayed that all the fluorescent components of HA were in the region Ⅴ which is the refractory organics region. After adding PMG into HA, some peaks of HA were in the region Ⅲ which is the biodegradable organics region. Secondly, the total fluorescence intensity of HA was decreased. Thirdly, the fluorescent component C3 and C4 of HA disdayed blue shift. It not only confirmed the results of the fluorescence quenching spectra and synchronous fluorescence spectroscopy, but also demonstrated that the interaction between HA and PMG reduced the conjugation of HA and may generate some biodegradable substances. Keywords:humic acid, glyphosate, parallel factor analysis, fluorescence spectrum 年 12 月 24 日收稿. 国家自然科学基金 ( ); 湖北省自然科学基金重点项目 (2013CFA107) 资助. 通讯联系人,Tel: ; E mail: cjdxdaijie@ 163.com

2 1530 环境化学 34 卷草甘膦 (PMG) 是目前使用量最大的除草剂之一, 可通过多种途径进入土壤及水生生态系统, 其环境毒性日益受到关注 [1]. 腐殖酸 (HA) 广泛存在于土壤及水生系统, 具有很强的吸附性和螯合能力, 能与许多环境化学物质发生吸附结合作用, 从而影响这些物质的环境化学及生物化学行为 [2 3]. 探讨 PMG 与 [4] HA 的相互作用对理解 PMG 的环境化学行为具有重要意义.Pierluigi 等虽用 NMR 法对草甘膦与腐殖酸相互作用的机制做了相关研究, 但 NMR 法灵敏度低对样品需要进行严格的预处理在样品组成分析上有所不足, 且对腐殖酸中各类有机物与草甘膦作用前后的构象变化未做探讨.HA 分子中含有大量的苯环稠苯环和杂环, 环及支链上有羧基酚羟基醌基甲氧基等各种官能团, 具有较特殊的荧光性质 [5 6]. 荧光光谱技术是一种理想的研究 HA 的方法 [7 8]. 荧光光谱法具有高灵敏度高特异性及操作方便等优势, 但荧光光谱的相互叠加及拉曼效应瑞利散射峰等因素在光谱分析时会带来一定的干扰, 尤其是针对三维荧光光谱分析. 解析三维荧光光谱是深入探究 PMG 与 HA 作用机理的必由途径, 为此需要借助平行因子分析法 (PARAFAC) 对各个因子进行分离和解析, 提高光谱分析准确性 [9]. 本文首先采用荧光猝灭法探究 PMG 与 HA 相互作用机理与作用力类型, 然后采用同步荧光法分析 HA 作用后的构象变化, 最后运用平行因子分析法对 PMG 作用下 HA 的三维荧光光谱进行解析, 以获得更多 PGM 与 HA 相互作用的信息. 1 材料与方法 1.1 仪器与材料 LS 55 型荧光分光光度计 ( 美国 Perkin Elmer 公司 );AY 120 电子分析天平 ( 日本岛津公司 );SYC 15 型超级恒温水浴 ( 南京桑力电子设备 ); 草甘膦 ( 分析纯, 沙隆达农药厂提供 ); 腐殖酸 ( HA,Sigma 公司提供 ); 所用试剂均为分析纯, 实验用水为二次蒸馏水. 1.2 实验方法荧光猝灭光谱设置激发波长 325 nm, 激发和发射狭缝宽度均为 10.0 nm, 扫描速度为 1200 nm min -1. 测定在不同温度下不同浓度草甘膦溶液与腐殖酸相互作用的荧光猝灭图谱, 记录波长在 nm 范围内的荧光光谱同步荧光光谱设置 Δλ = 55 nm, 扫描范围 λ em = nm, 其它参数同节, 对不同浓度 PMG 溶液与 HA 的混合液进行扫描并记录三维荧光光谱的测定设置激发和发射狭缝宽度均为 10.0 nm, 扫描速度 1200 nm min -1 ; 起始激发波长 250 nm, 扫描次数 :21, 扫描间隔 :10 nm, 发射波长范围 nm. 分别对不同温度下水空白和加入 PMG 前后的 HA 溶液进行三维荧光扫描平行因子原理本文采用 PARAFAC 算法对加入 PMG 前后的 HA 三维荧光光谱进行分离解析.PARAFAC 算法是一种多维分析方法, 同时也是一种分解的方法, 是对主成分分析 (PCA) 向更高阶阵列的一种扩展, 在进行分析时, 可将一个由多个 EEM 数据合成的三维阵列 ( 样品激发发射 ) 分解为 A B C 的 3 个载荷矩阵.PARAFAC 模型采用最小二乘法 (ALS) 来求解 3 个载荷矩阵 A B 和 C.PARAFAC 模型可以表示为 : x ijk = F a if b jf c kf + ε ijk (1) f = 1 其中,x ijk a if b jf 和 c kf 分别为矩阵 X A B C 的元素 ;ε ijk 为三线性模型用于最小化模型中的残差的平方和. A B 和 C 分别为浓度值相对应的得分激发光谱和发光光谱矩阵 [9] 平行因子数据处理将扫描的各溶液三维荧光数据进行预处理 : 扣除二次蒸馏水的三维光谱以消除溶剂水的拉曼影响,

3 8 期孙梅香等 : 荧光光谱法研究草甘膦与腐殖酸的相互作用 1531 同时将瑞利散射区域置零. 将预处理后的 HA HA+PMG 溶液三维荧光光谱数据矩阵分别按样品号激发和发射波长的顺序合成三维数据阵列 ( ). 在 Matlab 2013 a 上, 利用工具箱 ( N way toolbox) 对合成数据阵列分别进行 PARAFAC 模型分析. 根据残差分析和核一致性选择组分数 4, 所得的相对荧光强度以拉曼单位 (R.U.,nm -1 ) 表示. 2 结果与讨论 2.1 荧光猝灭光谱图 1 为 PMG 与 HA 作用的荧光光谱图, 从图 1 可以看出, 随着 PMG 浓度的增加,HA 的荧光强度有规律地减弱, 表明 HA 和 PMG 之间存在着一定的相互作用. 图 1 PMG 与 HA 作用的荧光图 T = 303 K,λ ex = 325 nm, C (HA) = 20 mg L -1, C (PMG) :1 8 分别为 : ( 10-4 mol L -1 ) Fig.1 Effect of PMG on fluorescence spectra of HA 荧光猝灭通常将其分为动态猝灭和静态猝灭来讨论. 动态猝灭过程和静态猝灭过程分别用 Stern Volmer 方程 (2) 和 Lineweaver Burk 双倒数方程 (3) 进行描述 [10] : F 0 / F = 1 + K SV [Q] (2) (F 0 - F) -1 = F K -1 LB F -1 0 [Q] -1 (3) 式中,F F 0 分别为有猝灭剂和无猝灭剂时 HA 荧光强度,K SV K LB 分别为动态猝灭常数和静态猝灭常数, Q 为猝灭剂浓度. 由于动态猝灭依赖于扩散, 温度升高时溶液的黏度下降, 分子的运动加速, 其结果会导致扩散系数增大, 从而增大猝灭常数. 反之, 温度升高可能导致基态配合物稳定性下降, 从而减小静态猝灭的程度, 因此可以根据不同温度下 HA 的荧光猝灭情况来判断猝灭类型 [11]. 由图 2 和表 1 可以看出, 随温度的升高,Stern Volmer 直线斜率减小,K SV 呈明显下降趋势 ;Lineweaver Burk 直线斜率增大,K LB 值减小, 表明 PMG 的 HA 荧光猝灭作用不是由扩散和碰撞引起的动态猝灭, 而是生成了复合物的静态猝灭. 图 2 PMG 对 HA 的荧光猝灭图,(A) 为 Stern Volmer 图 ;(B) 为 Lineweaver Burk 图 Fig.2 Stern Volmer plot( A) and Lineweaver Burk plot( B) of PMG to HA

4 1532 环境化学 34 卷 2.2 作用力类型当温度变化不大时, 相互作用的焓变 (ΔH θ ) 可看成一个常数. 由热力学公式 (4) (5) 可求得作用前后 ΔH θ ΔS θ ΔG θ 等热力学函数的变化值 ( 表 1). ΔG θ = ΔH θ - TΔS θ (4) lnk = - ΔHθ RT + ΔSθ R 式中,K 是相应温度下的静态猝灭结合常数,R 为气体常数 J (mol K) -1. 由表 1 可以看出,ΔG θ <0 说明该反应是自发过程, ΔH θ <0,ΔS θ <0, 说明 PMG 与 HA 相互作用的作用力主要为氢键和范德华力 [12]. Table 1 表 1 不同温度下 PMG 与 HA 相互作用常数 Interaction constants of PMG to HA at different temperatures T / K K SV K LB ΔG q / (kj mol -1 ) ΔH q / (kj mol -1 ) ΔS q / (J mol -1 K -1 ) (5) 2.3 构象变化同步荧光光谱同步荧光分析法是提高分析选择性, 解决多组分荧光物质同时测定的良好手段之一. 同步荧光不仅被广泛应用于蛋白质构象变化的分析 [13 14],Horst 等还用来表征 HA 的来源, 并且指出荧光峰红移, 共轭度增加 ; 荧光峰蓝移, 共轭度降低 [15]. 如图 3 所示, 在 390 nm 和 453 nm 处存在两个荧光峰, 和 Horst 等测的土壤 HA 荧光峰类似. 从图 3 可以看出, 这两处的荧光峰在加入 PMG 后都有一定的蓝移, 说明在 PMG 作用下 HA 共轭度降低. 图 3 HA 的同步荧光光谱图 (Δλ = 55 nm,t = 303 K,C (HA) = 20 mg L -1, C (PMG) :1 8 分别为 : ( 10-4 mol L -1 ) Fig.3 Synchronous fluorescence spectra of HA 平行因子解析三维荧光光谱由于 HA 中荧光团复杂多样, 荧光光谱相互重叠, 从三维荧光光谱中直接寻找峰的位置和强度会有较大的误差, 导致分析的结论缺乏说服力. 为了解决这一问题, 本文利用 PARAFAC 模型对加入 PMG 前后 HA 的荧光组分进行分离. 根据模型分析可知,HA 荧光主要包含 4 个组分, 如图 4 5 所示,HA 组分 1 4 荧光峰分别在 λ ex / em = 260,390 / 446 nm(r.u. = / nm -1 ) λ ex / em = 260 / 504 nm(r.u. = nm -1 ) λ ex / em = 260 / 501 nm ( R. U. = nm -1 ) λ ex / em = 410 / 411,437 nm ( R. U. = / nm -1 ) 附近, 它们都属区域 Ⅴ [16] ( λ ex >250 nm 且 λ em >380 nm, 难降解有机物荧光区 ), 但加入 PMG 后 HA 组分 1 4 荧光峰分别在 λ ex / em = 300,390 / 501 nm( R. U. = / nm -1 ) λ ex / em = <250 / 446 nm (R.U. = nm -1 ) λ ex / em < 250 / 501 nm ( R. U. = nm -1 ) λ ex / em = 280 / 420,

5 ８期孙梅香等荧光光谱法研究草甘膦与腐殖酸的相互作用１５３３４３８ｎｍＲＵ００３８１６００２９５５ｎｍ１附近其中除了区域Ⅴ有峰外组分２和３在区域Ⅲ 可降解有机物荧光区内出峰而且在加入ＰＭＧ后ＨＡ４个组分的荧光峰总强度从０２８４９降到了０２６７１ＨＡ组分３４类富里酸峰发生了一定的蓝移图４Ｆｉｇ４３ＤＥＥＭｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｐｅｃｔｒａｏｆｔｈｅＨＡｆｏｕｒｓｐｅｃｔｒａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙＰＡＲＡＦＡＣ图５Ｆｉｇ５平行因子法解析得到ＨＡ的４种光谱组分三维荧光光谱图平行因子法解析得到ＨＡＰＭＧ的４种光谱组分三维荧光光谱图３ＤＥＥＭｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｐｅｃｔｒａｏｆｔｈｅＨＡＰＭＧｆｏｕｒｓｐｅｃｔｒａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙＰＡＲＡＦＡＣ

6 1534 环境化学 34 卷这些现象不仅表明加入 PMG 后,HA 荧光强度有了很大的猝灭, 而且可能有可降解物质生成, 进一步说明,HA 外露的疏水部分与加入的 PMG 通过范德华力相互作用, 同时含有较多羟基和羧基的类富里酸部分可能与 PMG 的活性基团 P O 等形成氢键, 这些作用导致 HA 的共轭度降低. 3 结论采用荧光光谱技术和平行因子分析法 (PARAFAC) 研究了草甘膦 (PMG) 与腐殖酸 ( HA) 的相互作用. 结果表明,PMG 对 HA 的荧光产生静态猝灭, 二者相互间主要通过氢键和范德华力自发生成复合物, 并且可能有可降解物质生成 ;PMG 与 HA 的相互作用也使得 HA 共轭度降低. 参考文献 [ 1 ] 周垂帆, 李莹, 张晓勇, 等. 草甘膦毒性研究进展 [J]. 生态环境学报, 2013, 22(10): [ 2 ] Margon A, Pastrello A, Mosetti D, et al. Interaction between diclofenac and soil humic acids[ J]. Soil and Sediment Contamination, 2009, 18: [ 3 ] Schenone S, Brullo C, Bruno O, et al. New 1, 3, 4 thiadiazole derivatives endowed with a nalgesic and anti in flammatory activities[j]. Bioorganic Medicinal Chemistry, 2006, 14: [ 4 ] Pierluigi Mazzei, Alessandro Piccolo, Quantitative evaluation of noncovalent interactions between glyphosate and dissolved humic substances by NMR spectroscopy[ J]. Environmental Science & Technology, 2003, 46: [ 5 ] Uyguner C S, Bekbolet M. Evaluation of humic acid photocatalytic degradation by UV vis and fluorescence spectroscopy[ J]. Catalysis Today, 2005, 101: [ 6 ] 于兵川, 吴洪特, 周培疆, 等. 五氯苯酚与腐殖酸作用的荧光猝灭效应研究 [J]. 环境化学, 2006, 25(2): [ 7 ] Sibel S K, Miray B. Tracing TiO 2 photocatalytic degradation of humic acid in the presence of clay particles by excitation emission matrix ( EEM) fluorescence spectra[ J]. Journal of Photochemistry and Photobiology A Chemistry, 2014, 282: [ 8 ] Zhang H M, Zhou Q H, Xue M G, et al. Fluorescence spectroscopic investigation of the interaction between triphenyltin and humic acids [J]. Spectrochimica Acta Part A, 2011, 78: [ 9 ] Bro R. PARAFAC tutorial and applications[ J]. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 1997, 38: [10] Lakowicz J R. Pronciples of fluorescence spectroscopy[ M]. 2 ed. New York: Kluwer Academic / Plenum Publishers, 1999: 237 [11] Kathiravan A, Chandramohan M, Renganathan R, et al. Spectroscopic studies on the interaction between phycocyanim and bovine serum albumin[ J]. Journal of Molecular Structure, 2009, 919(1 3): [12] Ross D P, Subramanian S. Thermodynamic of protein association reactions:forces contributing to stability[ J]. Biochemistry, 1981, 20: [13] Zhang X P, Hou Y H, Wang L, et al. Exploring the mechanism of interaction between sulindac and human serum albumin: Spectroscopic and molecular modeling methods[ J]. Journal of Luminescence, 2013, 138: 8 14 [ 14] Zhang Y Z, Zhou B, Zhang X P, et al. Interaction of malachite green with bovine serum albumin: Determination of the binding mechanism and binding site by spectroscopic methods[ J]. Journal of Hazardous Materials, 2009, 163(2 3): [15] Horst C, Sharma V K, Baum J C, et al. Organic matter source discrimination by humic acid characterization: Synchronous scan fluorescence spectroscopy and Ferrate ( Ⅵ)[ J]. Chemosphere, 2013, 90(6): [16] Chen W, Westerhoff P, Leenheer J A, et al. Fluorescence excitation emission matrix regional integration to quantify spectra for dissolved organic matter[ J]. Environmental Science & Technology, 2003, 37(24):

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