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蹄林
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1 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (11): 转铁蛋白转运培氟沙星的分子作用机制研究郭明 *, 鲁小旺, 冉晓云, 胡润淮 ( 浙江农林大学化学系, 浙江临安 ) 摘要 : 利用光谱实验结合计算机模拟技术研究转铁蛋白 (Transferrin, Tf) 转运药物培氟沙星 (pefloxacin mesylate, PM) 的相互作用机制, 测定反应体系的结合参数及热力学函数, 考察 PM 对 Tf 分子构象的影响, 并讨论结合反应的分子作用机制结果表明, 药物分子与转铁蛋白的相互作用表现为动态结合过程, PM 与 Tf 分子的结合距离 r 值较小, 说明发生了能量转移现象药物分子对转铁蛋白分子的结构域微区构象产生影响, 使结合位域的疏水性发生改变转铁蛋白转运培氟沙星的热力学参数表明 PM 与 Tf 之间是以疏水作用力为主的分子间作用机制依据计算机模拟建立的分子对接结果显示, PM 与 Tf 的相互作用主要为疏水作用, 兼有氢键的存在, 计算机分子模拟与光谱实验结果一致关键词 : 转铁蛋白 ; 甲磺酸培氟沙星 ; 光谱实验 ; 分子模拟中图分类号 : O641.3 文献标识码 : A 文章编号 : (2012) Molecular transport mechanism of pefloxacin mesylate binding with transferrin GUO Ming *, LU Xiao-wang, RAN Xiao-yun, HU Run-huai (Department of Chemistry, Zhejiang Agriculture & Forestry University, Lin an , China) Abstract: The binding mechanism between pefloxacin mesylate (PM) and transferrin (Tf) was explored using spectral experiment combined with molecular modeling techniques. The binding parameters and thermodynamic functions of PM-Tf solution system were measured at different temperatures. The effect of PM on molecular conformation of Tf was investigated and the interaction mechanism was also discussed. The results showed that dynamic quenching mechanism occurs with PM binding to Tf. The value of binding distances (r) is low, which indicates the occurrence of energy transfer. The drug had conformational effect on Tf, which resulted in changes of hydrophobic environment of the binding domain in Tf. According to the obtained thermodynamic parameters, the main interaction force between PM and Tf is attributed to hydrophobic bonding. The results of molecular modeling revealed that hydrophobic and hydrogen bonds are main binding forces in the PM-Tf system. These results were in accordance with spectral experiments. The research results have given a better theoretical reference for the study of pharmacological mechanism between protein and quinolone. Key words: transferrin; pefloxacin mesylate; spectrum experiment; molecular modeling 近期, 靶向给药系统在现代药剂学研究领域收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( ); 浙江省科技创新项目资助 ( ). * 通讯作者 Tel: , Fax: , guoming@zafu.edu.cn 备受关注转铁蛋白 (transferrin, Tf) 和转铁蛋白受体 (transferrin receptor, TfR) 介导的内吞作用是生物细胞最具特点的转运过程之一, 目前开展药物与转铁蛋白分子相互作用的研究多集中于以转铁蛋白与 [1, 其受体的特异性结合为转运途径 2], 将药物转运到转铁蛋白受体表达部位, 从而探索提高药物的靶向

2 1504 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (11): [3, 性增强药物的药效性 4] Tf 为单肽链糖基化球蛋白质分子, 其受 3 个碳水化合物侧链保护 : 2 个 N 链 (Asn 413 Asn 611) 和 1 个 O 链 (Ser 32) 转铁蛋白分子约含有 679 个氨基酸残基, 其由 N 端和 C 端两个具有高度同源性的结构域组成, N 端 C 端结构域又由两个大小相同的小亚基构成, 小亚基间的间隙为铁离子的结合位点 Tf 是血浆中主要的含铁蛋白质, 除承担对铁的吸收贮存和转运之外, 也可与进入血液中的多种内源或外源性物质结合, 其中药物分子与转铁蛋白之间借助于分子间作用力形成复合物通常可以改善药物在组织中的分配, 延长药物在胞浆中的半衰期, 同时还可达到控释作用等从不同角度研究转铁蛋白药物之间的相互作用, 对于阐明药物的运输与代谢过程及了解转铁蛋白的结构与功 [5, 能关系极有必要 6] 甲磺酸培氟沙星 (pefloxacin mesylate, 结构式见图 1) 是新一代喹诺酮类抗生素药物的代表之一, 具有抗菌谱广活性强毒副作用低及临床疗效高的 [7, 特点 8] 当前, 喹诺酮类药物与蛋白质分子作用机制研究主要考虑了血清白蛋白分子, 喹诺酮药物与转铁蛋白分子的相互作用研究甚少报道因此开展 PM 与 Tf 之间分子作用机制的研究, 有利于分子水平上探讨药物分子与转铁蛋白的相互作用机制, 进一步了解转铁蛋白的结构与功能关系, 为药物毒理药效深入研究提供必要的数据支持实验方法转铁蛋白与甲磺酸培氟沙星溶液的荧光光谱及药物溶液的吸收光谱测定 : 移取 2.5 ml Tf 溶液于 1 cm 石英比色皿中, 用微量进样器逐次加入 mol L 1 的甲磺酸培氟沙星溶液进行荧光滴定 ( 滴定剂累加体积 100 μl), 测定时发射与激发狭缝宽度均为 2.5 nm, 扫速 200 nm min 1, 激发波长 282 nm, 绘制 280~500 nm 发射光谱, 记录最大发射波长处的荧光强度 ; 测定 PM 溶液的电子吸收光谱同步荧光光谱测定及荧光相图绘制 : 分别固定荧光发射与激发的波长差为 Δλ = 60 nm 及 Δλ = 15 nm, 测定 Tf-PM 体系的同步荧光光谱 ; 提取发射谱中上升及下降阶段的荧光强度值, 根据相关原理绘制荧光相图分子模拟利用 SGI O2 工作站上的 DOCK 程序包建立药物与蛋白质分子相互作用模型, 进行分子模拟计算受体蛋白 Tf 的晶体结构从 PDB 蛋白质晶体数据库获得, 编码 1D4N ChemDraw 工具构建 PM 分子结构, 然后基于分子力学 MM2 力场优化后生成实验分子模型, 分子对接预处理时使用 AutoDock Toolkit (ADT) 进行受体与配体的优化处理分子对接技术确认 Tf 活性部位确定活性部位步骤 : 1 确定甲磺酸培氟沙星结合活性位点 ; 2 在配体结合位点填充球簇以映射受体结合腔穴的性质 ; 3 尝试匹配不同小球中心的距离和配体中不同原子的距离, 进行配体在受体活性位点处的构象搜索 ; 4 对配体的不同取向进行定位, 以经验势能函数作为评价函数, 找到配体与受体的最佳结合方式 [21] Figure 1 Chemical structure of pefloxacin mesylate 材料和方法试剂与仪器 F-4500 型荧光光度计 (Hitachi, 日本 ); UV-2450 型紫外可见分光光度计 (Shimadzu, 日本 ) 转铁蛋白 (Tf, 98%, 上海 Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co, Ltd; 编号 T1428); 甲磺酸培氟沙星 (PM, 98%) 三羟甲基氨基甲烷 (Tris, GR) 均购自上海华美生物工程公司 ; 实验用水为亚沸蒸馏去离子水配制 0.1 mol L 1, ph 7.43 Tris-HCl 缓冲溶液 ( 含 0.10 mol L 1 NaCl 维持离子强度 ), 用此缓冲液配制 mol L 1 Tf 及 mol L 1 甲磺酸培氟沙星储备溶液结果与讨论 1 Tf 与 PM 相互作用的荧光光谱及结合反应机制图 2 为 PM Tf 及二者以等物质量混合后体系的荧光光谱在 282 nm 的激发波长下, 甲磺酸培氟沙星的最大发射波长为 440 nm 左右, Tf 最大发射波长为 328 nm 由药物蛋白质混合体系的荧光发射谱可以看出, 药物的加入使 Tf 的荧光强度降低, 表明药物与 Tf 之间存在着相互作用, 发生了能量转移, 而 Tf 的存在并未使 PM 的荧光强度增加, 说明它们之间的能量转移属于非辐射转移过程图 3 为 PM 的吸收光谱由图 3 可见, PM 在 282 nm 激发波长及 328 nm 发射波长下有吸收, 因此, 在研究中需要考虑内滤光效应, 本文用公式 (1) [9] 对内滤光进行校正 F corr = F obs 10 A(λ exc)/2 10 A(λ em)/2 (1) 式中, F corr 为校正的荧光值, F obs 为测量的荧光值, A (λ exc ) 是在激发波长处的吸收值, A (λ em ) 是在发射

3 郭明等 : 转铁蛋白转运培氟沙星的分子作用机制研究 1505 Figure 2 Fluorescence emission spectra of samples in the Tf-PM solution system (A: 25 ; B: 37 ) Figure 3 Absorption spectrum of PM (A) and absorption difference spectrum of Tf-PM (B) 波长处的吸收值, 本实验所用荧光强度均为校正后的荧光值图 4 为固定蛋白浓度为 mol L 1 时, 体系的荧光发射光谱随 PM 浓度的变化图分析图 4 可知, a 峰为 Tf 在 328 nm 处的一级荧光峰, b 峰为 PM 的一级荧光发射峰, 因为 PM 也是一种内源荧光物质, 所以随着浓度的增加, b 峰逐渐增高在固定 Tf 浓度的条件下, 随着反应体系中药物浓度的增加, Tf 的荧光产生了规律性猝灭, 荧光最大发射峰位置出现 10 nm 的蓝移 (A B 两图均如此 ), 说明 PM 和 Tf 确实存在相互作用, 造成 Tf 分子中与 PM 相互作用的氨基酸残基的微区环境发生一定的变化, 荧光发 Figure 4 Fluorescence quenching spectra of Tf in interaction with PM (A: 25 ; B: 37 ). c (Tf) = mol L 1, c (PM)/10 5 mol L 1, 1 to 8: 0.0, 0.4, 0.8, 1.6, 2.8, 3.6, 4.8, 5.6

4 1506 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (11): 射团所处微区的疏水性有所增强蛋白质与药物分子相互作用的荧光猝灭过程通常分为静态猝灭与动态猝灭, 其中, 动态猝灭过程符合 Stern-Volmer 方程为确定 PM 对 Tf 的荧光猝灭机制, 首先按 Stern-Volmer 方程处理该体系 : F 0 /F = 1 + K q τ 0 [Q] = 1 + K SV [Q] (2) 式中 : K q 为双分子猝灭过程速率常数, L mol 1 s 1 ; τ 0 为猝灭剂不存在时生物大分子的平均寿命, s; [Q] 为猝灭剂 (PM) 的浓度, mol L 1 ; K sv 为 Stern-Volmer 猝灭常数, L mol 1, 即双分子猝灭过程速率常数 ( 双分子猝灭过程速率常数 K q = K SV /τ 0 ) 与单分子衰变速率常数的比率由实验测得 PM 与 Tf 相互作用的荧光光谱数据, 按 Stern-Volmer 方程处理可得图 5 Figure 5 Stern-Volmer plot for the fluorescence quenching of Tf by PM 形成会引起荧光体的吸收光谱不断变化, 据此来判断该体系是否属于动态猝灭 [13] 考察此体系荧光体的吸收光谱图 ( 图 3B), 可以发现 Tf 的紫外吸收曲线及 PM-Tf 等摩尔混合物与 PM 的差谱几乎完全重合, 表明药物的加入并未使 Tf 的紫外吸收发生变化, 由此两个结果可以确定甲磺酸培氟沙星与转铁蛋白分子的荧光猝灭机制为动态猝灭另外, 也有文献认为离子强度是影响猝灭机制的重要因素 [14], 需要考虑到实验体系为离子溶液时, K q 的增大很可能是离子强度影响的结果, 这需要在后续研究中开展进一步的细致实验验证 2 PM 与 Tf 相互作用的结合常数 (K) 及结合位点数 (n) 本工作由实验数据分析得到 PM 与 Tf 相互作用的动态荧光猝灭机制, 由分子荧光强度猝灭剂浓度关系得出结合参数的理论计算公式 [15] : lg[(f 0 F) / F] = lgk + nlg[q f ] (3) 式中 F 0 与 F 分别为猝灭剂加入前后荧光分子的相对强度, K 是结合常数, n 是结合位点数因为加入 PM 溶液体积远小于比色皿中溶液体积, 可以合理采用猝灭剂的总浓度 [Q] 代替 [Q f ] 以 lg[q] 对 lg[(f 0 F)/F] 作双对数图 ( 图 6), 求得 K 和 n, 计算结果列于表 2 图 6 结合表 2 可见, 公式 (3) 所求结果都有良好的相关系数且结合常数数量级均较高随着温度的升高, 结合常数随之增加, 结合位点约为 1.6 左右由于无猝灭剂时生物大分子的平均荧光寿命 τ 0 = s [10], 则由实验数据可以通过 Stern-Volmer 方程计算不同温度下 PM-Tf 相互作用的猝灭常数 K sv K q, 计算结果列于表 1 Table 1 The quenching constants of PM to Tf solution system Solution system T / K K sv /L mol 1 K q/l mol 1 s 1 R Tf-PM 为确定甲磺酸培氟沙星对转铁蛋白分子的猝灭机制, 在不同温度下作 PM 对 Tf 荧光猝灭的 Stern- Volmer 图 ( 图 5) 从图 5 可见, 在选定的浓度范围内, 随着温度升高, 猝灭常数呈增大趋势, 初步表明 PM [11, 对 Tf 的荧光猝灭机制为动态猝灭 12] 另外, 判断静态猝灭和动态猝灭的另一个方法是考察荧光体的吸收光谱动态猝灭仅仅影响荧光体的激发态, 不影响荧光体的吸收光谱, 而静态猝灭中, 基态配合物的 Figure 6 The lg[(f 0 F)/F] lg[q] plot of Tf-PM solution system 3 PM 与 Tf 相互作用力确定药物分子与生物大分子的相互作用力类型包括氢键范德华力静电引力疏水相互作用, 在一定温度变化范围内, 相互作用过程的 ΔH ΔS 可视为常数, 则可以计算相互作用的热力学参数根据 (4) [16] (5) (6) 热力学公式及式 (3) 求出的结合常数 K,

5 郭明等 : 转铁蛋白转运培氟沙星的分子作用机制研究 1507 Table 2 Binding parameters of PM to Tf Solution system K /L mol 1 n (Number of binding sites) Fitting equation R SD P Tf-PM (298 K) y = x < Tf-PM (310 K) y = x < 可求得 PM 与 Tf 结合反应的热力学函数变化值 ΔG = ΔH TΔS (4) ΔG = RTlnK (5) ln(k 2 /K 1 ) = (ΔH/R) (1/T 1 1/T 2 ) (6) 求得的 ΔG ΔH 及 ΔS 值列于表 3 药物与蛋白质等生物大分子的分子作用机制可根据药物生物大分子的相互作用模式判定, 药物与蛋白质分子相互作用的类型可由如下规则确定 [17] : ΔS > 0 时可能是疏水和静电作用力 ; ΔS < 0 时可能为氢键和范德华力 ; ΔH > 0, ΔS > 0 时为典型的疏水作用力 ; ΔH < 0, ΔS < 0 时为氢键和范德华力由此, 根据热力学参数分析可以确定 PM 与 Tf 之间的作用力为疏水作用力 Table 3 Thermodynamic parameters of PM binding with Tf Solution system ΔH /kj mol 1 ΔS /J mol 1 K 1 ΔG /kj mol 1 Tf-PM (298 K) Tf-PM (310 K) PM 对 Tf 体系的能量转移参数测定 [18] 按照 Fōrster 非辐射能量转移机制可以求出猝灭剂分子蛋白质分子间的能量转移效率及猝灭剂分子与蛋白质分子中荧光发射残基的结合距离据此理论, 荧光发射体和荧光猝灭体之间的能量转移效率 E 和两者之间的距离 r 及临界能量转移距离 R 0 相关 : E = R 0 6 / (R r 6 ) (7) 式中 : E 为能量转移效率 ; R 0 为能量转移效率 E=50% 时的临界能量距离 R 0 6 = K 2 N 4 ΦJ (8) 式中 : K 2 为偶极空间取向因子 ; N 为介质的折射指数 ; Φ 为授体的光量子效率 ; J 为授体 ( 蛋白 ) 荧光发射光谱与受体 ( 药物 ) 吸收光谱间的光谱重叠积分, cm 3 L mol 1 Ú F 0 Ú F( 0 4 J = ( l) e( l) l dl / l) dl (9) 式中 : F (λ) 为荧光授体在波长 λ 处的荧光强度 ; ε (λ) 为受体在波长 λ 处的摩尔吸收系数, L mol 1 cm 1 能量转移效率 E 则可以根据下式测得 : 7 E = 1 F/F 0 (10) 由获得的 UV 谱及荧光光谱作重叠光谱图, 见图从图 7 可见, Tf 的荧光发射谱与 PM 的紫外吸收 Figure 7 Overlap between the fluorescence emission spectra of Tf (a) and UV absorption spectra of PM (b) 谱确有部分重叠根据 Förster 的偶极偶极非辐射能量转移理论 [19] : 当供能体与受能体足够靠近, 距离在 7 nm 范围内时, 被激发的供能体分子将会与近邻受能体分子发生非辐射能量转移现象如果供能体发射荧光, 供能体的荧光发射光谱将与受能体的吸收光谱有足够的重叠, 导致供能体荧光猝灭, 并由此可以求出受能体分子和供能体分子的结合距离本实验根据公式 (9) 计算出 Tf-PM 结合反应的光谱重叠积分 J 为 cm L mol 1, 由公式 (10) 求得 E 为在本实验条件下, 取偶极空间取向因子为两个结合物各向随机分布的平均值, 即 K 2 = 2/3, 光量子效率取色氨酸标准值 Φ = 0.118, 折射指数取水和有机物的平均值 N = 1.336, 将以上各量代入公式 (8), 可得到 Tf 的临界能量距离 R 0 为 2.42 nm, 再代入公式 (7) 求得结合距离 r 为 2.95 nm 5 PM 对 Tf 构象的影响蛋白质的同步荧光光谱中, Δλ = 15 nm 显示酪氨酸残基的荧光光谱特性, Δλ = 60 nm 显示色氨酸残基的荧光光谱特性蛋白质中氨基酸残基的最大发射波长与其所处环境的极性有关, 故由最大发射波长的变化可判断蛋白质构象的变化固定 Tf 浓度, 逐渐增加 PM 的浓度, 可得到 Tf-PM 体系的同步荧光光谱 ( 图 8) 从图 8 可见, Tf 的荧光主要由色氨酸所贡献随着药物浓度的增大, 酪氨酸残基的最大发射波长基本保持不变 ( 图 8a), 图 8 (b) 在 290 nm 处形成了一

6 1508 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (11): Figure 8 Effect of PM on the synchronous fluorescence spectra of Tf (a: Δλ = 15 nm; b: Δλ = 60 nm). c (Tf) = mol L 1, c (PM)/10 5 mol L 1, 1 to 8: 0.0, 0.4, 0.8, 1.6, 2.8, 3.6, 4.8, 5.6 个峰, 这个峰并非 Tf 蛋白质峰, 而是 PM 峰, Δλ = 60 nm 时, 色氨酸残基的最大发射波长出现了蓝移现象, 蓝移约 10 nm, 表明色氨酸残基所处环境的疏水性有所增加, 组成疏水腔的肽链处于部分紧缩状态, 进而引起 Tf 的构象发生了一定程度的变化 6 Tf-PM 结合反应对 Tf 构象型态变迁的影响为了进一步了解 PM 与 Tf 结合反应对 Tf 构象型态变迁的动力学机制, 采用荧光相图法作进一步分析荧光相图法是在发射波长 λ 1 和 λ 2 下测定蛋白质在不同实验条件下荧光强度 I (λ 1 ) 和 I (λ 2 ) 的变化来描述蛋白质的结构变化结果可以采用荧光相图法检测 PM 与 Tf 相互作用中 Tf 构象型态的变迁信息荧光强度是一种广度性质, 因此存在以下关系 : I (λ 1 ) = a + b I (λ 2 ) (11) a = I 1 (λ 1 )I 1 (λ 2 )(I 2 (λ 1 ) I 1 (λ 1 ))/(I 2 (λ 2 ) I 1 (λ 2 )) b = (I 2 (λ 1 ) I 1 (λ 1 ))/(I 2 (λ 2 ) I 1 (λ 2 )) 其中, I (λ 1 ) 和 I (λ 2 ) 为不同实验条件下, 测定发射波长 λ 1 和 λ 2 的荧光强度若关系式 (11) 表现为线性, 则表示相应的蛋白质构象型态变迁过程符合二态模型 ; 反之若为非线性, 表明蛋白质的构象型态转变过程是一个序变过程 ; 若关系式 (11) 表现为两条或多条直线, 其中每一条直线都描述一个全或无的蛋白质结构变化过程, 则符合多态模型本实验通过比较多组波长 PM 与 Tf 相互作用的荧光相图及其相关系数, 以 I 320 I 365 的相图反映结果最精确图 9 为根据实验数据作出的相应荧光相图从图 9 可以看出, PM 与 Tf 结合反应的荧光相图呈线性, 说明 PM 与 Tf 发生非共价结合作用时, Tf 中构象型态变迁过程不是一序变过程, 是一个二态模型 7 分子模拟研究本实验进行分子对接计算模拟研究时, 转铁蛋白晶体结构取自 PDB 晶体数据库中的 Tf 晶体结构 ( 编号 1D4N), 考虑到甲磺酸培氟沙星分子的结构特点, 分子对接通过参数对比来寻找 PM 结合 Tf 的活性位点与最优结合模式 [20], 结果表明在 Trp264 附近区域对接时, 结合自由能最低, 分子模拟结果见图 10 ( 显示配体周围 1.0 nm 范围内的氨基酸残基 ) 图 11 ( 显示配体周围 2.95 nm 范围内的氨基酸残基 ) 图 10 清晰展现出 PM 与 Tf 的结合位域及相互作用力由图 10 可以看出, PM 分子结合在 Tf 的表面活性口袋处, 整个分子处于被包围状态, PM 分子距 Tf Figure 9 Fluorescence phase diagrams of Tf-PM (a: 25 ; b: 37 ). c (Tf) = mol L 1 ; c (PM) /10 5 mol L 1 1 to 8: 0.0, 0.4, 0.8, 1.6, 2.8, 3.6, 4.8, 5.6

郭明等: 转铁蛋白转运培氟沙星的分子作用机制研究 1509 Figure 10 Interaction mode (A) and hydrophobic surface map (B) between PM and Tf, only residues around 1.0 nm of the ligand are displayed.

The hydrogen bond between the ligand and the protein is represented using red dashed line 苯丙氨酸残基 (Phe) 很近, 而 Phe 也是 Tf 的内源荧光主要贡献者之一, 这很好地解释了 PM 能够猝灭 Tf 内源荧光的现象同时, PM 分子与 Tf 结合过程中, PM 羧酸根上的氧原子与

7 郭明等: 转铁蛋白转运培氟沙星的分子作用机制研究 1509 Figure 10 Interaction mode (A) and hydrophobic surface map (B) between PM and Tf, only residues around 1.0 nm of the ligand are displayed. The residues of Tf and the ligand structure are represented using stick model, thereinto red sticks represented oxygen. The hydrogen bond between the ligand and the protein is represented using red dashed line 苯丙氨酸残基 (Phe) 很近, 而 Phe 也是 Tf 的内源荧光主要贡献者之一, 这很好地解释了 PM 能够猝灭 Tf 内源荧光的现象同时, PM 分子与 Tf 结合过程中, PM 羧酸根上的氧原子与 Lys88 及 Lys278 上-NH2 形成氢键作用; 另一方面, PM 非共价结合在 Tf 活性位点域, 其结合口袋周围主要由 Ala82 Ala270 Pro91 Phe84 Phe302 Leu303 氨基酸残基形成一个疏水区域, 可以清楚观察到 PM 结合部位处于此疏水区域中, 疏水作用是 PM 与 Tf 结合的驱动力由分子模拟结果可知 PM 与 Tf 之间的主要作用力为疏水作用力, 兼有氢键的存在, 此结果与热力学实验结果一致光谱实验结果显示 Tf 中色氨酸残基所在微区位域与 PM 分子之间具有明显的相互作用, 但是依据优势构象原理的对接结果显示, 在配体分子周围 Figure 11 Interaction mode between PM and Tf, only residues around 2.95 nm of the ligand are displayed. The residues of Tf are represented using line model except that Trp and the ligand structure are represented using stick model 1.0 nm 范围内, 存在着 Tf 的苯丙氨酸残基, 并没有存在色氨酸残基这是由于实验测得 Tf-PM 分子的 (即产生别构效应), 致使药物分子结合位域的邻近微结合距离为 2.95 nm, 而由图 10 显示的是配体周围区构象发生变化, 而药物分子活性结合位域邻近区 1.0 nm 范围内的氨基酸残基结合情况, 因此将 Tf-PM 域为色氨酸残基, PM 结合 Tf 局部结构域的微区构象周围 2.95 nm 的氨基酸残基通过分子对接图显示出变化造成临近 Trp 结构位域一定程度紧缩, Trp 位域来 (没有改变 Tf-PM 内核结构及相互作用力), 见图含疏水氨基酸残基, 造成疏水性增加, 分子模拟结果 11 从图 11 可见, 在该结合距离范围, 确实存在色氨与光谱实验结果一致酸残基 Trp8 及 Trp264, 这充分提供了 PM 猝灭 Tf 内 8 源荧光的证据小结本文利用光谱实验结合分子模拟技术研究了甲同步荧光光谱中, PM 导致 Tf 在 Δλ = 60 nm 的同磺酸培氟沙星与转铁蛋白之间的相互作用, 测定了步荧光光谱最大发射波长明显蓝移, 这是由于 PM 嵌结合反应常数和热力学参数, 实验结果表明, 药物分入苯丙氨酸残基的结构位域并改变了相互作用氨基子与转铁蛋白之间的反应机制为动态猝灭根据能量酸残基周围的微区构象, 由于 Tf 分子倾向于保持整转移理论, 求得 PM 与 Tf 的距离 r 小于 7 nm, 说明发体能量最低的溶液紧缩型态, 尽量保持整体构生了非辐射能量转移现象 PM 的加入可以引起 Tf 象不变则在药物分子嵌入结构域中导致肽链变构构象型态的转变, 且 Tf 的构象型态变迁符合二态的同时, 势必会影响邻近微区位域的肽链型态变化模型

8 1510 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (11): 分子模拟结果揭示了药物在 Tf 上的结合位域非共价相互作用结合位点以及起主要作用的氨基酸残基等结构信息, 并综合实验得到的热力学参数的结果, 确定了 Tf 与甲磺酸培氟沙星之间的主要作用力为疏水作用, 兼有氢键的存在, 本工作一定程度上从分子水平阐明了喹诺酮药物与转铁蛋白的分子作用机制, 所得结果对于药物与转铁蛋白的相互作用研究具有重要参考意义 References [1] Steere AN, Miller BF, Roberts SE, et al. Ionic residues of human serum transferrin affect binding to the transferrin receptor and iron release [J]. Biochemistry, 2012, 51: [2] Goodman LB, Lyi SM, Johnson NC. Binding site on the transferrin receptor for the parvovirus capsid and effects of altered affinity on cell uptake and infection [J]. J Virol, 2010, 84: [3] Wang Z, Zhou HJ. Dihydroartemisinin down-regulates the expression of transferrin receptor in myeloid leukemia cells [J]. Acta Pharm Sin ( 药学学报 ), 2008, 43: [4] Zhong ZR, Liu J, Deng Y, et al. Preparation and gene expression of transferrin modified gene loaded procationic liposomes [J]. Acta Pharm Sin ( 药学学报 ), 2007, 42: [5] Xie J, Huang Y. The research progress of recombinant human transferrin [J]. Chin Med Biotechnol ( 中国医药生物技术 ), 2010, 5: [6] Evans RW, Kong X, Hider RC. Iron mobilization from transferrin by therapeutic iron chelating agents [J]. Biochim Biophys Acta, 2012, 1820: [7] Mostafa S, El-Sadek M, Alla EA. Spectrophotometric determination of ciprofloxacin, enrofloxacin and pefloxacin through charge transfer complex formation [J]. J Pharm Biomed Anal, 2002, 27 (1 2): [8] Zhao Y, Gao LJ, Sun XH, et al. Determination of pefloxacin mesylate by water-soluble CdTe quantum dots [J]. Chin J Spectr Lab ( 光谱实验室 ), 2012, 29: [9] Lakowicz JR. Principles of Fluorescence Spectroscopy [M]. 2nd ed. New York: Kluwer Academic/Plenum, [10] Ge F, Jiang LX, Liu DQ, et al. Interaction between alizarin and human serum albumin by fluorescence spectroscopy [J]. Anal Sci, 2011, 27: [11] He WY, Li Y, Si HZ, et al. Molecular modeling and spectroscopic studies on the binding of guaiacol to human serum albumin [J]. J Photochem Photobiol A: Chemistry, 2006, 182: [12] Wang N, Liu ZY, Hu SL, et al. Interaction between Scutellaria baicalensis Georgi and human serum albumin [J]. Chem J Chin Univ ( 高等学校化学学报 ), 2011, 32: [13] He WY, Hu ZD, Yao XJ, et al. Comparison of the interaction of alpinetin and cardamonin with human gammaglobulin [J]. Acta Chim Sin ( 化学学报 ), 2010, 68: [14] Zhang XW, Zhao FL, Li KA. Studies on the reaction between ciprofloxacin and bovine serum albumin [J]. Chem J Chin Univ ( 高等学校化学学报 ), 1999, 20: [15] Jiang CQ, Gao MX, He JX. Study of the interaction between terazosin and serum albumin synchronous fluorescence determination of terazosin [J]. Anal Chim Acta, 2002, 452: [16] Yan CN, Shangguan YF, Tong JQ, et al. Study on thermodynamics of binding reaction of dipyridamole with bovine serum albumin [J]. Spectro Spectral Anal ( 光谱学与光谱分析 ), 2003, 23: [17] Ross PD, Subramanian S. Thermodynamics of protein association reactions: forces contributing to stability [J]. Biochemistry, 1981, 20: [18] Liu XH. Studies on the Interactions Between Serum Albumins and Small Molecules of Flavonoid Compounds Using Spectral Technology ( 黄酮类药物小分子与血清蛋白间相互作用的光谱法研究 ) [D]. Liuzhou: Guangxi Normal University, [19] Lin H, Lan JF, Guan M, et al. Spectroscopic investigation of interaction between mangiferin and bovine serum albumin [J]. Spectrochim Acta, Part A, 2009, 73: [20] Liu NF, Qu LB, Xiang BR, et al. Antitumor mechanism of Qinghaosu derivatives-molecular docking studies of Qinghaosu derivatives with transferring [J]. Acta Pharm Sin ( 药学学报 ), 2009, 44: [21] Zhao Q. The Research on Ligand-Protein Interaction Using Molecular Docking ( 基于分子对接技术的小分子蛋白质相互作用研究 ) [D]. Wuxi: Jiangnan University, 2009.

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doc 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (3): 385 392 385 5- 羟甲基糠醛与不同血清白蛋白的结合反应机制研究郭明 *, 何玲, 鲁小旺 ( 浙江农林大学化学系, 浙江临安 311300) 摘要 : 利用光谱实验结合计算机模拟技术研究中药活性成分 5- 羟甲基糠醛 (5-HMF) 与人血清白蛋白 (HSA) 及牛血清白蛋白 (BSA) 的结合反应机制