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秦束
4 years ago
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1 实验 14 分子荧光分光光度法测定面粉中的核黄素 ( 维生素 B2) 复旦化学系教学实验中心

2 一实验目的二方法原理三 FL-4500 荧光分光光度计四实验步骤五数据处理六思考题

3 一实验目的 1. 掌握面粉样品的消化方法, 了解溶液的 ph 值等对核黄素荧光强度的影响 2. 了解荧光分光光度计的主要结构及工作原理, 掌握其正确使用方法 3. 掌握荧光分析法基本原理和实验方法

4 二方法原理 1. 荧光荧光分子 / 荧光物质 2. 荧光分析法 : 特点定量方法 3. 荧光分光光度计 : 结构原理操作 4. 核黄素 VB2: 结构性质面粉中提取方法

5 分子发光的基本原理第一次记录荧光现象的是 16 世纪西班牙的内科医生和植物学家 N.Monardes, 1575 年他提到在含有一种称为 Lignum Nephriticum 的木头切片的水溶液中, 呈现了极为可爱的天蓝色直到 1852 年,Stokes, 在考察奎宁和叶绿素的荧光时, 用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些, 才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光, 而不是由光的漫射作用所引起的, 从而导入了荧光是光发射的概念, 他还由发荧光的矿石萤石推演而提出荧光这一术语 1867 年,Goppelsroder, 进行了历史上首次的荧光分析工作, 应用铝桑色素配合物的荧光进行铝的测定 19 世纪以前, 荧光的观察是靠肉眼进行的, 直到 1928 年, 才由 Jette 和 West 提出了第一台荧光计

6 分子发光的类型按激发的模式分类 : 按分子激发态的类型分类 : 按光子能量分类 : 光致发光化学发光 / 生物发光热致发光场致发光摩擦发光荧光磷光瞬时荧光迟滞荧光荧光斯托克斯荧光 (Stokes): λ em λ ex < 反斯托克斯荧光 (Antistokes):λ ex λ em 共振荧光 (R ) λ ex >

7 荧光产生的机制分子的活化与去活化过程

8 分子荧光 ( 磷光 ) 光谱 1. 荧光 ( 磷光 ) 激发光谱与发射光谱荧光 ( 磷光 ) 均为光致发光, 在光辐射的作用下, 荧光物质发射出不同波长的荧光 A. 激发光谱固定发射波长扫描激发波长 n MX + hvi MX i= 1 I F * MX * MX 固定 λ em =620nm(MAX) λ ex =290nm (MAX) λ + n j= 1 hv j

9 B. 发射光谱 ( 荧光光谱 ) 固定激发波长 C. 激发光谱与发射光谱的镜像关系扫描发射波长发射光谱的形状与激发波长无关 : 分子被激发到 S 1 或者高于 S 1 的电子态, 经过极快的内转换和振动弛豫降到 S 1 电子态的最低振动转动能级, 然后以辐射形式释放能量回到基态 S 1 S 0 I F 固定 λ em =620nm(MAX) λ ex =290nm (MAX) λ 固定 λ ex =290nm (MAX) λ em em = 620nm(MAX)

10 (a) 等角三维投影图 (b) 等高线光谱图三维荧光光谱的两种表示分子荧光光度法的一些基本概念激发光谱荧光光谱三维荧光光谱用途?

11 强荧光物质结构特点 :π π * 共轭 π 体系刚性平面结构取代基如荧光素和酚酞结构十分相似, 荧光素在溶液中有很强的荧光, 而酚酞没有如芴和联苯在相同的条件下, 荧光量子产率约为 1 和 0.18

12 影响荧光发射溶液环境因素 : (a) 溶剂效应 : 取决于荧光体和溶剂的化学结构极性重原子效应 (b) 温度 :T φ f (c)ph 平衡解离关系对 λf.max φ f 均有影响溶液荧光的猝灭荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间相互作用而导致荧光强度下降的现象称为荧光的猝灭 ( 或熄灭 ) 引起荧光猝灭的物质称为荧光猝灭剂

13 荧光定量分析基础荧光强度与浓度的关系光吸收定律 (Lambert Lambert Beer Law) A = lgt 相应的吸光分数为 : 1 I 0 I I = lg t 0 I = t I I t 0 1 T = I 0 = ε bc, = ( 1 1 e e T = e 2.303εbC 2.303εbC 荧光强度 (I( F ) 与相应的吸光分数成正比 : 2.303ε bc ) I F 按照级数展开式 : e x = = φ( I I ) = φi x 1! + t 2 x 2! + 3 x 3! 0 ( x 4! e 2.303εbC + + ) n x n!

14 荧光定量分析基础荧光强度与浓度的关系 I F = φ I 0 ( 2.30εbC ( 2.30εbC ) 2! 2 ( 2.30εbC ) + 3! 3 ( 2.30εbC ) 4! 对于稀溶液, 当 ε bc<0. <0.05( 磷光 ε bc<0. <0.01) ) 时 : IF = 2.30 kφ F I0ε b C I P = 2.30 kφ P I0 I F ---- 荧光强度 φ F 荧光量子产率 I P ---- 磷光强度 φ P 磷光量子产率 b-- 吸收光程 ε-- 摩尔吸光系数 C-- 荧光物质浓度 k-- 与仪器灵敏度有关的参数 I 0 -- 入射光强度 4 ε b C + )

15 荧光定量分析基础荧光强度与浓度的关系稀溶液中 I F = 2.3ϕ F I 0 ε b c I F 荧光强度 ϕ F 荧光发射的量子产率 ε 摩尔吸光系数 I 0 入射光强度 b 试样的吸收光程 c 试样浓度当 I 0 及 b 一定 I F = k c 荧光强度 I F 与荧光物质的溶液浓度 c 成线性关系

16 荧光 ( 磷光 ) 的量子产率荧光量子产率的定义 : φ F = φ 发射荧光的分子数激发分子总数 F F = n k k + k 发射磷光的分子数激发分子总数 F i P i i= 1 i= 1 k F k p 主要取决与荧光物质的分子结构 ; φ st 系间窜跃效率 Σ k i 主要取决化学环境, 同时也与荧光物质的分子结构有关大多数的荧光物质的量子产率在 0.1~1 之间 ; 例如 :0.05mol/L: 的硫酸喹啉,,φ F =0.55; 荧光素 φ F =1 φ P = φ P φ P = st n k k + k 化合物 φ F

17 标准曲线法 ( 工作曲线法 ) 1. 最大激发波长最大吸收波长的选择 ; 2. 系列标准溶液绘制工作曲线 ; 3. 测定未知溶液, 查得其浓度标准曲线法求解 K : (1) 图解法 (2) 解析法

18 分子荧光分光光度法 v.s. 紫外 - 可见分光光度法灵敏度高 : 测定下限在 0.1~0.001 μg/ml, 比分光光度法高 2~4 个数量级光强 I 与 I 0 的信号差别 ~ 荧光发射的光强选择性高 : 适当选择激发光波长和荧光测定波长产生荧光的化合物有限, 不及分光光度法广泛, 干扰物质较少

19 三 F 4500 型荧光分光光度计荧光分光光度计主要组成及部件的荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图光源激发单色器氙灯光电倍增管样品池问题 : 荧光分光光度计与紫外 - 可见分光光度计有何异同点? 数据处理仪器控制光源激发单色器样品池发射单色器发射单色器检测器数据处理仪器控制

20 三 F 4500 型荧光分光光度计样品槽 : 比色皿 :?

21 F-4500 型荧光分光光度计光路图

22 F-4500 型荧光分光光度计的使用 1 开机 Power-Xe lamp-main 启动软件 FL Solutions Program

23 F-4500 型荧光分光光度计的使用 2 波长扫描 wavelength?? Scan Start Method Sample Pre-scan Measure 数据处理 Report Method:

24 四实验步骤 1 试样溶液制备 2 实验条件的选择 3 标准曲线的绘制及样品的测定

25 关于核黄素 VB 2 面粉中提取方法面粉主要成分淀粉蛋白质脂肪矿物质维生素等营养强化面粉国家标准面粉中核黄素含量 ~ g/l, 回收率为 98%~105%, 方法检出限 g/l 核黄素又称维生素 B 2, 维他命 B 2 Riboflavine C 17 H 20 O 6 N 4 微溶于水 ; 对空气氧气稳定, 对光敏感, 在 430~440nm 蓝光照射下会在 525nm 附近发绿色荧光 ; 在 ph6~7 的水溶液中荧光最强, 在 ph 为 11 时荧光消失

26 1 试样溶液制备面粉 10g400mL 烧杯加 0.1mol/L 盐酸 100mL 冷却后, 用 NaOH 调至 ph , 然后立即加稀盐酸至 ph4.5 剧烈搅拌, 倒入 150mL 沸水, 维持微沸 30min 并搅拌使均匀分散核黄素在碱性溶液中不稳定, 要边加边摇防止局部碱性过强将混合物定量转移至 250mL 容量瓶, 用 (5:95) 醋酸溶液定容离心取清液, 避光, 待测加 1 滴丁醇配平, 离心取上清

27 2 实验条件的选择 (1) 激发光波长荧光波长选择吸取核黄素标准溶液 1mL 于 25mL 容量瓶, 用 (5:95) 醋酸溶液定容暂设定荧光波长即发射光波长 EX:525nm, 在 nm 波长范围对激发波长进行扫描, 记录激发光谱曲线 ; 取最大激发波长 EM, 在 nm 波长范围对荧光波长进行扫描, 记录荧光光谱曲线确定最佳激发光波长荧光波长 (2) 酸度选择取三个 25mL 容量瓶, 各加入核黄素标准溶液 1mL, 然后分别用 1:1 盐酸,(5:95) 醋酸,5%NaOH 溶液稀释到刻度分别测定溶液 ph 值, 测定荧光强度, 考察酸度对荧光强度的影响, 从中确定最佳酸度 3 标准曲线的绘制及样品的测定

28 五数据处理 1 从荧光光谱图上读出最大激发(λ ex ) 和发射波长 (λ em ) 2 软件绘制标准工作曲线法 3 计算面粉提取液中维生素 B 2 的含量

29 本实验注意事项 1) 溶液的配制 : 盐酸浓度,NaOH 调节 ph 理论计算等 2) 标准溶液移取与稀释操作 3) 系列标液的测定顺序 4) 样品保存, 防止光降解 5) 荧光仪的开关机顺序

30 六思考题 1. 在荧光测量中, 为什么激发光的入射与荧光的接收不在一直线上, 而呈一定角度? 2. 试述荧光分光光度计与紫外 - 可见分光光度计在结构上的有哪些不同点? 3. 定量测定维生素 B 2 可用的方法有哪些? 试比较各种方法的优缺点

31 问题核黄素结构性质??? 对空气氧气稳定, 对光敏感, 在 430~440nm 蓝光照射下会在 525nm 附近发绿色荧光 ; 在 ph6~7 的水溶液中荧光最强, 在 ph 为 11 时荧光消失 +2 H -2 H 氧化型还原型

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