第 48 卷第 5 期张天星, 等 : 齐墩果酸及衍生物与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱分析 573 等 [2], 一些 OA 制剂及其衍生物已作为药物用于临床治疗 [3-4] 目前, 许多研究人员以 OA 为先导物, 对其进行化学结构修饰, 以获得更高药理学活性的衍生物 [5] 研究药物分子与蛋

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1 572 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity 2017,48(5): 齐墩果酸及衍生物与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱分析张天星, 黄伟, 黄雪玉, 廖安平 ( 广西民族大学广西多糖材料与改性重点实验室培育基地 / 广西高校化学与生物转化过程新技术实验室, 南宁 ) 摘要通过化学修饰改善齐墩果酸与牛血清白蛋白的相互作用, 从而提高两者之间的结合能力以齐墩果酸为先导物, 分别对其 C 3 位羟基和 C 28 位的羧基进行修饰, 得到 4 种不同的衍生物, 并用 IR 和 1 HNMR 进行结构表征采用荧光光谱法, 研究了齐墩果酸及 4 种衍生物与牛血清白蛋白的相互作用规律, 以及温度和 Cu 2+,Co 2+ 等金属离子对两者之间的相互作用的影响与齐墩果酸相比,4 种衍生物与牛血清白蛋白的相互作用都有提高, 其中衍生物 OA 2 与牛血清白蛋白的相互作用提高了近 16 倍 Cu 2+ 和 Co 2+ 等金属离子能明显增强衍生物 OA 2 与牛血清白蛋白间的相互作用化学修饰是提高齐墩果酸与 BSA 之间的相互作用的有效途径关键词齐墩果酸 ; 衍生物 ; 牛血清白蛋白 ; 相互作用 ; 荧光光谱法中图分类号 R914;R965 文献标志码 A 文章编号 (2017) doi: /j.isn 引用本文张天星, 黄伟, 黄雪玉, 等齐墩果酸及衍生物与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱分析 [J]. 中国药科大学学报,2017,48 (5): Citethisarticleas:ZHANGTianxing,HUANGWei,HUANGXueyu,etal Interactionofoleanolicacidanditsderivativeswithbovineserumalbu minbyspectrofluorimetry[j].jchinapharmuniv,2017,48(5): Interactionofoleanolicacidanditsderivativeswithbovineserum albumin byspectrofluorimetry ZHANGTianxing 牞 HUANGWei 牞 HUANGXueyu 牞 LIAOAnping GuangxiKeyLaboratoryCultivationBaseforPolysacharideMaterialsandModification/GuangxiColegesandUniversitiesKeyLabo ratoryofchemicalandbiologicaltransformationprocestechnology 牞 GuangxiUniversityforNationalities 牞 Nanning 牞 China Abstract Oleanolicacidwaschemicalymodifiedtoimproveitsinteractionwithbovineserumalbumin 牞 thusto increasethemutualbindingability Asaleadcompound 牞 oleanolicacidreactedwithjones reagent 牞 thenmethyl iodideandfinalyhydroxylaminetoobtainfourdiferentderivatives TheirstructureswereconfirmedbyIRand 1 HNMRanalysis Theinteractionbetweenthesederivativesandbovineserumalbuminandtheefectoftempera tureandtracemetalionsascu 2+ andco 2+ ontheinteractionwereinvestigatedbyfluorescencespectroscopy Al thesederivativesexhibitedimprovementoftheinteractioncomparedwitholeanolicacidwith16timesstrongerfor OA 2 TheinteractionalsoincreasedwiththepresenceoftracemetalionsasCu 2+ andco 2+ Theseresultsindicate thatchemicalmodificationcanimprovetheinteractionofoleanolicacidwithbovineserumalbumin Keywords oleanolicacid 牷 derivatives 牷 bovineserumalbumin 牷 interaction 牷 spectrofluorimetry ThestudywassupportedbytheProgramforTalentHighlandInnovationResearchTeamConstructionofGuangxiProvince 牗 No.GJR 牘 andthenationalundergraduatetrainingprogramforinnovationandentrepreneurship 牗牘齐墩果酸 (oleanolicacid,oa) 是一种具有生物活性的五环三萜类天然化合物, 主要存在于木犀科植物中 [1] OA 及其衍生物对治疗某些疾病表现出良好的药理学活性, 如保肝抗炎和抗肿瘤活性收稿日期通信作者 Tel: E mail:gxanping@sina com 基金项目广西高校人才小高地建设创新团队计划资助项目 ( 桂教人 [2011]47 号 12); 国家级大学生创新创业训练计划资助项目 (No )

2 第 48 卷第 5 期张天星, 等 : 齐墩果酸及衍生物与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱分析 573 等 [2], 一些 OA 制剂及其衍生物已作为药物用于临床治疗 [3-4] 目前, 许多研究人员以 OA 为先导物, 对其进行化学结构修饰, 以获得更高药理学活性的衍生物 [5] 研究药物分子与蛋白质间的相互作用, 以及人体内微量金属离子对药物分子与蛋白质间相互作用的影响, 可在分子水平上认识和探索药代动力学药物毒理学及其相关作用机制牛血清白蛋白 (BSA) 与人血清白蛋白 (HSA) 有很高的同源性, 是血浆中最重要的蛋白质之一, 具有多种生理功能, 且能够可逆地与进入血液中的众多内源性和外源性物质 ( 如药物 ) 等结合, 从而承担对这些物质在人体组织或细胞内的转运作用 [6] 研究药物分子与蛋白质相互作用有光谱亲和色谱毛细管电泳等温滴定量热分子对接和动力学模拟等方法, [7] 其中荧光光谱法最为常用 Rub 等通过荧光光谱技术研究了两亲性的药物盐酸奎宁与 BSA 在不 [8] 同条件下结合常数和热力学参数 Wang 等应用荧光淬灭和紫外可见分光法相结合的方法, 在近生理条件下研究了头孢孟多和 BSA 的相互作用 [9] 刘保生等利用荧光淬灭法同步荧光法共振光散射法及紫外吸收光谱法分别研究了 BSA 与硫酸黏杆菌素硫酸头孢匹罗头孢匹胺钠 3 种药物间作用, 认为荧光淬灭法更适合用于研究蛋白与药物的反应机制本研究以 OA 为先导物, 对其 C 3 号位 C 28 号位基团进行化学修饰得到 4 种衍生物, 其中化合物 3 是在 C 3 C 28 位同时引入肟和甲基合成得到的, 用荧光光谱法研究了它们与 BSA 的相互作用机制并考察了人体内某些微量金属元素离子 (Cu 2+,Co 2+ ) 对所选择出的 OA 衍生物与 BSA 相互作用的影响, 为开发 OA 类药物提供理论基础材料 1 1 仪器 Avance/AV300MHz 超导核磁共振仪 ( 瑞士 Bruker 公司 );MAGNA 1R500 傅里叶变换红外光谱仪 ( 美国赛默飞世尔科技公司 );F 4600 荧光分光光度计 ( 日本日立公司 );FD 1000 冷冻干燥机 ( 埃朗科技国际贸易有限公司 );RE 52AA 旋转蒸发器 ( 上海亚荣生化仪器厂 ) 1 2 试剂全组分 BSA( 南京奥多福尼生物科技有限公司 );OA( 上海麦克林试剂 ); 其他试剂均为分析纯, 由广西南宁米菲儿公司提供 ; 实验用水均为三蒸水方法 2 1 OA 衍生物合成及表征以 OA 为先导物, 按下列方法制备得到 4 种 OA 衍生物, 其反应过程如图 1 所示, 并用红外光谱 (IR) 和核磁共振波谱 ( 1 HNMR) 表征 3 氧代齐墩果酸 (OA 1 ) [10] 称取齐墩果酸 2 00g 溶解于二氯甲烷与丙酮 (1 1)30mL 混合溶液中, 在 0 度条件下缓慢滴加 Jones 试剂 4mL, 置于常温下反应一定时间后, 加入异丙醇 20mL 终止反应, 再加入水 30mL, 旋转蒸发除去溶液中有机溶剂 ; 乙酸乙酯 30mL 萃取 3 次, 合并乙酯相, 加入适量无水硫酸钠干燥, 减压干燥, 粗产物用硅胶柱色谱 ( 石油醚丙酮,6 4) 纯化得 OA 1 IR:2941 6,1701 2, ,1383 6,1282 9,1214 6; 1 H NMR(CDCl 3,300 MHz),5 28(1H,t,H 12 ),2 83(1H,dd,J=11 35Hz,H 18 ), 2 52(1H,m,J=33 51,H 2 ),2 34(1H,m,J=15 36Hz, H 2 ),1 16(3H,S),1 07(3H,S),1 04(6H,d,J=6 93Hz), 0 92(6H,d,J=9 91Hz),0 79(3H,s) 3 氧代齐墩果酸甲酯 (OA 2 ) [10] 称取 OA g, 溶解于 THF30mL 中, 加入 KOH(5 0mmol) CH 3 I(2 6 mmol)67 回流反应 3h, 反应混合物冷却后过滤, 滤液在减压条件下蒸除, 粗产物用硅胶柱色谱 ( 石油醚乙酸乙酯, 7 3) 纯化得 OA 2 IR:2940 7,1720 9,1695 2,1458 2, ; 1 HNMR(CDCl 3,300MHz)5 22(1H,t,H 12 ),3 54 (3H,s,COCH 3 ),3 21(1H,m,J=15 97Hz,H 3 ),2 83(1H, dd,j=11 35Hz,H 18 ),2 50(1H,m,J=34 51Hz,H 2 ), 2 30(1H,m,J=15 26Hz,H 2 ),1 11(3H,s),1 07(3H,s), 1 04(6H,s),0 97(3H,s),0 85(3H,s),0 79(3H,s) 3 肟齐墩果酸甲酯 (OA 3 ) [11] 称取 OA g 盐酸羟胺 0 25g 溶入吡啶 30mL 中,115 下回流反应 4h, 反应结束后迅速倒入冰水 50mL 中, 加入 HCl 酸化至 ph 3 0, 过滤, 干燥, 粗产物用硅胶柱色谱 ( 石油醚乙酸乙酯, 8 2) 纯化得 OA 3 IR:3276 1,2357 4,1724 4,1659 5, , cm -1 ; 1 HNMR(CDCl 3,300 MHz),5 22 (1H,t,H 12 ),3 55(3H,s,COOCH 3 ),2 81(1H,dd,3 6Hz, J=13 6Hz,H 18 ),2 50(1H,m,J=33 61Hz,H 2 ),2 31 (1H,m,J=15 30Hz,H 2 ),2 00(1H,s, =N OH),1 28 (3H,S),1 17(3H,S),1 11(6H,d,J=6 93Hz),1 08(s, CH 3 ),0 97(3H,s),0 94(3H,s),0 88(3H,s) 3 肟齐墩果酸 (OA 4 ) [11] 称取 OA g 盐酸羟胺 0 13g 溶入吡啶 30mL 中,115 下回流反应 4h, 反应结

3 学报ＪＣＰＵ束后迅速倒入冰水Ｌ中加入ＨＣ酸化到Ｈ为第卷ＨＪＨＨＨＪＨ过滤干燥粗产物用硅胶柱色谱石油醚乙酸乙酯ＨＨＮＯＨＨＨ纯化得ＯＡＩＲＨＪＨＣＨＨＨＮＭＲＣＤＣＨＨＭＨＨＨＨＪＨＨＦＳＯＡＯＡ及衍生化合物与Ａ相互作用荧光光谱测定用典型的荧光光谱图如图Ａ用ＬＴＨＣ缓冲溶液Ｈ配成适宜浓度的储备液放入冰箱中保存备用ＯＡ及其合成的衍生物用二甲基亚砜ＤＭＳＯ配制成Ｌ的储备液再稀释至所规定的浓度用于实验在比色皿中加入一定体积的Ａ储备液再加入不同浓度等体积的ＯＡ及衍生物溶液测定时体系中Ａ浓度固定为Ｌ激发狭缝宽度发射狭缝激发波长分别在和Ｋ下检测体系的荧光淬灭光谱Ａ浓度固定为ＬＣＣ金属离子浓度固定为Ｌ操作条件同上检测反应体系的荧光淬灭光谱 # 结果ＦＦＯＡＡＴＫＨ λｘＬＡＬＯＡＯＡ及种衍生物与Ａ作用的荧光淬灭ＯＡ及其衍生物与Ａ作用类型ＯＡ及其衍生物与Ａ作用的荧光淬灭光态荧光淬灭两种动态淬灭是由具有荧光淬灭谱作用的物质与荧光物质的激发态分子间的相互按照实验条件在ＴＫ时测得不同浓度荧光淬灭机制一般分为动态荧光淬灭和静下ＯＡ及种衍生物与Ａ作用的荧光淬灭光谱作用结合而引起的静态淬灭则是由具有荧光淬ＯＡ及种衍生物与Ａ作用的荧光淬灭光谱在灭作用的物质与荧光物质的基态分子间的相互左右处随着ＯＡ及种衍生物浓度增加作用而引起的荧光淬灭类型一般可通过ＳＡ的荧光强度逐渐减弱但峰形和峰位都没有Ｖ方程中的常数来判别ＳＶ方变化表明ＯＡ及种衍生物与Ａ发生了相互作程如下

4 第 48 卷第 5 期张天星, 等 : 齐墩果酸及衍生物与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱分析 575 F 0 F =1+K q τ 0 c OAi =1+K SV c OAi (1) F 0 和 F 分别为无淬灭剂和有淬灭剂时的 BSA 的荧光强度,K q 为双分子淬灭速率常数 (L mol -1 s -1 ),τ 0 为无淬灭剂时生物大分子的平均寿命 (s), 一般来说 τ 0 约为 s K SV 为 Stern Volmer 淬灭常数 (L/mol) c OAi 为淬灭剂的物质的量浓度对 OA 及合成的 4 种衍生物与 BSA 作用的荧光淬灭实验数据, 用 Stern Volmer 进行拟合, 结果见表 1 一般认为, 淬灭常数 K q 大于 L/mol 时, 为静态淬灭由表 1 可知,OA 及 4 个合成的衍生物的 K q 均在数量级, 所以 OA 及 4 个合成的衍生物对 BSA 淬灭机制均为静态淬灭 Table1 Stern VolmerequationandcorelationparametersofOAand itsderivativeswithbsa(310k,ph7 40) Compd. K SV / K q / ( 10 4,L/mol) ( 10 13,L mol -1 s -1 ) r OA 2 79± ± OA ± ± OA ± ± OA ± ± OA ± ± 结合常数和结合位点当小分子淬灭剂与生物大分子结合时, 其结合常数 K a 和结合位点的数量 n 可通过下列公式计算 : lg F 0-F F =lgk a+nlgc OAi (2) F 0 和 F 分别为淬灭剂存在与不存在时 BSA 的荧光强度,K a 为结合常数 (L/mol),n 为结合位点数,c OAi 为 OA 及其衍生物的物质的量浓度 (mol/l) 根据方程 (2) 获得的 OA 及 4 种衍生物与 BSA 作用的结合常数和结合位点数见表 2 Table2 BindingconstantsandbindingsitesofOAanditsderivatives withbsa(310k,ph7 40) Compd. K a / n r ( 10-5,L/mol) OA 0 104± ± OA ± ± OA ± ± OA ± ± OA ± ± 从表 2 知, 与 OA 相比, 在 OAC 3 号位和 C 28 号位进行化学修饰获得的衍生物与 BSA 作用有一定程度的提高, 其中 OA 2 与 BSA 的结合常数比 OA 与 BSA 的结合常数增大了 16 倍结合位点数 n 接近于 1, 说明 OA 及 4 种衍生物与 BSA 作用是形成 1 1 的复合物温度对 OA 2 与 BSA 的影响 3 个不同温度下, 以 lg(f 0 -F)/F 对 lgc OA2 作图并计算结果示于表 3 中从表 3 可知, 随着温度的增加,BSA OA 2 之间相互作用的 K a 逐渐减小, 进一步说明 OA 2 与 BSA 作用的淬灭机制为静态淬灭 Table3 BindingconstantsandbindingsitesofOA 2 BSA system at diferenttemperatures(ph7 40) T/K K a /( 10-6,L/mol) n r ± ± ± ± ± ± 热力学参数和结合力的类型当温度变化不大时, 可将 OA 2 与 BSA 相互作用的焓变 (ΔH) 看成近似不变, 过程的熵变 (ΔS) 的值通过 Van thof 方程 (3) 和 (4) 式确定, 其中 K a 是对相温度下的结合常数,R 为理想气体常数 lnk a =ΔH/RT+ΔS/R (3) ΔG=-RTlnK a =ΔH-TΔS (4) 用 lnk a 对 1/T 作图, 拟合曲线图得出斜率求出 ΔH, 通过截距求出 ΔS,ΔG 可由公式 (4) 估算结果见表 4 Table4 ThermodynamicparametersofOA 2 interactionwithbsa(ph 7 40) T/K ΔH/(kJ/mol) ΔG/(kJ/mol) ΔS/(J mol -1 K -1 ) 根据相互作用体系前后 ΔH 和 ΔS 的相对大小, 可以判断有机小分子与生物大分子之间的主要作用力类型 ; 当 ΔH<0,ΔS<0 时, 主要为氢键和范德华力作用 OA 2 是在将 OA 分子 C 3 号位上 OH 转变为 =O, 增加了其与 BSA 作用域中氨基和羧基中氢的作用 ;C 28 号位 COOH 形成了一个 COOCH 3, 减少了其与 BSA 作用域中氨基和羧基中氢的排斥作用 ΔG 为负值表明结合过程为自发的 3 3 Cu 2+,Co 2+ 对 OA 2 与 BSA 之间作用的影响一些金属离子, 如 Cu 2+,Co 2+ 等能与 BSA 作用形成复合物, 影响淬灭剂与 BSA 之间的作用在

5 学报ＪＣＰＵＫ下研究了ＣＣ等离子对ＯＡ与Ａ参考文献相互作用的影响荧光光谱图如图结合常数和结合位点数计算结果见表实验结果表明Ｃ和Ｃ存在时ＯＡ与Ａ的结合常数分别增加了和倍第卷ＬＪＪＸＴＺＬＹＪＣＰＵ中国药科大学学报ＤＹＺＺＺＨＺＪＪＣＰＵ中国药科大学学报ＷＧＬＷＷＳＡＯＢＣＴＣＺＬＨＣＹｊ α ＲＳＣＡＱＹＸＭＹＨＺＪＣＣＤＯＭＪＣＰＵ中ＦＣＯＡＡＫＬ λｘＡＣＯＡＬ国药科大学ＧＱＬＬＲＪＦＬＣｗＡＰＣＳ物理化学学ＴＣＣＯＡＡＫＳＡＯＡＫＫＫＬ ± ± ＡＯＡＣ ± ± ＣＡＯＡ ± ± ＫＫ报ＲＭＡＫＪＭＡＡＭｗＪＬＩＷＱＬＸＳＭｗＡＡｑＬＬＴＴＺＱＪＭ % 结论ＩＣＪＬ发光学报对ＯＡ的Ｃ号位羟基和Ｃ号位羧基进行化学修饰获得种ＯＡ衍生物采用荧光光谱法对ＯＡ及种衍生物与Ａ间相互作用研究结果表明ＯＡ及种衍生物与Ａ之间均属于静ＺＨＳＢＤＳＥＣＮＵ华东师范大学ＭＹＱＦＣＱＺＬＦ态淬灭的过程将ＯＡＣ号位的羟基氧化为酮ＡＰＳ药学学位的羧基酯化成甲酯得到的ＯＡ与Ａ基Ｃ报之间的作用最强与ＯＡ相比提高了近倍通过热力学分析ＯＡ与Ａ之间的结合是一个自发过程相互间的作用力主要是为氢键和范德华ＪＡＷＤＹＱＹＷＧｗＰＴＣＡＰＢＣＡ理化检验化学分册力作用Ｃ和Ｃ存在时ＯＡ与Ａ的结合ＺＢＷＬＢＸＷＳ常数分别增加了和倍本研究结果对ｗ开发ＯＡ及其衍生物药品疗效的结构设计提供了新的途径ＰＰＳ药学进展

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药学实践杂志药理年第卷第期生物技术药品近年来的发展杨玉龙任海祥南京军区南京总医院南京本文概述了近年来国内外生物技术药品与生化药品的研究与发展论述了生物技术与生物药品摘要间的关系介绍了近代生物技术在某些生物药品生产中的应用