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溜羿
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1 Vol.38 高等学校化学学报 No 年 8 月 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 1354~ 1361 doi: / cjcu 全硫取代三苯甲基自由基酯基衍生物与牛血清白蛋白的相互作用安鹏姣 1, 于楠楠 1, 孙睿声 1, 隋小芳 2 1, 宋玉光 (1. 天津市临床药物关键技术重点实验室, 天津医科大学药学院, 天津 ; 2. 佳木斯大学附属第一医院, 佳木斯 ) 摘要采用荧光光谱电子顺磁共振 (EPR) 波谱紫外可见吸收光谱和分子对接等技术研究了全硫取代三苯甲基 (TAM) 自由基酯基衍生物 ET 03 与牛血清白蛋白 (BSA) 的相互作用, 发现 ET 03 与 BSA 能自发发生结合作用 ; 主要以疏水作用力结合在 BSA 亚结构域 ⅡA( 位点 Ⅰ) 和亚结构域 ⅢA( 位点 Ⅱ) 上 ; ET 03 对 BSA 的荧光猝灭效应为动态静态混合猝灭机制, 且可能存在非辐射能量转移. 研究结果表明, 酯基衍生化 TAM 自由基与白蛋白能自发结合, 有望用于蛋白构效关系研究 ; 同时也提示将 TAM 自由基酯基衍生物用于活体成像或自旋标记物时应考虑其与蛋白相互作用的影响. 关键词三苯甲基自由基 ; 酯基衍生化 ; 牛血清白蛋白 ; 荧光猝灭 ; 电子顺磁共振波谱中图分类号 O625; O657 文献标志码 A 全硫取代三苯甲基 (TAM) 自由基于 1900 年发现之初并未受到关注, 直至 20 世纪 90 年代以后才得以快速发展 [1]. TAM 自由基及其衍生物 ( 如 CT 03 和 OX063 等, 结构见图 1) 因同时具有磁共振波谱及光谱多模式响应的特点, 目前已在 Overhauser 增强核磁共振成像对照试剂电子顺磁共振 (EPR) 波谱或成像试剂以及蛋白标记等领域得到了广泛应用 [2~ 7]. 受 GE 公司专利保护的 OX063 虽具有良好的水溶性, 但昂贵的价格使其难以普遍应用于生物体系. 与之相比, CT 03 具有易于合成价格低廉且易功能化等优势, 故以其为母核进行衍生化以构建性能稳定生物相容性高的 TAM 自由基成为当前的研究热点 [5]. 在众多衍生化方法中, 酯基衍生化最为常见 [8~ 10]. 因此, 研究 CT 03 酯基衍生物与蛋白的相互作用无论在磁共振 ( 包括核磁和顺磁 ) 成像方面还是在生物大分子结构研究方面都十分必要. Fig.1 Molecular structures of TAM radicals [11] [5,12~ 14] 前文报道了 CT 03 母核与牛血清白蛋白的相互作用, 但对于酯基衍生物与白蛋白之间的作用关系迄今尚未见相关报道. 本文以已报道的 CT 03 酯基衍生物 ET 03( 见图 1) 为研究对象 [15], 以牛血清白蛋白 BSA 为模型白蛋白 [16,17], 采用荧光光谱电子顺磁共振 (EPR) 波谱紫外可见吸收光谱及分子对接技术研究了 ET 03 与 BSA 之间的作用机制荧光猝灭常数及作用位点, 并结合热力学参数确定了其结合常数作收稿日期 : 网络出版日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 ( 批准号 : , ) 天津市应用基础与前沿技术研究计划项目 ( 批准号 : 15JCYBJC23700, 15JCZDJC32300) 和国家级大学生创新创业训练项目 ( 批准号 : ) 资助. 联系人简介 : 宋玉光, 女, 博士, 副教授, 主要从事氧化还原态评价与检测相关研究. E mail: songyuguang@ tmu.edu.cn 隋小芳, 女, 主任医师, 主要从事老年心血管疾病相关研究. E mail: fucongtianjiang@ 163.com

2 No.8 安鹏姣等 : 全硫取代三苯甲基 ( 自由基酯基衍生物与牛血清白蛋的白相互作用 1355 用力等, 为 TAM 自由基酯基衍生物的生物应用提供了重要的实验依据, 也为开发生物相容性更好的 TAM 类磁共振成像试剂提供了新的参考. 1 实验部分 1.1 试剂与仪器牛血清白蛋白 (BSA, 产品编号 : F2442) 购于 Sigma 试剂公司, 于 4 暗处保存, 实验当天用磷酸盐缓冲液 (PBS, 50 mmol / L, ph = 7 4) 溶解, 冰浴保存待用 ; 华法林 (Warfarin, 质量分数 98%) 购于南京罗迈美生物科技有限公司, 布洛芬 (Ibuprofen, 质量分数 98%) 购于天津希恩思生化科技有限公司, 二者均为分析纯, 分别用 NaOH 溶液 (25 mmol / L) 配制成储备液 (2 mmol / L); TAM 自由基酯基衍生物 (ET 03) 为自制, 加水稀释成 1 8 mmol / L 的储备液 ; 实验用水为超纯水 ; 其它试剂均为分析纯. EMXplus 6/ 1 型 EPR 波谱仪 ( 瑞士 Bruker 公司 ); F 4600 型荧光分光光度计 ( 日本 Hitachi 公司 ); U 3900 型紫外可见分光光度计 ( 日本 Hitachi 公司 ); MP 13 型恒温水浴槽 ( 上海一恒公司 ); FE20 型 ph 计 ( 瑞士 Mettler Toledo 公司 ). 1.2 实验过程 EPR 波谱研究室温下将相同体积的 ET 03(200 μmol / L) 和不同体积的 BSA(250 μmol / L) 用 PBS 缓冲溶液稀释, 混合均匀, 配制成 ET 03 终浓度为 20 μmol / L, BSA 终浓度为 0 ~ 80 μmol / L 的系列溶液. 用 50 μl 毛细管吸取混合样品置于 EPR 腔内, 进行 EPR 波谱扫描, 观察 ET 03 的 EPR 谱宽和谱峰高的变化. EPR 参数设置 : 调制频率 100 khz, 调制强度 0 08 G, 微波功率 0 8 ~ 1 0 mw, 扫描时间 10 s, 累加次数 10 次 EPR 竞争置换实验将浓度均为 50 μmol / L 的 ET 03 和 BSA 溶液混合, 加入位点竞争试剂 Warfarin(2 mmol / L) 或 Ibuprofen(2 mmol / L) 溶液, 使竞争试剂的终浓度分别为 0, 20, 40, 60, 100 和 120 μmol / L, ET 03 和 BSA 的终浓度为 10 μmol / L, 配制成不同浓度的 ET 03 / BSA / Warfarin 或 ET 03 / BSA / Ibuprofen 体系, 室温下分别测定 2 个体系的 EPR 谱图, 观察 ET 03 的 EPR 谱峰高的变化. EPR 参数设置 : 调制频率 100 khz, 调制强度 0 05 G, 微波功率 0 8 ~ 1 0 mw, 扫描时间 20 s, 累加次数 5 次紫外吸收光谱的测定将不同体积的 BSA 溶液 (200 μmol / L) 分别与相同体积的 ET 03 溶液混合, 使 ET 03 的终浓度为 20 μmol / L, BSA 的终浓度分别为 0, 2, 10, 30 和 60 μmol / L, 室温下在 1 0 cm 石英比色池中检测 BSA 浓度不同时 ET 03 的紫外吸收光谱. 狭缝宽度为 1 nm 荧光光谱的测定将不同体积的 ET 03 溶液 ( 200 μmol / L) 分别与相同体积的 BSA ( 200 μmol / L) 溶液混合, 使 BSA 的终浓度为 2 5 μmol / L, ET 03 的终浓度分别为 0, 1 25, 2 5, 5, 7 5, 10, 12 5, 15, 17 5 和 25 μmol / L, 室温下在 1 0 cm 石英比色池中检测不同浓度 ET 03 存在下 BSA 的荧光光谱, 并单独检测 ET 03(25 μmol / L) 的荧光强度. 激发和发射狭缝宽度均为 2 5 nm, 激发波长 280 nm, 发射光谱范围 300 ~ 500 nm. 荧光猝灭实验分别在 298, 303 和 308 K 下进行. 为避免内滤效应, 实验体系中 BSA 浓度均不超过 2 5 μmol / L [11]. 1.3 BSA 与 ET 03 的分子对接研究在蛋白质结构数据库 (http: / / / pdb / home / home.do) 中下载 BSA( PDB ID: 3V03) 的单晶结构, 去除其中的小分子和溶剂分子后作为分子对接的受体. 在 Discovery Studio 2 5 中构建 ET 03, 经结构优化后, 作为分子对接的配体. Autodock Vina [18] ( 简称 Vina) 是 Molecular Graphics 实验室开发的一款开源免费程序, 具有准确性高速度快等优点, 是目前使用较多的一种分子对接和虚拟筛选软件, 本文采用 Vina 软件研究了 ET 03 和 BSA 的分子对接. 根据前述对 ET 03 与 BSA 结合位点的分析可知, BSA 的亚结构域 ⅡA( 位点 Ⅰ) 和 ⅢA( 位点 Ⅱ) 都可以结合 ET 03, 因此分别将 Trp134 和 Trp213 吲哚基团的氮原子 (x, y, z: , , 和 , , ) 选作分子对接网格的中心 ; 为了保证 ET 03 能对接在 2 个结合位点的合适位置, 网格的大小设为 6 nm 6 nm 6 nm. 对接过程采用刚性对接方法, 其它对接参数均采用默认值. 在 Discovery Studio 2 5 中分析对接结果, 选取最低结合能

3 1356 高等学校化学学报 Vol.38 (ΔG) 的对接构象为 BSA ET 03 对接的最优模式. 2 结果与讨论 2.1 BSA 对 ET 03 电子顺磁共振波谱的影响 EPR 波谱是检测顺磁性物质最直接和最有效的方法, 被广泛应用于自旋标记物以检测生物系统微环境 ( 如温度黏度 ph 值及溶解氧等 ) 的变化. 周围环境对自由基的影响将引起自由基 EPR 谱图的变化. 本文研究对象 ET 03 是稳定 TAM 自由基 CT 03 的酯基化衍生物, 仍是自由基, 因此可以通过 ET 03 的 EPR 谱图变化来监测 BSA 对 ET 03 的运动及局部微环境的影响. 如图 2 所示, 室温及空气条件下 ET 03(20 μmol / L) 在 PBS(50 mmol / L, ph = 7 4) 缓冲溶液中具有狭窄的单线 EPR 信号, 线宽为 308 mg. 随着 BSA 溶液的逐渐加入, 其 EPR 信号线宽逐渐增宽, 同时强度减弱, 但变化均没有 CT 03 的明显. 在 BSA 加入前后其 EPR 谱图的二重积分值未发生改变 ( 数据未给出 ), 说明 BSA 与 ET 03 之间并未发生化学反应, 只是 BSA 的存在降低了 ET 03 分子的翻滚速率, 缩短了其弛豫时间. EPR 波谱的变化初步说明 BSA 与 ET 03 之间存在着相互作用. Fig.2 EPR spectra of ET 03(20 μmol / L) in the presence of various concentrations of BSA(A), EPR line width and the relative intensity( B) of ET 03 in the presence of various concentration of BSA PBS buffer(50 mmol / L, ph = 7 4). All experiments were performed at 297 K. (A) c BSA / (μmol L -1 ), a e: 0, 1 25, 5, 20, 80. (B) c(bsa) / (μmol L -1 ): 0, 2.5, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80. 为了进一步探讨 BSA 与 ET 03 的相互作用, 考察了 BSA 存在时 ET 03 紫外可见吸收光谱的变化. 结果 ( 图 3) 显示, 室温下 ET 03 的特征吸收峰位于 492 nm 处, 随着 BSA 的逐渐加入 (0 ~ 60 μmol / L), 其最大吸收强度略有增加, 但增幅并不十分明显. BSA 存在下, ET 03 紫外可见吸收光谱的变化与已报道的 CT 03 [11] 略有不同, ET 03 的最大吸收峰并未出现类似 CT 03 的明显红移现象. 这可能是 CT 03 较酯基衍生化的 ET 03 分子小, 更易与 BSA 的结构域接触, 作用力更强的缘故. Fig.3 Absorption spectra of ET 03(20 μmol / L) in the presence of various concentrations of BSA(0, 2, 10, 30, and 60 μmol / L) in PBS buffer(50 mmol / L, ph = 7 4) at 300 K (B) is the enlanged part of (A). 2.2 ET 03 和 BSA 相互作用的性质荧光光谱法是研究有机物与生物大分子相互作用的重要手段, 通过对相关热力学参数的分析可以

4 No.8 安鹏姣等 : 全硫取代三苯甲基 ( 自由基酯基衍生物与牛血清白蛋的白相互作用 1357 得到荧光猝灭机制结合作用常数结合化学计量数作用力类型及结合距离等信息 [13,19,20] ET 03 对 BSA 的荧光猝灭机制当激发波长为 280 nm 时, BSA 在 340 nm 处有强荧光发射, 而在相同条件下 ET 03 的荧光信号可忽略 ( 图 4). 随着 ET 03(0 ~ 25 μmol / L) 的加入, BSA 在 340 nm 处的荧光强度逐渐下降, 表明 ET 03 对 BSA 的色氨酸残基发色团具有猝灭效应 [21,22], 说明 ET 03 与 BSA 之间存在一定的相互作用, 这与 EPR 波谱和紫外可见光谱分析结果一致. 通常, 荧光猝灭机制可以通过 Stern Volmer 方程来定量描述 [23] : F 0 F = 1 + K sv[q] = 1 + K q τ 0 [Q] (1) 式中 : F 0 和 F 分别代表 ET 03 加入前后 BSA 的荧光强度 ; K sv 为 Stern Volmer 猝灭常数 ; [Q] 为 ET 03 的浓度 ; K q 为表观双分子猝灭过程速率常数 ; τ 0 为无 ET 03 存在时 BSA 的平均荧光寿命. 可由 F 0 / F 对 [Q] 回归曲线 ( 图 5) 的斜率求得 K q. 298 K 时, K q = (1 61±0 003) L mol -1 s -1, 远大于最大动态猝灭常数 L mol -1 s -1, 说明 ET 03 对 BSA 的荧光猝灭存在静态荧光猝灭机制. 依据静态荧光猝灭机制, 表观双分子猝灭常数 K q 应随温度的升高而降低, 但 ET 03 和 BSA 体系的 K q 并不随温度的升高而降低, 而是呈现了相反的趋势, 这又与动态荧光猝灭机制相符. 因此可认为, ET 03 对 BSA 的荧光猝灭是静态与动态同时存在的混合猝灭机制. 在药物与 BSA 的相互作用研究中常见类似的作用机制 [12,24]. Fig.4 Emission spectra of BSA ( 2 5 μmol / L) in the presence of various concentrations of ET 03 or ET 03 alone at 301 K in PBS bu ffer solution(50 mmol / L, ph = 7 4) c ET 03 ( a k ) / ( μmol L -1 ): 0, 1 25, 2 5, 5, 7 5, 10, 12 5, 15, 17 5, 25, 25(ET 03 alone). Fig.5 Stern Volmer plots of the quenching of BSA fluorescence by ET 03 at different tempera tures at ph = 7 4 According to the Stern Volmer equation, K q is calculated to be (1 61 ± 0 003) L mol -1 s -1 at 298 K, ( 1 67 ± 0 004) L mol -1 s -1 at 298 K and( 1 78± 0 005) L mol -1 s -1 at 308 K. Here Q is specifically designated as ET 03. Every point was repeated 3 times 结合常数和化学计量数 BSA 与 ET 03 结合反应的结合常数 K b 和化学计量数 n 可采用下式进行计算 [25] : lg F - F 0 = nlg[q] + lgk F b (2) 实验分别考察了 298, 303 和 308 K 下 ET 03 对 BSA 荧光的影响, 得到各温度下的 K b 和 n 值. 计算结果 ( 表 1) 表明, 在 BSA 和 ET 03 之间存在较强的结合力, 且随着温度的升高而增大. 但与母核 CT 03 相比, 常温下 ET 03 与 BSA 的结合常数 ( Table 1 Binding constants and stoichiometry for the interaction of ET 03 with BSA at different temperatures L / mol) 较 CT 03 与 BSA 间的结合常数 ( T / K K b / (L mol -1 ) n R L / mol) 小近 1 个数量级, 与紫外可见光谱实验结 ± 果相符. 由式 (2) 还得到了 ET 03 与 BSA 作用的化 ± 学计量数 n 值. 由表 1 可见, 3 个温度下的 n 值均接 ±

5 1358 高等学校化学学报 Vol.38 近 1, 说明 ET 03 与 BSA 的结合基本是 1 1 的比例, 这与 CT 03 的相关性质很接近, 说明酯基衍生化对母核结构影响不大热力学参数和作用力类型通常, 有机小分子与生物大分子之间的结合反应通过 4 种力, 即疏水作用力静电作用力氢键和范德华力. 由 Van s Hoff 公式可以计算反应的焓变 ΔH 和熵变 ΔS, 根据其符号和大小可判断结合反应的作用力类型 : 即当 ΔH>0 且 ΔS>0 时为疏水作用力 ; ΔH<0, ΔS<0 时为氢键和范德华力 ; ΔH<0, ΔS>0 时为静电作用力 [26]. Van s Hoff 公式如下 : lnk b = - ΔH RT + ΔS R (3) 反应的吉布斯自由能 ΔG 可由下式求得 : ΔG = ΔH - TΔS = - RTlnK b (4) 式中 : R 为气体摩尔常数 ; K b 为结合常数. 通过计算得到 298, 303 和 308 K 下该反应的 ΔG 分别为 -25 2, 和 kj / mol, 均小于 0, 表明在考察温度范围内 ET 03 与 BSA 之间的相互作用为自发反应 ; 而 ΔH 和 ΔS 均为正值 ( ΔH = 75 7 kj / mol, ΔS = J mol -1 K -1, R = ), 则说明 ET 03 与 BSA 之间主要为疏水作用力结合位点 BSA 结构上的亚结构域 ⅡA( 位点 Ⅰ) 和 ⅢA( 位点 Ⅱ) 是大多数药物分子结合的位点 [27,28]. 通过有机物与相应的竞争试剂竞争蛋白结合部位, 是确定蛋白结合位点的经典方法 [29,30]. 本文采用 Warfarin 和 Ibuprofen 分别作为位点 Ⅰ 和位点 Ⅱ 的竞争试剂, 通过 EPR 波谱监测竞争试剂对 ET 03 / BSA 体系 EPR 信号的影响来判断 ET 03 在 BSA 上的结合位点. 由图 1 可知, ET 03 与 BSA 结合后其 EPR 信号强度会明显降低. 竞争试剂的加入将使 ET 03 / BSA 复合体中被结合的 ET 03 得以释放, 从而再现自由 ET 03 的 EPR 信号. 竞争试剂对 ET 03 / BSA 复合体的影响越大, 说明 ET 03 在 BSA 上的结合位点与该竞争试剂的结合位点越类似. 实验结果表明, 加入 Warfarin 和 Ibuprofen 后 ET 03 的 EPR 信号均有不同程度的恢复, 但 Warfarin 较 Ibu profen 作用更明显 ( 图 6). 这说明 ET 03 与 BSA 的亚结构域 ⅡA 和 ⅢA 2 个结合位点均具有一定的结合作用, 但以亚结构域 ⅡA( 位点 Ⅰ) 为主. 已有文 [31,32] 献证实, 小分子与 BSA 位点 Ⅰ 的结合力主要 Fig. 6 EPR competition displacement experiments were performed in PBS buffer solution ( 50 mmol / L, ph = 7 4) c( Warfarin) = c( Ibuprofen) = 0, 20, 40, 60, 100 and 120 μmol / L, c(bsa)= c(et 03)= 10 μmol / L. 是疏水作用力, 与位点 Ⅱ 的结合力则包括疏水作用力氢键以及静电作用力. 本研究说明 ET 03 与 BSA 主要通过疏水作用力结合于位点 Ⅰ 和位点 Ⅱ, 这与前面由热力学参数判断的结合力类型完全相符, 也与紫外可见光谱实验结果一致 BSA 与 ET 03 之间的能量传递根据 Förster 的偶极偶极非辐射能量转移理论 [33,34], 当供能体能发射荧光, 供能体的荧光发射光谱与受能体的吸收光谱有足够的重叠, 供能体与受能体足够靠近, 最大距离不超过 8 nm 时, 被激发的分子将会与邻近分子发生非辐射能量转移现象, 导致荧光猝灭. 下式可用来判断 ET 03 与 BSA 之间是否存在能量传递. E = 1 - F 6 0 F = R0 R 6 + (5) 0 r6 式中 : r 为供受体之间的距离 ; R 0 代表 E = 50% 时的临界距离, 可由下式求得 : R 6 0 = κ 2 N -4 φj (6) J = F(λ)ε(λ)λ 4 Δλ F(λ)Δλ (7)

No.8 安鹏姣等 : 全硫取代三苯甲基 ( 自由基酯基衍生物与牛血清白蛋的白相互作用 1359 式中 : κ 2 为偶极空间取向因子, 本实验条件下取值为 2 / 3 [33,35,36] ; N 为介质折射指数, 取值为 1 36; φ = 0 15; J 为 BSA 的荧光发射光谱与 ET 03 紫外吸收光谱的重叠积分 ( 图 7), 可由式 (7) 矩形积分求得.

6 No.8 安鹏姣等 : 全硫取代三苯甲基 ( 自由基酯基衍生物与牛血清白蛋的白相互作用 1359 式中 : κ 2 为偶极空间取向因子, 本实验条件下取值为 2 / 3 [33,35,36] ; N 为介质折射指数, 取值为 1 36; φ = 0 15; J 为 BSA 的荧光发射光谱与 ET 03 紫外吸收光谱的重叠积分 ( 图 7), 可由式 (7) 矩形积分求得. 通过计算可以得出 J = cm 3 L mol -1, R 0 = nm, E = , r = 3 27 nm. 0 5R 0 <r<1 5R 0, 表明 BSA 与 ET 03 之间存在非辐射能量转移的可能性极大, 这也可能是 ET 03 猝灭 BSA 荧光的另一个因素. Fig.7 Spectra overlay of ET 03 absorption( a) and 2.3 ET 03 和 BSA 的分子对接研究 BSA fluorescence( b) Autodock Vina 的原理是在给定的空间范围内 c(bsa)= c(et 03)= 2 5 μmol / L. 寻找配体与受体的最佳结合构象, 显示作用靶点并给出相应的结合自由能数值作为结合稳定程度的指标. 结合能越高, 结合作用越强, 对接后的复合物越稳定. 模拟所得 BSA 与 ET 03 的分子对接优势构象见图 8. 图 8(A) 和 (C) 显示, ET 03 被包裹在 BSA 的亚结构域 ⅡA( 位点 Ⅰ) 中, 与距离 0 5 nm 内的 Pro110, Lys114, Leu189, Val423 和 Ile522 基团形成疏水作用力. 同时, ET 03 通过与 Glu424(0 416 nm) 的 π 阴离子作用, 以及分子内 3 个羧基与 Asp108 (0 286 nm), Leu115(0 298 nm), ARG458(0 294 nm) 和 LYS523(0 290 nm) 基团形成的 4 个氢键固定在空穴中. 由图 8(B) 和 (D) 可见, ET 03 插入 BSA 的亚结构域 ⅢA( 位点 Ⅱ) 中, 同样通过疏水作用力与距离 0 5 nm 内的 Lys221, Lys294, Lys439, Pro446 和 Cys447 基团作用. 此空穴中 ET 03 的固定还通过与 Glu443(0 417 nm) 的 π 阴离子作用及 Gln220(0 318 nm), Glu291(0 293 nm), Arg458(0 294 nm), Tyr340(0 306 nm) 和 Val342(0 302 nm) 与 ET 03 分子内 2 个羧基形成的 4 个氢键, 空余的第 3 个羧基朝向亚结构域 ⅢA 外. Fig.8 Tri dimensional structures of the BSA ET 03 complex and interacting forces of ET 03 with BSA Tri dimensional structures of the BSA ET 03 complexⅠ ( A) and BSA ET 03 complex Ⅱ ( B) with the lowest binding energy by molecular docking, color green, blue and red represent BSA, Trp and ET 03, respectively. Interacting forces of ET 03 with BSA site Ⅰ( C) and site Ⅱ( D), pink, brown and green dotted lines express hydrophobic interaction, π anion interaction and hydrogen bond ing interaction, respectively. 此外, 分子对接研究结果显示 ET 03 与 Trp 134 中心 ( 位点 Ⅰ) 和 Trp 213 中心 ( 位点 Ⅱ) 的结合能分别为和 kj / mol, 因此 ET 03 与位点 Ⅰ 的结合作用更强, 其与 BSA 的 2 个结合位点间主要作用力均为疏水作用力, 进一步证实了热力学参数和结合位点对作用力类型的研究结果. 同时, 参

7 1360 高等学校化学学报 Vol.38 照热力学计算得出 ET 03 与 BSA 相互作用的化学计量数 n 约为 1, 即 1 个 BSA 分子只与 1 个 ET 03 分子结合, 可能结合在位点 Ⅰ 或位点 Ⅱ, 但很难发生 2 个 ET 03 同时与 1 个 BSA 的 2 个位点相结合的现象. 3 结论通过荧光光谱 EPR 波谱紫外可见光谱和分子对接技术对 TAM 自由基 CT 03 的酯基衍生物 ET 03 和 BSA 之间发生的相互作用进行了研究. 结果表明, ET 03 可与 BSA 自发结合, 相比于 CT 03, ET 03 分子的疏水性略弱, 因此相同条件下与 BSA 的结合作用力也略小, 所以加入 BSA 后 ET 03 的 EPR 信号线宽增加幅度降低, ET 03 的紫外可见吸收光谱在 BSA 存在下并未发生明显红移现象且结合速率常数略小. 但与 CT 03 相似的是, ET 03 也主要通过疏水作用力和非辐射能量转移猝灭 BSA 的荧光, 其荧光猝灭机制也是静态荧光猝灭机制和动态荧光猝灭相结合的混合猝灭机制. 与 CT 03 和 BSA 的作用位点略有不同是, ET 03 与 BSA 的 2 个结合位点均可通过疏水作用力发生结合作用, 但与结合位点 Ⅰ 作用更强, 而 CT 03 只作用于 BSA 的结合位点 Ⅰ. 参考文献 [ 1 ] Gomberg M., J. Am. Chem. Soc., 1900, 22(11), [ 2 ] Ardenkjaer Larsen J. H., Laursen I., Leunbach I., Ehnholm G., Wistrand L. G., Petersson J. S., Golman K., J. Magn. Reson., 1998, 133(133), 1 12 [ 3 ] Dhimitruka I., Velayutham M., Bobko A. A., Khramtsov V. V., Villamena F. A., Hadad C. M., Zweier J. L., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2007, 17(24), [ 4 ] Reddy T. J., Iwama T., Halpern H. J., Rawal V. H., J. Org. Chem., 2002, 67(14), [ 5 ] Liu Y., Villamena F. A., Sun J., Wang T. Y., Zweier J. L., Free Radic. Biol. Med., 2009, 46(7), [ 6 ] Liu Y., Song Y.,de Pascali F., Liu X., Villamena F. A., Zweier J. L., Free Radic. Biol. Med., 2012, 53(11), [ 7 ] Bobko A. A., Dhimitruka I., Zweier J. L., Khramtsov V. V., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(23), [ 8 ] Kao J. P., Barth E. D., Burks S. R., Smithback P., Mailer C., Ahn K. H., Halpern H. J., Rosen G. M., Magn. Reson. Med., 2007, 58 (4), [ 9 ] Miyake M., Shen J., Liu S., Shi H., Liu W., Yuan Z., Pritchard A., Kao J. P., Liu K. J., Rosen G. M., J. Pharmacol. Exp. Ther., 2006, 318(3), [10] Shen J., Liu S., Miyake M., Liu W., Pritchard A., Kao J. P., Rosen G. M., Tong Y., Liu K. J., Magn. Reson. Med., 2006, 55(6), [11] Song Y., Liu Y., Liu W., Villamena F. A., Zweier J. L., RSC Adv., 2014, 4(88), [12] Liu Y., Villamena F. A., Sun J., Xu Y., Dhimitruka I., Zweier J. L., J. Org. Chem., 2008, 73(4), [13] Song Y., Liu Y., Hemann C., Villamena F. A., Zweier J. L., J. Org. Chem., 2013, 78(4), [14] Xia S., Villamena F. A., Hadad C. M., Kuppusamy P., Li Y., Zhu H., Zweier J. L., J. Org. Chem., 2006, 71(19), [15] Dhimitruka I., Grigorieva O., Zweier J. L., Khramtsov V. V., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2010, 20(13), [16] Tian F. F., Jiang F. L., Han X. L., Xiang C., Ge Y. S., Li J. H., Zhang Y., Li R., Ding X. L., Liu Y., J. Phys. Chem. B, 2010, 114 (46), [17] Liu Y., Mei P., Zhang Y. Z., Sun X. H., Liu Y., Biol. Trace Elem. Res., 2010, 138(1 3), [18] Trott O., Olson A. J., J. Comput. Chem., 2010, 31(2), [19] Zhao X., Liu R., Chi Z., Teng Y., Qin P., J. Phys. Chem. B, 2010, 114(16), [20] Shi Y., Liu H., Xu M., Li Z., Xie G., Huang L., Zeng Z., Spectrochim. Acta A, 2012, 87(4), [21] Paul B. K., Samanta A., Guchhait N., J. Phys. Chem. B, 2010, 114(18), [22] Bourassa P., Kanakis C. D., Tarantilis P., Pollissiou M. G., Tajmir Riahi H. A., J. Phys. Chem. B, 2010, 114(9), [23] Xu J. G., Wang Z. B., Fluorescence Analytical Methods, Science Press, Beijing, 2006, 67( 许金钩, 王尊本. 荧光分析法, 北京 : 科学出版社, 2006, 67) [24] Zhang Y., Li J. H., Ge Y. S., Liu X. R., Jiang F. L., Liu Y., J. Fluoresc., 2011, 21(2), [25] Marty A., Boiret M., Deumie M., J. Chem. Educ., 1986, 63(4), [26] Ross P. D., Subramanian S., Biochem., 1981, 20, [27] Kragh Hansen U., Biochem. J., 1985, 225(3),

8 No.8 安鹏姣等 : 全硫取代三苯甲基 ( 自由基酯基衍生物与牛血清白蛋的白相互作用 1361 [28] Fehske K. J., Schläfer U., Wollert U., Müller W. E., Mol. Pharmacol., 1982, 21(2), [29] Zhang J. X., Yin Z. N., Wu W., Wang Z. X., He R., Wu Z. X., Chem. Res. Chinese Universities, 2012, 28(6), [30] Dong L., Yi Z. S., Wu Z. W., Wang H. Y., Zhang A. X., Chem. J. Chinese Universities, 2015, 36(3), ( 董露, 易忠胜, 伍智蔚, 王海洋, 张爱茜. 高等学校化学学报, 2015, 36(3), ) [31] Jisha V. S., Arun K. T., Hariharan M., Ramaiah D., J. Am. Chem. Soc., 2006, 128(18), [32] Sudlow G., Birkett D. J., Wade D. N., Mol. Pharmacol., 1976, 12(6), [33] Lakowicz J. R., Masters B.R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd Edition, Springer US, New York, 2006, [34] Sklar L. A., Hudson B. S., Simoni R. D., Biochemistry, 1977, 16(23), [35] Yang S. L., Song P., She W. J., Yang T. L., Chem. J. Chinese Universities, 2015, 36(7), ( 杨水兰, 宋盼, 佘文洁, 杨天林. 高等学校化学学报, 2015, 36(7), ) [36] Du C. R., Luo X., Wei J. R., He T. T., Zheng X. Y., Lin C. W., Chem. Res. Chinese Universities, 2013, 29(5), Characterization of the Interaction Between Esterified TAM Radical and Bovine Serum Albumin AN Pengjiao 1, YU Nannan 1, SUN Ruisheng 1, SUI Xiaofang 2, SONG Yuguang 1 (1. Tianjin Key Laboratory on Technologies Enabling Development of Clinical Therapeutics and Diagnostics, School of Pharmacy, Tianjin Medical University, Tianjin , China; 2. First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi , China) Abstract Fully substituted tetrathiatriarylmethyl( TAM) radicals and their derivatives are ideal electron para magnetic resonance( EPR) spectroscopy / imaging probe and have been received much concern in NMR con trast agent or spin traps fields. This work demonstrated that an esterified TAM radical( ET 03) bound to bovine serum albumin( BSA) in aqueous solution with fluorescence, electron paramagnetic resonance( EPR) spec troscopy, UV Vis spectroscopy and molecular docking. The results showed that ET 03 spontaneously bound to BSA. The binding between ET 03 and BSA was driven by a hydrophobic interaction and the binding site was mainly determined to be the sub domain ⅡA(Sudlow s site Ⅰ) and the sub domain ⅢA(Sudlow s site Ⅱ). The fluorescence quenching of BSA by ET 03 was a mixture of static and dynamic mechanism with energy transfer probably. This protein binding of the esterified TAM probe to albumin can be used to study the struc ture and function of albumin and also must be considered for its use as an in vivo imaging agent or spin label. Keywords Tetrathiatriarylmethyl radical; Ester derivative; Bovine serum albumin; Fluorescent quenching; Electron paramagnetic resonance( EPR) spectroscopy (Ed.: P, H, F, K) Supported by the National Natural Science Foundation of China( Nos , ), the Tianjin Research Program of Application Foundation and Advanced Technology, China( Nos.15JCYBJC23700, 15JCZDJC32300) and the National Undergraduate Training Programs for In novation and Entrepreneurship, China( No ).

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<D2BDC1C6BDA1BFB5CDB6C8DAD7CAB8DFB7E5C2DBCCB3B2CEBBE1C3FBB5A52E786C7378> 参会人员名单 Last Name 姓名公司 Tel Fax Bai 柏煜康复之家 8610 8761 4189 8610 8761 4189 Bai 白威久禧道和股权投资管理 ( 天津 ) 有限公司 8610 6506 7108 8610 6506 7108 Bao 包景明通用技术集团投资管理有限公司 8610