第 8 期袁道琴等 : 甘草酸二铵与牛血清白蛋白相互作用的光谱 919 光光谱, 记录 348nm 处的荧光强度 (2) 紫外及示差光谱 : 以 Tris HCl 缓冲溶液与 NaCl 混合溶液作参比, 取适量 mol/lbsa 溶液用 1cm 石英比色池测定吸收光谱 ; 另外,

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沐伏薛
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1 第 26 卷第 8 期应用化学 Vol.26No 年 8 月 CHINESEJOURNALOFAPPLIEDCHEMISTRY Aug.2009 甘草酸二铵与牛血清白蛋白相互作用的光谱袁道琴冯素玲崔凤灵 ( 河南师范大学化学与环境科学学院新乡 ) 摘要在模拟人体生理条件下, 用常规荧光光谱和紫外可见吸收光谱研究了甘草酸二铵与牛血清白蛋白之间的相互作用, 并利用同步荧光光谱及三维荧光光谱探讨了甘草酸二铵对牛血清白蛋白构象的影响荧光光谱表明, 甘草酸二铵对牛血清白蛋白具有荧光猝灭作用根据不同温度下的荧光猝灭数据和紫外示差图谱证实, 甘草酸二铵对 BSA 的荧光猝灭为动态猝灭过程根据 F rster 非辐射能量转移理论计算了甘草酸二铵与牛血清白蛋白相互作用时, 其给体受体间的最近距离 (r=2 28nm) 和能量转移效率 (E=0 05); 研究了常温下几种金属离子对该相互作用体系的影响关键词甘草酸二铵, 牛血清白蛋白, 荧光光谱, 紫外吸收光谱, 同步荧光光谱, 三维荧光光谱中图分类号 :O654.3 文献标识码 :A 文章编号 : (2009) 体内血清白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质, 它能与许多内源及外源性化合物结合, 起到存储与转运的作用 [1] ; 药物被人体吸收进入循环系统后, 也可与血清白蛋白可逆地结合 [2] 研究药物与血清白蛋白的结合, 对了解药物在体内的运输吸收和代谢具有重要意义迄今研究药物与蛋白质相互作用的方法主要有荧光光谱法紫外可见光谱法圆二色谱 (CD) 傅立叶变换红外光谱法 (FT IR) 和核磁共振 (NMR) 波谱法其中, 荧光分析法具有高灵敏高选择简单而被广泛使用甘草酸二铵 (Diammonium Glycyrhi zinate,dg, 分子结构如 Scheme1) 是中药甘草的有效成分的第三代提取物, 具有较强的抗炎抗过敏抗生物氧化抗肝纤维化保护膜结构及免疫调节作用临床上广泛用于肝病的治疗, 并取得了显著疗效 [3,4] 有关甘草酸二铵与血清白蛋白相互作用的研究尚未见报道本文研究了不同温度下甘草酸二铵与血清白蛋白的相互作用, 对于阐明它在体内的输运过程及其作用机制提供基础信息 Scheme1 MolecularstructureofDG 1 实验部分 1.1 仪器和试剂 FP 6200 型荧光光谱仪 ( 日本分光公司 );TU 1900 型双光束紫外可见分光光度计 ( 北京普析通用仪器公司 );ph 3C 型数字酸度计 ( 杭州东星仪器设备厂 ) 牛血清白蛋白 (Sigma, 美国 ), 用水溶解配成浓度为 mol/l 储备液, 用时稀释成浓度为 mol/l 工作液 ;DG( 江苏正大天晴药业股份有限公司 ), 用水溶解配成浓度为 mol/l 储备液, 用时稀释成浓度为 mol/l 工作液 ;0 5mol/LNaCl 储备液,pH=7 4 的 Tris HCl 缓冲溶液所用水均为三次蒸馏水, 试剂均为分析纯 1.2 实验方法 (1) 荧光光谱 : 在 10mL 容量瓶中加入 2mL 缓冲溶液 2mLBSA 工作液 2mLNaCl 储备液及适量甘草酸二铵工作液, 用水定容混匀在 λ ex =278nm 激发和发射狭缝均为 5nm 的条件下, 扫描溶液荧收稿, 修回河南省新乡市科技发展项目 (07G052) 通讯联系人 : 冯素玲, 女, 博士, 教授 ;E mail:slfeng@htu.edu.cn; 研究方向 : 分子光谱

2 第 8 期袁道琴等 : 甘草酸二铵与牛血清白蛋白相互作用的光谱 919 光光谱, 记录 348nm 处的荧光强度 (2) 紫外及示差光谱 : 以 Tris HCl 缓冲溶液与 NaCl 混合溶液作参比, 取适量 mol/lbsa 溶液用 1cm 石英比色池测定吸收光谱 ; 另外, 以 DG+Tris HCl+NaCl 溶液为参比, 向相同溶液中滴加适量的 mol/lbsa 溶液, 测定体系的示差吸收光谱 2 结果与讨论 2.1 荧光光谱猝灭机理及猝灭常数的测定图 1 为 BSA DG 在 ph=7 4 的 Tris HCl 缓冲溶液中的荧光光谱从图中可以看出, 随 BSA 溶液中 DG 浓度增加,BSA 的内源性荧光强度发生规律性降低, 峰位置及峰形基本保持不变, 说明 DG 对 BSA 荧光发射有猝灭作用, 表明二者之间存在相互作用荧光猝灭过程通常分为动态猝灭和静态猝灭 [5] 动态猝灭过程是猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间的相互作用其作用过程遵循 Stern Volmer 方程 : F 0 /F =1+k q τ 0 [Q]=1+K SV [Q] (1) 式中,F 0 和 F 分别为加入猝灭剂前后所测得的荧光强度 ;k q 为双分子猝灭过程的速率常数 ;τ 0 为无猝灭剂共存时生物大分子的荧光寿命, 约为 10-8 s [5] ; K SV 为 Stern Volmer 猝灭常数, 是双分子猝灭速率常图 1 荧光光谱数与单分子衰变速率常数的比率 ;[Q] 为猝灭剂的 Fig.1 Fluorescencequenchingspectra 总浓度 ofbsawithdgadded 静态猝灭是猝灭剂和荧光物质的基态分子之间 10 6 c(dg)/(mol L -1 ):a.0;b.2; 的相互作用引起的其作用过程可用下式描述 : c.6;d.12;e.18;f.24;g.30;h.36;i.40 F 0 /F =1+K[Q] (2) c(bsa)= mol/l,ph=7.4,c(nacl)=0.1mol/l 式中,F 0 F 和 [Q] 与式 (1) 意义相同比较式 (1) 和式 (2) 可以看到, 无论是静态猝灭还是动态猝灭,F 0 /F 与 [Q] 均应为线性关系, 所以只从荧光强度得到的荧光猝灭数据, 无法判断猝灭机制是属于动态还是静态的, 还需要通过以下办法来区分是动态猝灭还是静态猝灭 :(1) 温度的影响因动态猝灭依赖于分子间的扩散, 升高温度会加速扩散, 因而动态猝灭常数应随温度升高而增大 ; 但升高温度将导致配合物的稳定性降低, 因而静态猝灭常数应随温度升高而减小 ;(2) 由于动态猝灭只影响荧光分子的激发态, 因而并不改变荧光物质的吸收光谱 ; 而静态猝灭中, 基态配合物的生成往往会导致荧光物质吸收光谱的改变因而从荧光物质与猝灭剂作用前后吸收光谱变化可预以判断 ;(3) 静态猝灭中, 猝灭剂并不改变荧光分子激发态寿命, 即 τ 0 /τ= 1; 而动态猝灭中, 荧光剂会使荧光物质的荧光寿命缩短和荧光强度的减小并存在 τ 0 /τ=f 0 /F 关系因此, 由荧光寿命变化也可判断猝灭机制基于测荧光强度随温度的变化, 最方便可行因此, 分别测定了 BSA 在 ph=7 4 的 Tris 缓冲溶液中不同温度下 DG 对 BSA 荧光的猝灭, 根据 Stern Volmer 方程绘制不同温度下的 (F 0 /F-1) 与 [Q] 的曲线 ( 见图 2), 由于随温度升高直线斜率增大, 表明猝灭过程为动态猝灭表 1 为不同温度下 DG 对 BSA 动态猝灭的线性图 2 甘草酸二铵对 BSA 荧光猝灭的 Stern Volmer 图方程及猝灭常数一般认为, 各类猝灭剂对生物大 Fig.2 Stern VolmercurversforDG BSAatpH=7.4 分子的最大扩散碰撞猝灭常数为 mol/s [6], c(bsa)= mol/l 而表 1 中,k q 比它大 2 个数量级 (k q =K SV /τ 0 ), 可能

3 920 应用化学第 26 卷由于实验体系为离子溶液, 测得的动态猝灭常数 k q 偏大很可能是离子强度的影响结果 [5,7] 表 1 线性方程和相关系数 Table1 Regresionquenchequationsandcorrelationcoeficients t/ Linearregresionequation R 10-4 K SV /(L mol -1 ) k q /(L mol -1 s -1 ) 15 F 0 /F-1= [Q] F 0 /F-1= [Q] F 0 /F-1= [Q] F 0 /F-1= [Q] 为进一步确定猝灭机理是动态猝灭, 又分别测定了在 ph=7 4 的 Tris 缓冲溶液中,BSA 及含等摩尔 DG 的 BSA 溶液与 DG 的吸收光谱的差谱结果表明, 两圆谱几乎完全重合, 加入 DG 并未改变 BSA 的紫外吸光谱, 表明 DG 对 BSA 的荧光猝灭不是它与 BSA 基态分子之间所发生的相互作用引起的, 即猝灭机理为动态猝灭 2.2 甘草酸二铵与激发态 BSA 分子间的能量转移上述分析证明 DG 对 BSA 的荧光猝灭是由扩散控制的动态猝灭, 因此它们之间的能量转移应属于分子间的非辐射能量转移 [5] 根据 F rster 的偶极偶极非辐射能量转移理论 [8], 能量转移效率 (E) 与给体受体间距离 (r) 及临界能量转移效率为 50% 的临界能量转移距离 (R 0 ) 的关系为 : E =R 6 0/(R 6 0 +r 6 ) (3) R 6 0 = K 2 Φn -4 J (4) 式中,K 2 为偶极空间取向因子 (K 2 =2/3);φ 为供能体 (BSA) 的荧光量子产率 (Φ =0 15);n 为介质折射指数 (n=1 36 [9] ),J 为供能体 (BSA) 的荧光发射光谱与受能体 (DG) 的吸收光谱间的重叠积分 : 图 3 BSA 荧光光谱和 DG 紫外吸收光谱的重叠图 J=Σ(F(λ) ε(λ) λ 4 Δλ)/Σ(F(λ) Δλ) Fig.3 OverlapofDGabsorptionspectrum(2) (5) withbsafluorscencespectrum(1) 式中,F(λ) 为波长 λ 处的荧光强度,ε(λ) 为 DG 在 1.BSA;2.DG;c(BSA)=c(DG)= mol/l 波长 λ 处的摩尔吸收系数,Δλ 为计算重叠积分时的波长跨度 ; 对于静态猝灭情况, 给体与受体间距离为 r; 而对于水溶液中分子快速扩散过程中发生的动态猝灭,r 为给体与受体间的最近距离, 它反映了控制这种接近程度的几何因素 [7] 采用矩形分割法按式 (5) 得 J= cm 3 L/mol, 根据式 (4) 得 R 0 =1 40nm 又 E=1-F/F [10] 0,F 0 为不存在能量接受体时能量给予体的荧光发射强度,F 为药物和蛋白质的摩尔浓度比为 1 1 时体系的荧光强度, 于是可得 E=0 05, 最后由式 (3) 可得 r=2 28nm r<7nm, 说明 BSA 与 DG 之间发生了非辐射能量转移, 从而导致 BSA 的荧光猝灭具备了能量转移猝灭 BSA 荧光的条件, 因此非辐射能量转移是引起荧光猝灭的主要原因 2.3 DG 对 BSA 构象的影响为了解 DG 与 BSA 相互作用后, 对 BSA 分子构象的影响, 分别采用同步荧光光谱和三维荧光光谱研究了 DG 存在下 BSA 荧光光谱的变化固定激发波长和发射波长的差 Δλ=15nm 扫描获得的同步荧光光谱只显示 BSA 分子中酪氨酸残基的光谱特性, 而 Δλ=60nm 的同步荧光光谱显示 BSA 分子中色氨酸残基的光谱特性因为蛋白质氨基酸残基的最大发射波长 λ max 与其所处环境的极性有关, 故由 λ max 的变化可判断蛋白质构象的变化 [11] 图 4A 和图 4B 分别为在 BSA 溶液中加入不同浓度的 DG 测得的酪氨酸和色氨酸的同步荧光光谱图图中可见, 随 DG 浓度增加, 酪氨酸残基 (Tyr) 最大发射峰蓝移, 而色氨酸残基 (Trp) 则略有红移, 显示 Tyr 残基所处微环境的极性有所降低, 处在 BSA 的疏水区内而 Trp 残基所处微环境的极性有所增强, 可能处在 BSA 的亲水区, 裸露在水溶液中 [12], 形成了无序结构, 表明

4 第 8 期袁道琴等 : 甘草酸二铵与牛血清白蛋白相互作用的光谱 921 DG 使 BSA 的构象发生改变图 4 BSA DG 体系的同步荧光光谱 Fig.4 SynchronousfluorescencespectraofBSA DG A:Δλ=15nm;c(BSA)= mol/l;10 5 c(dg)/(mol L -1 ):a.0;b.2.3;c.4.7;d.7.0;e.9.3;f.11.7; B:Δλ=60nm;c(BSA)= mol/l;10 6 c(dg)/(mol L -1 ):a.0;b.2;c.6;d.12;e.18;f.24;g.30;h.36 三维荧光光谱是表征溶液中小分子化合物与蛋白质分子作用引起蛋白质分子构象变化的一种光谱指纹技术 [13] 图 5a 和图 5b 分别是在 ph=7 4Tris HCl 缓冲溶液中 BSA 和 BSA DG 的三维荧光光谱从图中可以看出, 当 DG 加入后,BSA 的最大发射峰波长移动不明显 ; 瑞利散射峰和荧光峰的相对强度均降低, 等高线的疏密程度发生了变化图 5 三维荧光光谱图 Fig.5 Three dimensionalfluorescencespectraandcontourspectraofsystems a.bsa;b.dg BSA;c(BSA)= mol/l,c(dg)= mol/l 2.4 共存离子对动态猝灭常数的影响生物体内存在许多微量元素, 它们也参与许多重要的生命过程 [14] 本文考察了在 ph=7 4 条件下,Ca 2+ Fe 3+ Zn 2+ Cu 2+ 对 DG BSA 体系相互作用的影响 ( 见表 2) 可以看出,4 种离子的存在均增大了该体系的动态猝灭常数, 说明上述金属离子有助于 DG 对牛血清白蛋白的荧光猝灭表 2 不同金属离子对动态猝灭常数的影响 Table2 EfectsofdiferentmetalicionsondymicalquenchingconstantofDG withbsa System R 10-4 K SV System R 10-4 K SV DG BSA DG Zn(Ⅱ) BSA DG Ca(Ⅱ) BSA DG Cu(Ⅱ) BSA DG Fe(Ⅲ) BSA c(bsa)= mol/l;c(ca(Ⅱ))=c(fe(Ⅲ))=c(zn(Ⅱ))=c(cu(Ⅱ))= mol/l. 参考文献 1 FeiT,MingG,YuQS.SpectrochimActaA[J],2005,6(13-14): ZhouN,LiangYZ,WangPJ.PhotochemPhotobiol[J],2007,185(2-3):271

5 922 应用化学第 26 卷 3 XUWei Hua( 许伟华 ),LIUBin( 刘斌 ),LINSen( 林森 ),ZHUJu Ren( 朱菊人 ).ChineseJNewDrugClinicalReme dies( 中国新药与临床杂志 )[J],2003,22(6):352 4 GEMing Zhu( 葛明珠 ),ZHANGZhi Lin( 张志林 ),PANXing Bin( 潘兴斌 ).ChinesePharmBul( 中国药理学通报 ) [J],1991,7(4):297 5 XUJin Gou( 许金钩 ),WANGZun Mu( 王尊木 ).FluorescenceAnalyticalMethods( 荧光分析法 )[M].Beijing( 北京 ):SciencePres( 科学出版社 ),2006:65 6 WareW RJ.PhysChem[J],1962,66(3):445 7 ZHANGXiao Wei( 张晓威 ),ZHAOFeng Lin( 赵凤林 ),LIKe An( 李克安 ).ChemJChineseUniv( 高等学校化学学报 )[J],1999,20(7): WANGXin( 王欣 ),JIALi Hua( 贾丽华 ),GUOXiang Feng( 郭祥峰 ),LUXiao Xia( 卢小霞 ).ChineseJApplChem ( 应用化学 )[J],2007,24(7):761 9 CyrilL,EarlJK,SperyW M.Biochemists Handbook,EandFNSpon.London,1961:83 10 HeW Y,LiY,XueCX,HuZD,ChenXG,ShengFL.BioorgMedChem[J],2005,13(5): LIANGYan Qiu( 梁彦秋 ),SUNPeng( 孙鹏 ),LIUTing Ting( 刘婷婷 ),DENGBin( 邓斌 ),ZANGShu Liang( 臧树良 ).ChineseJApplChem( 应用化学 )[J],2007,24(8): YANCheng Nong( 颜承农 ),ZHANGHua Xin( 张华新 ),JUXiang( 鞠香 ),MEIPing( 梅平 ),LIUYi( 刘义 ),PAN Zhu Ting( 潘祖亭 ).ChineseJAnalChem( 分析化学 )[J],2005,33(6): LIUZhi Hong( 刘志宏 ),CAIRu Xiu( 蔡汝秀 ).JAnalSci( 分析科学学报 )[J],2000,16(6): FENGXi Zeng( 冯喜增 ),JINRui Xiang( 金瑞祥 ),QUYun( 曲芸 ),HEXi Wen( 何锡文 ).ChemJChineseUniv( 高等学校化学学报 )[J],1996,17(6):866 SpectroscopicStudiesontheInteractionbetween Diammonium GlycyrrhizinateandBovineSerum Albumin YUANDao Qin,FENGSu Ling,CUIFeng Ling (ColegeofChemistryandEnvironmentalScience,HenanNormalUniversity,Xinxiang453007) Abstract Theinteractionbetweendiammonium glycyrhizinate(dg)andbovineserum albumin(bsa)was studiedinphysicologicalsolutionbyspectroscopicmethodsincludingfluorescencespectrometryanduv Visible absorptionspectrometry.synchronousfluorescenceandthree dimensionalfluorescencespectrawereusedto investigatetheconformationalchangeofbsaduetotheadditionofdg.fluorescencetitrationrevealsthatthe flurescenceintensityofbsaat348nm wasquenchedwhendgwasadded.thedynamicquenchingexisted betweendg andbsa accordingtotheflurescencequenchingdataatdiferenttemperaturesandtheuv diferentialspectra.accordingtof rstertheoryofnon radiationenergytransfer,thenearestdistance(r= 2 28nm)andtransfereficiencyofenergy(E=0 05)betweendonor(BSA)andacceptor(DG)were determined.theefectsofmetalionsonthesystemwerestudiedatroomtemperature. Keywords diammoniumglycyrhizinate,bovineserum albumin,fluorescencespectrum,absorptionspectrum, synchronousfluorescence,three dimensionalfluorescencespectrum

材料导报研究篇年月下第卷第期种球的制备单步溶胀法制备分子印迹聚合物微球洗脱处理种子溶胀聚合机理种球用量的影响

材料导报研究篇年月下第卷第期种球的制备单步溶胀法制备分子印迹聚合物微球洗脱处理种子溶胀聚合机理种球用量的影响水相中组氨酸单分散分子印迹聚合物微球的合成表征及其识别性能研究李思平等李思平徐伟箭较佳工艺条件下在水性体系中选用无皂乳液聚合法制得的单分散微米级聚苯乙烯微球为种球分别以组氨酸甲基丙烯酸或丙烯酸胺乙二醇二甲基丙烯酸酯为模板分子功能单体和交联剂合成了组氨酸分子印迹聚合物微球研究了形貌粒径及其分布以及模板分子与功能单体之间的相互作用分别以激光粒度分析仪紫外分光光度法和红外光谱表征功能单体与交联剂之间的共聚情况

第 8 期 袁道琴等 : 甘草酸二铵与牛血清白蛋白相互作用的光谱 919 光光谱, 记录 348nm 处的荧光强度 (2) 紫外及示差光谱 : 以 Tris HCl 缓冲溶液与 NaCl 混合溶液作参比, 取适量 mol/lbsa 溶液用 1cm 石英比色池测定吸收光谱 ; 另外,

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