, Vol. 31, No. 01 食品科学基础研究柳全文 1, 徐慧 1, 李桂华 1, *, 张婷 2, 乔青安 1 (1. 鲁东大学化学与材料科学学院, 山东烟台 ;2. 鲁东大学生命科学学院, 山东烟台 ) 采用荧光光谱法研究咖啡酸与牛血清白蛋白 (

Size: px

Start display at page:

Download ", Vol. 31, No. 01 食品科学基础研究柳全文 1, 徐慧 1, 李桂华 1, *, 张婷 2, 乔青安 1 (1. 鲁东大学化学与材料科学学院, 山东烟台 ;2. 鲁东大学生命科学学院, 山东烟台 ) 采用荧光光谱法研究咖啡酸与牛血清白蛋白 ("

屏刁
5 years ago
Views:

1 24 柳全文, 徐慧, 李桂华, *, 张婷 2, 乔青安 (. 鲁东大学化学与材料科学学院, 山东烟台 26425;2. 鲁东大学生命科学学院, 山东烟台 26425) 采用荧光光谱法研究咖啡酸与牛血清白蛋白 (BSA) 结合反应实验表明, 咖啡酸对 BSA 的荧光猝灭为静态猝灭二者之间的作用力为静电引力和疏水作用力在离子强度符合生理条件的情况下, 以疏水作用力为主在溶液中二者以物质的量浓度比 : 结合, 并求出二者的结合常数以华法林 (Wrfrin) 和布洛芬 (Ibuprofen) 为标记物, 利用荧光光谱法确定了咖啡酸在 BSA 的结合位置为 site I 根据 Forster 非辐射能量转移理论, 求出了给体 (BSA) 与受体 ( 咖啡酸 ) 间距离 (r) 为 3.64nm 另外, 利用同步荧光法考察了咖啡酸对牛血清白蛋白构象的影响咖啡酸 ; 牛血清白蛋白 ; 相互作用 ; 竞争结合实验 Insight into Interction of Cffeic Acid with Bovine Serum Albumin LIU Qun-wen,XU Hui,LI Gui-hu, *,ZHANG Ting 2,QIAO Qing-n (. College of Chemistry nd Mterils Science, Ludong University, Ynti 26425, Chin; 2. College of Life Science, Ludong University, Ynti 26425, Chin) Abstrct :The binding rection of cffeic cid with bovine serum lbumin (BSA) ws studied using fluorescence spectroscopy. Cffeic cid quenched the fluorescence of BSA through sttic process. The primry binding pttern between cffeic cid nd BSA included electrosttic nd hydrophobic interction, nd the ltter ws identified to be the min force under physiologicl condition. It ws found tht cffeic cid ws locted ner the Tyr residue region of site I in BSA by competing binding experiment using wrfrin nd ibuprofen s site mrkers by fluorescence spectr. The distnce between the donor (BSA) nd receptor (cffeic cid), r, ws obtined to be 3.64 nm ccording to Forster's non-rditive energy trnsfer theory. In ddition, the effect of cffeic cid on the conformtion of BSA ws nlyzed using synchronous fluorescence spectroscopy. Key words:cffeic cid;bovine serum lbumin;interction;competitive binding experiment 中图分类号 :Q946.8 文献标识码 :A 文章编号 :2-663()-24-5 血清白蛋白具有贮运内源代谢产物和外源性小分子等重要生理功能药物和食物中的化学成分进入血液后, 首先通过血浆的结合和贮存, 然后在体内进行运输因此, 研究药物和食品中次级代谢产物与血清白蛋白相互作用, 有助于了解药物分子在体内的运输以及代谢机制, 对阐明药物的作用机制具有重要的理论意义荧光光谱和紫外 - 可见分子光谱是研究药物与蛋白 [] 质相互作用的重要手段咖啡酸 (cffeic cid), 化学名为 3,4 - 二羟基肉桂酸, 是一种天然存在的酚类化合物, 广泛存在于蔬菜水果咖啡茶橄榄油和酒中, 尤其在红酒中含量 [2] 丰富, 目前的研究主要集中在其生物活性研究杨曼 [3] 曼等已对咖啡酸的衍生物氯原酸阿魏酸等与白蛋白的相互作用进行了前期研究, 但未见咖啡酸与牛血清白蛋白的相互作用的研究报道本研究拟利用荧光光谱法和紫外 - 可见光谱法研究模拟生理条件下咖啡酸与牛血清白蛋白 (BSA) 的相互作用利用咖啡酸对 BSA 内在荧光的猝灭, 分别求出二者之间结合反应的猝灭常数和结合常数, 由 Forster 非辐射能量转移理论确定咖啡酸与 BSA 中色氨酸残基间的收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金项目 (2633) 作者简介 : 柳全文 (974 ), 男, 副教授, 博士, 主要从事药物化学及分析化学研究 E-mil:qwliu@yhoo.com.cn * 通信作者 : 李桂华 (966 ), 女, 副教授, 主要从事分析化学研究 E-mil:lgh2985@26.com

2 基础研究食品科学, Vol. 3, No. 25 结合距离, 并根据热力学参数和离子强度的影响解释它们之间的主要作用力另外, 拟进一步以 Wrfrin 和 Ibuprofen 为结合位点标记物讨论咖啡酸在 BSA 上的键合位置, 同时结合同步荧光技术讨论咖啡酸对 BSA 构象的影响旨在为进一步探讨咖啡酸在体内的运输代谢作用机理提供参考材料与方法. 试剂与仪器牛血清白蛋白 (bovine serum lbumin,bsa, 上海埃彼化学试剂公司 ), 以二次蒸馏水配制, 其储备液于 4 保存于暗处咖啡酸 ( 纯度 > 98%) 中国药品生物制品检定所 ; 华法林 (Wrfrin) 布洛芬(Ibuprofen) Sigm 公司 Tris-HCl 缓冲溶液 (ph7.4,.5mol/l,.mol/l NCl 调节离子强度 ); 实验用水均为二次亚沸蒸馏水 ( 电阻率 8.2MΩ cm), 其他试剂均为分析纯 LS-55 型荧光光度计 PE 公司 ;UV-255PC 型紫外 - 可见分光光度计和电子天平日本岛津公司 ;HH-S 恒温水浴锅金坛市恒丰仪器厂 ;SYZ-B 型石英亚沸高纯水蒸馏器金坛市晶玻试验仪器厂.2 方法荧光光谱测定 : 依次移取一定量的 NCl 溶液牛血清白蛋白溶液和咖啡酸溶液于 cm 石英池中 ( 溶液体积总和为 3.5mL), 以 Tris-HCl 缓冲溶液定容以 28nm 为激发波长 (λex), 狭缝宽 7.nm, 扫描 3~5nm 范围内的荧光光谱以微量注射器逐次加入不同体积的咖啡酸储备液 ( 累加体积 < 35μL), 反应时间为 5min 以 28nm/ 335nm 为激发波长 / 发射波长 (λex/λem), 测定不同温度下体系的, 所得实验数据用于猝灭常数和结合常数等的计算另外分别以 Wrfrin 和 Ibuprofen 为结合位点标记物, 使之与 BSA 的摩尔比为 :, 测定咖啡酸对 BSA 的结合常数, 来讨论标记物加入后的影响和具体的结合位点同步荧光实验 :294K 条件下, 移取一定量的 NCl 溶液和 BSA 储备液适量的 Tris-HCl 缓冲溶液于 cm 比色皿中,CBSA=2.5-7 mol/l,λex=28nm, 狭缝宽度为 7.nm, 扫描速度为 :nm/min, 以 Δλ=5nm, Δλ=6nm, 记录 255~32nm 的荧光光谱, 然后在该比色皿中用移液枪逐次加入 3.5μL 咖啡酸, 使得咖啡酸浓度不断增大, 分别测其同步荧光光谱 2 结果与分析 2. 咖啡酸与 BSA 的结合反应 BSA 分子是内源性荧光物质, 在 28nm 激发波长下,BSA 的最大发射波长是 335nm, 在实验条件下保持 BSA 浓度不变, 随着咖啡酸浓度的不断增加, 对 BSA 的荧光猝别效应见图可以看出, 随着咖啡酸浓度的增加,BSA 在 335nm 波长处的内源荧光发射峰强度明显减弱, 峰形基本保持不变, 但最大发射波长发生明显红移, 从 335nm 紫移至 347nm, 同时, 在 429nm 波长处出现了咖啡酸的荧光发射峰, 表明咖啡酸与 BSA 之间产生相互作用, 而且发生了能量转移等发射点的存在 (382nm) 表明可能为静态猝灭 λex = 28nm;pH7.4;CNCl =.mol/l;t=294k; C 咖啡酸 (~): ( -6 mol/l) 图 294K 条件下咖啡酸对 BSA 的荧光猝灭效应 Fig. Fluorescence quenching effect of cffeic cid on fluorescence spectr of BSA 其荧光猝灭符合下式 [4] : F = +KqτCq = +KsvCq () F 式中 :F F 分别表示猝灭剂不存在和存在时蛋白质的 ;C q 为猝灭剂浓度 ;K q 为双分子表观猝灭速率常数 ;τ 蛋白荧光寿命, 对于生物大分子约为 -8 s [5] ;K sv 为猝灭常数 F/F K 3K 38K 35K C 咖啡酸 /( -5 mol/l) 图 2 不同温度下咖啡酸猝灭 BSA 的 Stern-Volmer 图 Fig. 2 Stern-Volmer plots of BSA quenched by cffeic cid t different tempertures 图 2 显示了不同温度下咖啡酸猝灭 BSA 的 Stern- Volmer 方程图, 根据 Stern-Volmer 方程, 分别求出了不同温度下猝灭速率常数 K q 的值 ( 表 ) 由表可知, 随着温度的升高, 咖啡酸对 BSA 的荧光猝灭常数 Kq 呈减小趋势, 且远大于各种猝灭剂对生

3 26 物大分子的最大扩散猝灭常数 2 L/mol s [6] 说明咖啡酸对 BSA 荧光的猝灭过程为静态猝灭表不同温度下咖啡酸对 BSA 的猝灭常数 Tble Dynmic quenching constnts of cffeic cid with BSA t different tempertures 温度 /K KSV/(L/mol) Kq/(L/mol s) 相关系数结合常数及结合位点数的计算从以上讨论可知咖啡酸与 BSA 的猝灭作用属于静态猝灭, 假设一个 BSA 分子有 n 个相同且独立的结合位点可与咖啡酸结合, 符合下列方程 : F - F lg =lgka+nlgc 咖啡酸 (2) F 式中 :K A 为咖啡酸与 BSA 的结合常数 ;C 咖啡酸为咖啡酸的物质的量浓度在 ph 值为 7.4 的条件下, 以 lg(f - F)/F 对 lgc 咖啡酸作图可得一组直线 ( 图 3), 由直线斜率和截距可以求出咖啡酸与 BSA 相互作用的结合常数和结合位点数 ( 表 2) lg((f/f)/f) K 3K 38K 35K lgc 咖啡酸图 3 咖啡酸对 BSA 荧光猝灭的双对数图 Fig.3 Plot of lg((f-f)/f) vs. lg t different tempertures 表 2 咖啡酸与 BSA 的结合常数 Tble 2 Binding prmeters of cffeic cid with BSA 温度 /K 结合常数 /(L/mol) 结合位点数从结合常数的数值可以看出二者之间有较强的结合作用, 说明咖啡酸在体内能被血清白蛋白转运平均结合位点数为.99, 可以看出 mol BSA 约与 mol 咖啡酸分子结合 2.3 结合距离的计算根据 Foster 非辐射能量转移原理 : 若供体的荧光发射光谱与受体的吸收光谱有足够的重叠, 且供体与受体之间的距离不超过 7nm 时, 将会发生非辐射能量转移现 [7] 象, 从而使荧光体荧光猝灭 A.3.2. b 3 5 CBSA:C 咖啡酸 =: 图 4 BSA 荧光光谱 () 与咖啡酸紫外光谱 (b) 重叠图 Fig.4 Overlp of fluorescence emission spectrum of BSA () with bsorption spectrum of cffeic cid (b) t 294 K 图 4 是 BSA 的荧光光谱与咖啡酸的紫外吸收光谱的重叠图谱, 能量转移效率 (E) 与供体 - 受体间距离 r 以及临界能量转移距离 R 之间的关系为 : F R 6 E=- = (3) F R 6 +r 6 式中 :F 为 BSA 和咖啡酸浓度比为 : 时 BSA 的 ;F 为与咖啡酸作用前 BSA 的 ;R 为 E = 5% 时的临界距离 R 6 = k 2 N -4 φj (4) 式中 :k 2 为偶极空间取向因子 ( 取蛋白质 - 药物各向随机分布的平均值 k 2 = 2/3);N 为介 K 质的折射指数 ( 取水和有机物的平均值 N =.36);φ 为供体 (BSA) 的荧光量子产率 ;J 为供体 (BSA) 荧光光谱与受体 ( 咖啡酸 ) 吸收光谱的重叠积分 Fλελλ 4 Δλ J= (5) FλΔλ 式中 :Fλ 为荧光供体 (BSA) 在波长 λ 处的,ελ 为受体 ( 药物分子 ) 在波长 λ 处的摩尔吸光系数将图 4 中阴影部分由 (5) 式计算得 :J= cm 3 L/mol; 将上述数值代入式 (3) 和 (4), 求得 :E =.468;R = 3.67nm,r= 3.64nm,.5R < r <.5R, 表明 BSA 与药物小分子之间的能量转移效率较大, 由计算结果知咖啡酸与 BSA 荧光性氨基酸残基间的空间距离小于 7nm, 因此 BSA 与咖啡酸之间可以发生能量转移, 使 BSA 荧光猝灭, 据此推测非辐射能量转移与静态猝灭共同导致了 BSA 荧光猝灭 2.4 热力学函数计算药物与蛋白质间的作用力属于分子间的弱相互作用, 包括氢键范德华力静电引力和疏水力根 6

4 基础研究食品科学, Vol. 3, No. 27 据反应前后热力学焓变 ΔH 和熵变 ΔS 的相对大小, 可以判断药物与蛋白质之间的主要作用力类型在温度变化不大时, 反应的焓变 ΔH 可以看作一个常量, 根据公式 : ΔH ΔS lnka=- + (6) RT R ΔG =-RTlnKA=ΔH-TΔS (7) 可求得生理条件下, 咖啡酸与 BSA 的热力学参数 ΔH ΔS ΔG, 其结果列于表 3 中表 3 咖啡酸与 BSA 结合的热力学参数 Tble 3 Thermodynmic binding prmeters for cffeic cid with BSA 温度 /K ΔH/(kJ/mol) ΔG/(kJ/mol) ΔS/(J/(mol K)) 从表 3 的数据可知,ΔG < 反应是一个自发进行过程 ΔH ΔS 都大于, 所以在生理条件下, 咖 [8] 啡酸与 BSA 之间为疏水作用力 2.5 离子强度的影响以上实验是在保持 NCl 浓度为.mol/L 的条件下进行的, 并没有充分考虑 NCl 浓度变化后对二者相互作用的影响因此, 为深入探讨离子强度对咖啡酸与 BSA 相互作用的影响, 改变溶液的离子强度, 发现咖啡酸与 BSA 的结合常数发生了显著的改变当 NCl 的浓度分别为 mol/L 时, 二者的结合常数分别为 L/mol 实验结果表明: 随离子强度增大, 咖啡酸与 BSA 的结合作用减弱说明二者之间也存在较强的静电引力作用当 NCl 浓度达到.mol/L 时, 结合常数基本保持恒定因此本实验选择.mol/L NCl 调节离子强度这个浓度基本符合生理条件下血液的离子强度 ( 生理盐水为.9% NCl, 也即.5mol/L 左右 ) 结合热力学函数的结果, 可以认为咖啡酸与 BSA 之间主要存在两种作用力, 即静电引力和疏水作用力在生理条件下, 由于体液中离子强度的影响, 基本消除了静电引力作用, 所以二者之间作用力主要表现为疏水作用力 2.6 咖啡酸对 BSA 构象的影响药物分子与蛋白质结合有可能会改变蛋白质的构象, 利用同步荧光光谱技术可以了解药物分子对蛋白质构象的影响, 即通过选择合适的波长差可以将在普通荧光光谱上相互重叠的荧光峰分开, 固定 Δλ=5nm 和 Δλ=6nm 所作出的同步荧光光谱分别表现出酪氨酸残 [9] 基和色氨酸残基的光谱特性从图 5 同步荧光实验结果可以看出, 色氨酸残基和酪氨酸残基的都随着咖啡酸浓度的增加而不断下降, 可以说明咖啡酸对 BSA 荧光有猝灭作用, 色氨酸残基荧光峰的最大发射波长随咖啡酸浓度的增加发生了红移, 由 276nm 移至 279nm, 而酪氨酸残基荧光峰的最大发射波长始终保持在 285nm 处, 说明二者的结合影响 BSA 的构象, 且主要影响 BSA 中色氨酸残基的微环境 2.7 咖啡酸在 BSA 分子上的结合位置的确定已知 BSA 主要有两个药物分子结合位点, 即 site Ⅰ 和 site Ⅱ, 选择 Wrfrin 和 Ibuprofen 分别作为 site Ⅰ [] 和 site Ⅱ 位的标记药物进行竞争结合实验根据文献 [] 的方法, 在温度 294K 下, 首先使 BSA 与标记物的物质的量浓度比固定在 :, 然后用咖啡酸来猝灭 BSA 的荧光利用公式 (2) 计算二者的结合常数结果表明, 在 Wrfrin 和 Ibuprofen 存在的条件下, 二者的结合常数分别为.8 5 L/mol 和.9 5 L/mol, 说明在 Wrfrin 存在的条件下, 咖啡酸与 BSA 的结合常数明显减小, 而 Ibuprofen 的存在并不影响二者的结合常数, 因此咖啡酸与 Wrfrin 竞争性结合 BSA 上同一位点, 而与 Ibuprofen 不发生竞争性结合所以, 咖啡酸在 BSA 分子的结合位点与 Wrfrin 的结合位点是一致的, 结合在 site Ⅰ 3 结论 A g B g A. Δλ= 5nm;B. Δλ=6nm;T=294K;pH7.4 图 5 BSA 同步荧光光谱图 Fig.5 Synchronous fluorescence spectr of BSA 本实验以荧光光谱技术为主对模拟生理条件下咖啡

5 28 酸与牛血清白蛋白的相互作用进行了研究研究发现, 咖啡酸与血清白蛋白有强的结合, 结合位置距色氨酸残基的距离 (r ) 为 3.64nm, 以已知结合位置的标记物进行竞争结合实验确定了咖啡酸在 BSA 上的结合位置为 site I 实验结果为阐明咖啡酸在生物体内的生物学效应等提供重要信息参考文献 : [] 顾海峰, 梁晋鄂, 李春美, 等. 柿子单宁对牛血清白蛋白的荧光猝灭作用研究 [J]. 食品科学, 8, 29(6): 4-7. [2] ZHANG L, ZHANG W P, CHEN K D, et l. Cffeic cid ttenutes neuronl dmge, strogliosis nd glil scr formtion in mouse brin with cryoinjury[j]. Life Sci, 7, 8(6): [3] 杨曼曼, 杨频, 张立伟. 荧光法研究咖啡酸类药物与白蛋白的作用 [J]. 科学通报, 994, 39(): [4] LAKOWICZ J R. Principles of fluorescence spectroscopy[m]. 3rd ed. New York: Springer, 6. [5] LAKONICA J R, WEBER G. Quenching of fluorescence byoxygen. Probe for structurl fluctutionsin mcromolecules[j]. Biochemistry, 973, 2(2): [6] WARE W R. Oxygen quenchingof fluorescence in solution. An experimentl study of the diffusion process[j]. J Phys Chem, 962, 66(3): [7] MAURICIO S B, GUILHERME L I. Effect of BSA binding on photophysicl nd photochemicl properties of trirylmethne dyes[j]. J Phys Chem, 998, 2(23): [8] ROSS P D, SUBRAMANIAN S. Thermodynmics of protein ssocitionrections: forces contributing to stbility[j]. Biochemistry, 98, 2(): [9] KLAJNERT B, BRYSZEWSKA M. Fluorescence studies on PAMAM dendrimers interction wiht bovine serum lbumin[j]. Bioelectrochemistry, 2, 55(/2): [] PETERS T. All bout lbumin: biochemistry, genetics, nd medicl pplictions[m]. Sn Diego, CA: Acdemic, 996. [] TIAN J, LIU J, HU Z, et l. Interction of wogonin with bovine serum lbumin[j]. Bioorg Med Chem, 5, 3(2):

Microsoft Word - a p.doc

Microsoft Word - a p.doc 25 年第 63 卷化学学报 Vol. 63, 25 第 18 期, 1727~1732 ACTA CHIMICA SINICA No. 18, 1727~1732 研究论文百草枯与牛血清白蛋白结合作用的荧光光谱颜承农 *, 张华新刘义 b 梅平 ( 长江大学化学与环境工程学院荆州 4342) ( b 武汉大学化学与分子科学学院武汉 4372) 李克华童金强摘要在模拟动物体生理条件下, 用荧光光谱和紫外

, Vol. 31, No. 01 食品科学 基础研究 柳全文 1, 徐慧 1, 李桂华 1, *, 张婷 2, 乔青安 1 (1. 鲁东大学化学与材料科学学院, 山东烟台 ;2. 鲁东大学生命科学学院, 山东烟台 ) 采用荧光光谱法研究咖啡酸与牛血清白蛋白 (

, Vol. 31, No. 01 食品科学基础研究柳全文 1, 徐慧 1, 李桂华 1, *, 张婷 2, 乔青安 1 (1. 鲁东大学化学与材料科学学院, 山东烟台 ;2. 鲁东大学生命科学学院, 山东烟台 ) 采用荧光光谱法研究咖啡酸与牛血清白蛋白 (