Microsoft Word - A z.doc

Size: px

Start display at page:

Download "Microsoft Word - A z.doc"

宋姻崎柯
5 years ago
Views:

1 2012 年第 70 卷化学学报 Vol. 70, 2012 第 11 期, 1295~1303 ACTA CHIMICA SINICA No. 11, 1295~1303 研究论文具有抗癌活性的新型硒杂环化合物的合成及其与牛血清蛋白的相互作用罗懿 a 陈填烽 *,a 黄晓纯 a 王弋 a 黄荫成 b 郑文杰 *,a ( a 暨南大学化学系广州 ) ( b 香港中文大学生命科学学院香港沙田 ) 摘要合成了一种新的硒二唑衍生物 4-( 苯并 [c][1,2,5] 硒二唑 -6-yl) 苯 -1,2- 二氨基 (BSBD). 研究了其抗肿瘤活性, 结果发现 BSBD 具有很好的抗癌活性, 特别对 Neuro-2a 小鼠脑神经瘤细胞表现出很好的选择性. 关于作用机制的研究发现, BSBD 可呈剂量效应的诱导肿瘤细胞中 Sub-G1 凋亡峰的累积染色质固缩及凋亡小体的形成, 说明诱导细胞凋亡是 BSBD 发挥抗肿瘤活性的主要机制. 进而应用紫外 - 可见吸收光谱荧光光谱法傅里叶红外光谱圆二色光谱法研究了其与牛血清白蛋白 (BSA) 的相互作用. 采用位点结合模型公式和热力学公式计算了结合常数结合位点数及结合力类型, 并用紫外 - 可见吸收光谱红外光谱和圆二色光谱技术探讨了硒杂环化合物对牛血清白蛋白构象的影响. 结果表明 : BSBD 能有效淬灭牛血清白蛋白的荧光强度, 其猝灭机理为静态猝灭, 主要作用力类型是氢键和范德华力. 而同步荧光紫外 - 吸收示差光谱红外光谱和圆二色光谱都进一步证明了 BSBD 与 BSA 结合后, 改变了 BSA 的内部结构. 关键词硒杂环化合物 ; 抗肿瘤活性 ; 牛血清白蛋白 ; 相互作用 ; 荧光猝灭 Synthesis, Anticancer Activity of a Novel Selenadiazole Derivative and Its Interaction with Bovine Serum Albumin Luo, Yi a Chen, Tianfeng*,a Huang, Xiaochun a Wang, Yi a Wong, Yumshing b Zheng, Wenjie*,a ( a Department of Chemistry, Jinan University, Guangzhou ) ( b School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong) Abstract A novel selenadiazol derivative (BSBD) has been synthesized, characterized and evaluated for its anticancer activity. The in vitro anticancer activities of BSBD were screened by MTT assay against various cancer cell lines and it was found that BSBD could effectively inhibit cancer cell growth, especially for Nuero-2a neuroblastoma cells. Further investigation on the action mode showed that BSBD could induce Sub-G1 peak accumulation, chromatin condensation and the formation of apoptotic body in a dose-dependent manner in cancer cells, indicating that induction of apoptosis is the main mechanism accounting for the action of BSBD. Moreover the interaction between BSBD and bovine serum albumin (BSA) was investigated by UV-Vis, fluorescence and circular dichroism spectrometry and FTIR. The binding constants, number of binding sites and type of binding force were calculated by applying the equation of site-binding model and thermodynamic equations. The results of UV-Vis, FTIR and circular dichroism spectrometry revealed that the major interaction mode between BSA and BSBD was static quenching, due to hy- * tchentf@jnu.edu.cn, tzhwj@jnu.edu.cn Received February 3, 2012; accepted February 14, Project supported by New Century Excellent Talents in University (NCET ), the National Natural Science Foundation of China (Nos and ), Key Project of Science and Technology Department of Guangdong Province (No. 2008A ). 教育部新世纪优秀人才支持计划 (NCET ), 国家自然科学基金项目 (Nos , ) 和广东省科技攻关项目 (No. 2008A ).

2 1296 化学学报 Vol. 70, 2012 drogen bonding and van der Waals force. The results of spectroscopic characterization showed BSBD altered the chemical structure and conformation of BSA. Keywords selenadiazole derivative; anticancer activities; bovine serum albumin; interation; fluorescence quenching 蛋白质是重要的生命物质, 它与生命的起源和进化生物的营养发育遗传和新陈代谢等生命活动都有着密切的联系. 血清白蛋白是血浆中含量最为丰富的蛋白质, 具有贮运内源代谢产物和外源药物小分子等重要生理功能 [1]. 牛血清白蛋白 (bovine serum albumin, BSA) 与人血清白蛋白 (human serum albumin, HSA) 的结构相似, 二者的氨基酸序列高度相似, 且不同氨基酸均为保守性替换, 而 BSA 更廉价易得, 所以人们长期研究药物与 BSA 的结合情况, 作为对 HSA 结合情况的参考 [2]. BSA 是生物大分子, 具有多个配位基团, 其生物功能与其特定结构密切相关, 其广泛应用于生化生理细胞免疫学医学以及生物工程等科学上, 因此各种物质与牛血清白蛋白结合方面的研究仍处于热点 [3,4]. 药物自给药部位吸收进入血液循环后, 通过血浆的储存和运输到达受体部位产生药效作用. 药物与白蛋白的亲和力大小也影响到药物在体内的分布, 通过改变血液或组织中游离药物浓度来影响药效. 另外, 药物与白蛋白作用后使药物储留于血浆中以减弱药物的最大作用强度, 防止其大幅度波动以及延长药物的作用时间. 因此, 研究药物与血清白蛋白之间的相互作用, 有助于了解药物在体内的运输和分布情况, 对于阐明药物的作用机制具有重要意义. 微量元素硒是人体和动物的必须营养物质, 具有广泛的生物学功能和广泛的药理作用, 如抗氧化抗肿瘤抗炎抗高血压降血糖等活性 [5]. 大量的流行病学临床前和临床干预研究的结果都证明硒化合物在肿瘤的防治上起着重要的作用 [6]. 因此利用硒独特的化学和生物化学性质来开发新型药物是当今化学生物及相关交叉学科的研究热点. 近些年人们合成出大量具有生物活性的有机硒化合物 [7], 主要包括含硒杂环二硒醚硒醚硒氰甲基硒酸含硒氨基酸 ( 蛋白 ) 硒糖等几大类. 含硒杂环化合物因其潜在的药理学活性以及独特的化学性质引起越来越多的重视 [8]. 本课题组在前期的研究中设计合成了一系列不同结构的具生物活性的 1,2,5- 硒二唑化合物 [9], 并深入探讨了 SPO [10] 及 ASDO [11] 引起癌细胞凋亡的机制及所涉及到的细胞信号转导通路, 结果显示硒二唑化合物是一类具有重要应用前景的抗肿瘤药物或先导物. 因此, 研究具有抗癌活性的 1,2,5- 硒二唑化合物与生物大分子相互作用具有重要意义. 本文报道了 4-( 苯并 [c][1,2,5] 硒二唑 -6-yl) 苯 -1,2- 二氨基 (BSBD) 的合成 ( 图 1), 并研究了其抗肿瘤活性及作用机理. 结果表明, BSBD 具有很好的抗肿瘤活性, 且通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥其抗肿瘤作用. 进一步在模拟生理条件下, 运用紫外吸收光谱荧光光谱法傅里叶红外光谱圆二色光谱法, 研究了 BSBD 与牛血清白蛋白的相互作用, 探讨了 BSBD 对牛血清白蛋白构象的变化. H 2 N H 2 N NH 2 NH 2 SeO 2 N Se N NH 2 NH 2 图 1 4-( 苯并 [c][1,2,5] 硒二唑 -6-yl) 苯 -1,2- 二氨基的合成 Figure 1 Synthetic route of 4-(benzo[c][1,2,5]selenadiazol- 6-yl)benzene-1,2-diamine 1 实验部分 1.1 试剂与仪器牛血清白蛋白 ( 生化试剂, 上海丽珠东风生物技术有限公司出品 ); 二氧化硒, 3,3',4,4'- 联苯四胺, 三羟甲基氨基甲烷均为 sigma 公司 ; 盐酸等其他试剂均为分析纯. BP301S 电子天平 ( 德国 Sartorius 公司 ); 电喷雾质谱仪, LCQ 系统 (Finnigan MAT, USA); Varian 300 MHz 核磁共振波谱仪 (DMSO 为溶剂, TMS 为内标 ); Cary 5000 紫外 - 可见分光光度计 ( 国产 ); ELX800 型酶标仪 ( 美国 Bio-Tek 公司 ); 970CRT 型荧光分光光度计 ( 日本 Shimadzu 公司 ); BrukerEquinox55 型红外光谱仪 ( 日本 Shimadzu 公司 ); J-810 圆二色谱仪 ( 日本 JASCO 公司 ) ( 苯并 [c][1,2,5] 硒二唑 -6-yl) 苯 -1,2- 二氨基 (BSBD) 的合成及表征在单口烧瓶中加入 1 mmol 3,3',4,4'- 联苯四胺, 加入适量盐酸溶液使其完全溶解, 室温下逐滴加入 1 mmol SeO 2 水溶液, 反应 2 h 后过滤除杂, 滤液在冰浴搅拌条件下用饱和的 NaOH 溶液调节至弱碱性, 析出土灰色沉淀, 抽滤, 所得固体用少量水洗涤数次后真空干燥, 即得所要产品, 产率 60%. UV (CH 3 OH) λ: 259, 326, 467 nm; 1 H NMR (300 MHz, DMSO) δ: 7.79~7.82 (m, 3H, Ar-H), 6.95~7.06 (m, 2H, Ar-H), 6.63 (d, J=1.2 Hz, 1H), 4.87 (s, 2H), 4.65 (s, 2H); IR (KBr) ν: 3426, 1620, 1512, 671, 455 cm -1 ; ESI-MS m/z: (M+H) +. Anal. calcd

3 No. 11 罗懿等 : 具有抗癌活性的新型硒杂环化合物的合成及其与牛血清蛋白的相互作用 1297 for C 12 H 12 N 4 Se: C 49.49, H 4.15, N 19.24; found C 49.62, H 4.26, N 抗肿瘤活性实验细胞培养本实验选择多种购自 ATCC 公司的肿瘤细胞株, 包括 A-375 黑色素瘤细胞, Hela-229 人宫颈癌细胞, MCF-7 人乳腺癌细胞, Neuro-2a 小鼠脑神经瘤细胞, PC-3 人前列腺癌细胞等. 将受试样品用含有胎牛血清的 RPMI1640 和 DMEM 配成一定浓度的原液, 再依次稀释到需要的浓度. 培养基 (DMEM 和 RPMI 等 ) 添加小牛血清 (10%), 青霉素 (100 units/ml) 和链霉素 (50 units/ml). 培养条件 : 37, 5% CO 2. 根据细胞生长状况每 2~3 d 换培养液 1 次, 当细胞生长状态稳定, 呈对数生长期时, 用于实验细胞存活率实验细胞存活率用 MTT 法进行测定. 细胞经 0.25% 胰蛋白酶消化 5 min 成单细胞悬液, 台盼蓝染色计数活细胞数, 调整活细胞浓度为 /ml 加于 96 孔培养板, 每孔 100 μl, 培养 24 h 后, 再分别加入不同浓度受试样品 100 μl, 置 37, 5% CO 2 培养特定时间, 然后加入 MTT (5 mg/ml) 20 μl/ 孔, 5 h 后离心弃上清液, 加入二甲基亚枫 (DMSO) 100 μl/ 孔, 振荡 10 min 左右, 置酶标仪测定 OD 值, 波长为 570 nm. 计算细胞存活率, 同时作图并求得半数抑制浓度 (IC 50 ) 流式细胞分析 Neuro-2a 细胞用不同浓度的 BSBD 处理 72 h 后, 离心收集细胞, 用 PBS 清洗两次, 加入 70% 乙醇, -20 放置固定过夜, 离心, 清洗后进行细胞 PI 染色. DNA 含量测定利用 Beckman 流式细胞分析仪. 用 DNA 柱状图表示细胞在 G0/G1, S 和 G2/M 各相的分布比例. 凋亡细胞亚二倍体 DNA 含量测定通过定量图中 sub-g1 峰测得. 每个样品分析颗细胞 DAPI 染色检验 Neuro-2a 细胞用不同浓度 BSBD 处理 24 h 后, 用 PBS 清洗两次, 细胞在含 3.7% 的甲醛和 0.1% TritonX-100 的 PBS 缓冲液的细胞培养片中孵育 10 min, 再将细胞在含 100 μl/well TUNEL ( 核苷酸与末端脱氧核苷酸转移酶 ) 细胞培养板中培养 1 h. PBS 清洗后在 1 μg/ml 的 DAPI 中孵育 15 min. 最后以 PBS 溶液洗涤后用荧光显微镜检测. 1.4 BSBD 与 BSA 的相互作用研究储备液的配制配制 mol L -1 Tris-HCl 缓冲液 ( 内含 mol L -1 NaCl, ph 7.4); 然后用该 Tris-HCl 溶液配制浓度为 mol L -1 BSA 溶液标准溶液, 于 4 冰箱中保存, BSBD 用甲醇配置储备液, 浓度为 mol L 荧光光谱及同步荧光光谱测定在 280 nm 为激发波长下进行荧光扫描. 光源为脉冲式氙灯, 发射与激发狭缝宽度均为 5.0 nm, 扫描速度 500 nm min -1, 移取 3 ml BSA 标准溶液于 1 cm 石英比色池中, 用微量注射器逐次加入一定体积的 BSBD 溶液进行荧光滴定, 每次加入溶液混合均匀, 在一定温度下作用几分钟, 记录 290~500 nm 波长范围内的发射光谱. 固定 Δλ 为 15 或 60 nm, 记录 BSBD 与牛血清白蛋白作用的同步荧光光谱紫外 - 可见分光光谱测定在室温下, 200~350 nm 范围内, 以相应的 BSBD 溶液作为参比, 记录牛血清白蛋白溶液和 BSBD 混合溶液的紫外吸收光谱红外光谱测定取 BSBD ( mol L -1 ) 与牛血清白蛋白 ( mol L -1 ) 的混合溶液, 用 Tris 缓冲溶液定容 3 ml, 混合均匀, 移取适量上述溶液至红外光谱仪 ATR 附件的样品池中, 以同浓度的 Tris 缓冲溶液为空白, 扫描水溶液的红外吸收光谱圆二色光谱测定移取 3 ml 的 BSA ( mol L -1 ) 溶液于比色池中, 用微量进样器逐次加入一定量的化合物进行 CD 滴定, 每次加入溶液后均匀混合几分钟, 在 200~260 nm 范围内测定圆二色谱. 扫描速度为 50 nm min -1, 响应时间为 4 s. 2 结果与讨论 2.1 抗肿瘤活性的研究用 MTT 法测定硒二唑衍生物 BSBD 对 Neuro-2a, Hela-229, A-375, MCF-7, PC-3 及 MG-63 的生长抑制情况, 图 2(a) 给出了 BSBD 对不同细胞肿瘤组的 IC 50, 结果表明 BSBD 对 Neuro-2a 小鼠脑神经瘤细胞表现出良好的选择性, 其 IC 50 值 1.99 μg/ml 显著地低于其他肿瘤细胞. 如图 2(b) 所示, BSBD 呈剂量效应的抑制 Neuro-2a 细胞的生长. 细胞的形态学观察可以直观地显示药物对肿瘤细胞的作用方式, 可初步判断是否有细胞凋亡或者坏死的发生. 一般来说, 正常细胞的膜保持完整, 且染色质较均匀分布. 而凋亡的细胞则会有明显的形态学改变, 如细胞表面微绒毛消失产生空泡出现细胞收缩和染色质固缩等, 同时伴有有凋亡小体的形成. 然而, 细胞坏

4 1298 化学学报 Vol. 70, 2012 图 2 BSBD 的体外抗肿瘤活性 (a) BSBD 作用于各种癌细胞 72 h 的 IC 50 值 ; (b)bsbd 作用于 Neuro-2a 小鼠脑神经瘤细胞 72 h 的细胞存活率 ; (c)bsbd 作用下 Neuro-2a 和 PC-3 细胞的形态学改变 Figure 2 In vitro anticancer activity of BSBD (a) Growth inhibition of BSBD on various cancer cells. (b) Growth inhibitory effects of BSBD on Neuro-2a cells. (c) Morphological changes of cells exposed to BSBD. Cells were treated with BSBD for 72 h 死的特征为细胞膜的破坏及细胞内容物的流出等. 本实验观察了不同浓度 BSBD 作用下 Neuro-2a 和 PC-3 细胞的形态学变化. 如图 2(c) 所示, 随着药物浓度的增加, 细胞的密度呈剂量效应的减少, 细胞形貌也发生明显的改变, 如细胞表面绒毛消失染色质固缩凋亡小体的出现细胞肿胀及有细胞碎片产生, 这些结果提示 BSBD 作用下肿瘤细胞凋亡的发生. 2.2 BSBD 诱导 Neuro-2a 肿瘤细胞凋亡诱导肿瘤细胞凋亡是硒化合物发挥抗肿瘤作用的最主要机制之一. 本实验在前期 MTT 筛选及细胞形貌观察中发现 Neuro-2a 细胞对 BSBD 最为敏感, 于是选用用该细胞作为模型研究所合成有机硒化合物的抗肿瘤作用机理. 首先, 使用流式细胞仪对 BSBD 作用后细胞周期的改变进行分析, 检测凋亡特有的凋亡峰 (Sub-G1 phase), 并计算凋亡百分数 (AP: %). 结果如图 3(a) 所示, BSBD 能显著地诱导 Neuro-2a 细胞凋亡峰的出现, 且呈剂量依赖关系. 例如, 当 BSBD 的浓度增加到 8 μg/ml 时, Sub-G1 凋亡峰从 3.1%( 对照组 ) 提高到 62.3%. 同时, 我们观察到, BSBD 处理并没有显著地改变 G0/G1, S 及 G2/M 期细胞百分比的改变. 这些结果说明 BSBD 通过诱导细胞凋亡而抑制肿瘤细胞生长的. 同时, 我们以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况. Neuro-2a 细胞经不同浓度 BSBD 处理后进行固定及 DAPI 染色. 结果如图 3(b) 所示, BSBD 处理导致细胞呈现核浓缩染色加深核染色质呈新月形聚集于核膜一边, 同时观察到核碎裂成大小不等的凋亡小体, 且随着 BSBD 浓度增加而加剧. 本结果进一步验证细胞凋亡是 BSBD 抑制肿瘤细胞生长的主要机制. 不同肿瘤细胞对 BSBD 的敏感性不同可能是细胞中凋亡相关调控蛋白的表达量不同所致. 2.3 BSBD 对 BSA 荧光光谱的影响 BSA 分子中含有色氨酸 (Tyr) 酪氨酸(Trp) 和苯丙氨酸 (Phe) 残基, 可产生内源荧光 [12], 其中色氨酸的荧光强度最强, 对微环境的变化也最敏感 [13]. 当激发波长为 280 nm 时, BSA 在 340 nm 附近有一特征激发峰, 是由它的色氨酸残基产生的. 如图 4 所示, 在一定浓度的 BSA

No. 11 罗懿等 : 具有抗癌活性的新型硒杂环化合物的合成及其与牛血清蛋白的相互作用 1299 2.4 荧光猝灭作用的猝灭机理上述实验表明, BSBD 可导致 BSA 分子的荧光猝灭. 而一般情况下, 荧光猝灭可分为静态猝灭和动态猝灭. 二者的区别主要在于猝灭常数受温度影响的变化不同.

5 No. 11 罗懿等 : 具有抗癌活性的新型硒杂环化合物的合成及其与牛血清蛋白的相互作用荧光猝灭作用的猝灭机理上述实验表明, BSBD 可导致 BSA 分子的荧光猝灭. 而一般情况下, 荧光猝灭可分为静态猝灭和动态猝灭. 二者的区别主要在于猝灭常数受温度影响的变化不同. 动态猝灭依赖于扩散, 由于温度升高会导致扩散系数增大, 因此荧光物质的猝灭常数将随温度的升高而增大 ; 而对于静态猝灭, 温度升高则导致基态配合物稳定性下降, 因此静态猝灭常数将随温度的升高而减小, 且静态猝灭曲线对浓度变化表现出较好的线性关系 [14]. 为进一步证实此猝灭特性, 先把此过程按动态猝灭即 Stern-Volmer 方程处理 : F 0 /F=1+K q τ 0 [Q]=1+K SV [Q] (1) 图 3 流式细胞分析 (a) 及 DAPI 染色 (b) 检测 BSBD 诱导的 Neuro-2a 细胞凋亡 ( 作用时间为 72 h) Figure 3 Induction of Neuro-2a cell apoptosis by BSBD as examined by flow cytometric analysis (a) and DAPI staining (b). (Cells were treated with BSBD for 72 h) 其中, F 0 为未加入化合物时的荧光强度 ; F 为加入化合物作用后蛋白的荧光强度 ; K q 为荧光猝灭速率常数 (L mol -1 s -1 ); τ 0 为没有猝灭剂存在时荧光分子的平均寿命 ( 生物大分子的荧光平均寿命一般约为 10-8 s); K SV 为动态猝灭常数 ( 即 Stern-Volmer 猝灭常数, L mol -1 ); [Q] 为化合物的浓度. 绘制 F 0 /F~[Q] 关系图 ( 图 5). 图 5 BSBD 猝灭 BSA 的 Stern-Volmer 曲线 Figure 5 The Stern-Volmer curves of fluorescence quenching of BSA by BSBD 图 4 BSBD 对 BSA 的荧光猝灭光谱 Figure 4 Fluorescent quenching spectra of BSA as BSBD added [BSA]: 1.0 µmol L -1 ; 25 ; a~g: [BSBD]=0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 µmol L -1 溶液中, 随着有规律的加入一定量的 BSBD 溶液, BSA 分子荧光发射峰的峰形基本不变, 但其荧光强度有规律地降低, 该结果表明, BSBD 与 BSA 分子发生了相互作用, 提示可能形成了复合物, 并使 BSA 分子中的色氨酸残基的微环境发生了变化. 由图 5 曲线的斜率可得猝灭速率常数 K q, 结果如表 1 所示. 从表 1 可以看出 : K q 数值在数量级, 大于动态猝灭 K SV 值 L mol -1 s -1, 而且随着温度的升高, K q 有所降低. 由此考虑, BSBD 对牛血清白蛋白的荧光猝灭作用不是由扩散和碰撞引起的动态猝灭, 而是与牛血清白蛋白形成了基态复合物, 引起蛋白分子内源性荧光的猝灭, 猝灭类型属于静态猝灭. 2.5 BSBD 与牛血清白蛋白的结合常数与结合位点数对于静态猝灭, 荧光强度与猝灭剂的关系可由荧光分子与猝灭剂之间的结合常数表达式推导求出 [15]. 设

6 1300 化学学报 Vol. 70, 2012 表 1 不同温度下体系的猝灭常数 Table 1 The quenching constant for the different temperatures of BSBD-BSA systems T/ Stern-Volmer plot R 2 K SV / (L mol -1 ) K q / (L mol -1 s -1 ) 20 F 0 /F= [Q] F 0 /F= [Q] F 0 /F= [Q] 生物大分子 B 可与 n 个猝灭剂分子结合, 则其与猝灭剂 (Q, 此处为 BSBD) 间的猝灭反应可表示为 : nq+b=q n B 其结合常数 K A 为 : K A =[Q n B]/[Q] n [B] (2) [B] 是游离荧光体浓度, [Q] 是猝灭剂浓度, [Q n B] 是复合物浓度, 若荧光体总浓度为 [B 0 ], 则 [B 0 ]=[Q n B]+[B], 代入 (2) 式得 : K A =([B 0 ]-[B])/([Q] n [B]) (3) 在静态猝灭中, 荧光体系的荧光强度与其游离浓度成正比 ( 所生成的复合物是非荧光性的 ), 则 : [B]/[B 0 ]=[F]/[F 0 ] (4) 由 (3) 式和 (4) 式可得 : lg[(f 0 -F)/F]=lg K A +nlg[q] (5) 式中的 K A 和 n 分别为此反应的结合常数和结合位点数. 以 lg[(f 0 -F)/F] 对 lg[q] 作图见图 6, 求得 BSBD 和 BSA 的结合常数和结合位点数列于表 2. 图 6 BSBD 猝灭 BSA 的双对数曲线 Figure 6 Double-log plot of BSBD quenching effect on BSA fluorescence 2.6 BSBD 与牛血清白蛋白的作用力类型药物分子和生物体内蛋白等大分子间的结合力主表 2 BSBD 与 BSA 在不同温度下的结合常数与结合位点 Table 2 Binding constants and parameters of BSA with BSBD at different temperatures T/ Double logarithm plot R 2 K A / (L mol 1 ) n 20 lg[(f 0-F)/F]=1.1505lg[Q] lg[(f 0-F)/F]=1.2825lg[Q] lg[(f 0-F)/F]= lg[q] 要有疏水作用力 (Hydrophobic interactions) 范德华力 (Van der Walls force) 静电引力(Electrostatic interactions) 和氢键 (Hydrogen Bond) 等. 不同药物分子与蛋白结合的作用力类型不同, 根据反应的热力学参数可大致确定作用力类型. 当温度变化不太大时, 反应的焓变 ΔH 看成是一个常数, 热力学参数和药物分子与蛋白之间的作用力的关系如下 : ΔG=-RTln K (6) ln K 2 /K 1 =[1/T 1-1/T 2 ]ΔH/R (7) ΔG=ΔH-TΔS (8) 根据结合反应前后热力学参数焓变 ΔH ө 和熵变 ΔS ө 的相对大小, 可以判断外来物质与蛋白质间的主要作用力类型 [16,17]. 当 ΔH ө >0, ΔS ө >0 时, 疏水作用力占主导 [18] ; 当 ΔH ө <0, ΔS ө >0 时, 被认为是静电作用的结果 ; 而当 ΔH ө <0, ΔS ө <0 时, 则主要是范德华力和氢键发挥作用. 但对于实际上药物分子与蛋白的反应体系, 往往可能存在多种作用力, 并不是单一的作用力起作用. 根据 Van t Hoff 及热力学第一定律, 利用表 3 中不同温度下的 K A 值计算 BSBD 与 BSA 作用的热力学参数, 结果见表 3, 从表中我们可以看到 BSBD 与 BSA 结合反应的 ΔG<0, 说明反应可自发进行, ΔH ө <0, ΔS ө <0 说明它们之间的主要作用力为氢键和范德华力. 但也不排除疏水作用的可能性. 一般认为药物小分子与蛋白质结合时, 疏水性药物小分子扦插到蛋白质分子内部的疏水区域 [19]. BSBD 在水中的溶解度非常小, 属于疏水性小分子, 因而可以扦插到 BSA 分子内部的疏水区域, 以疏水作用力与 BSA 结合, 使得 BSA 荧光猝灭. 表 3 BSBD 与 BSA 相互作用的热力学参数 Table 3 The thermodynamic parameters of BSA-BSBD binding procedure T/ ΔG ө /(kj mol -1 ) ΔH ө /(kj mol -1 ) ΔS ө /(J mol -1 )

7 No. 11 罗懿等 : 具有抗癌活性的新型硒杂环化合物的合成及其与牛血清蛋白的相互作用 BSBD 对牛血清白蛋白构象影响同步荧光光谱 BSA 的荧光主要来自色氨酸酪氨酸和苯丙氨酸残基. 当 Δλ 设置为 15 nm 时, 只显示酪氨酸残基的荧光特征光谱 ; 当 Δλ 设置为 60 nm 时, 只显示色氨酸残基的荧光特征光谱, 因此由最大发射波长的改变可判断蛋白质酪氨酸残基和色氨酸残基微环境的极性变化 [20]. 在一定温度下, 固定 BSA 的浓度, 逐渐增大化合物的浓度, 分别扫描 BSA 在 Δλ=15 nm 和 Δλ=60 nm 时的同步荧光光谱, 如图 7 所示 : 随着化合物浓度的增加, BSA 分子中酪氨酸残基和色氨酸残基的荧光均被猝灭, 其中色氨酸残基的荧光被猝灭的程度比酪氨酸残基大. 酪氨酸残基的最大发射波长都略蓝移, 而色氨酸残基的最大发射波长都略红移. 表明化合物的加入使 BSA 的构象发生变化, 酪氨酸残基所处环境的疏水性增加, 而色氨酸残基所处环境的疏水性降低, 化合物分子的结合部位可能都处于这种疏水腔中, 使 BSA 内部的疏水结构有所瓦解, 肽链的伸展程度增加紫外可见吸收光谱图 8 为 BSBD 与牛血清白蛋白的紫外吸收示差光谱. 当溶液中不含 BSBD 时 (a), 在 200~350 nm 吸收范围内可观察到 211 和 278 nm 处的 2 个吸收峰, 278 nm 吸收峰是由牛血清白蛋白中色氨酸酪氨酸和苯丙氨酸等残基的芳香杂环的 π-π* 跃迁所引起的, 而 211 nm 吸收峰是由牛血清白蛋白肽链中氨基酸残基的 C=O 基的 n-π* 跃迁引起的, 与蛋白质分子中 α 螺旋含量有关 [21]. 随着溶液中 BSBD 与血清蛋白的作用, BSA 的紫外吸收光谱发生减色效应, 吸光度降低, 峰位发生移动, 表明化合物与 BSA 发生结合引起蛋白的构象发生了变化 [22], 这可能是化合物与氨基酸中原有基团发生作用, 导致其原有键强减弱, 蛋白的骨架发生变化, 引起减色效应. 紫外光谱的变化表明, 化合物与 BSA 结合形成了复合物. 图 8 BSBD 与 BSA 相互作用的紫外吸收示差光谱图 Figure 8 Differential UV absorption spectra of interaction of BSBD with BSA [BSA]: 1.0 µmol L -1 ; a~f: [BSBD]=0, 6, 12, 18, 24, 30 µmol L 圆二色光谱图 7 BSBD 与 BSA 作用的同步荧光光谱 Figure 7 Synchronous fluorescence spectra of BSA in the presence of BSBD (A) The synchronal fluorescence spectra of tyrosine remnant; (B) The synchronal fluorescence spectra of tyrptophan. [BSA]: 1.0 µmol L -1 ; 25 ; a~ g: [BSBD]=0,1, 2, 3, 4, 5, 6 µmol L -1 通过圆二色谱可以进一步灵敏地检测一些小分子物质与蛋白分子反应引起的蛋白分子的二级结构变化. 为进一步研究 BSBD 引起牛血清白蛋白二级构象的变化, 对比测试了牛血清白蛋白及 BSBD- 牛血清白蛋白体系的圆二色光谱. 图 9a 所示 : 牛血清白蛋白在 208 和 222 nm 表现出两个负的吸收峰, 为牛血清白蛋白 α 螺旋结构的圆二色光谱特征 [23]. BSBD 与牛血清白蛋白发生作用后, 圆二色光谱的负峰峰高振幅减弱, 牛血清白蛋白肽链部分伸展, α 螺旋含量有所降低, 说明 BSBD 与牛血清白蛋白发生了键合, 导致了牛血清白蛋白分子中二级结构元素含量有所改变.

8 1302 化学学报 Vol. 70, 2012 图 9 BSBD 与 BSA 作用的圆二色光谱图 Figure 9 Circular dichroism spectra of interaction of BSBD with BSA [BSA]: 1.0 µmol L -1 ; a~c: [BSBD]=0, 12,18 µmol L 红外光谱血清白蛋白红外光谱的酰氨 I 带 (Amide I, 1700~ 1600 cm -1 ) 主要是氨基酸残基的 C=O 伸缩振动吸收, 对其二级结构的变化非常敏感 ; 酰氨 II 带 (Amide II, 1600~1500 cm -1 ) 包含了 C N 伸缩振动和 N H 变形振动的信息, 也是反映血清白蛋白结构的一个重要谱带, 但对二级结构变化的敏感程度次于酰氨 I 带. 我们利用红外差谱 ([ 蛋白质十药物溶液 ]-[ 药物溶液 ]) 来研究反应前后蛋白质酰胺带的变化. 图 10(a) 为 BSA 的红外光谱减去 Tris 缓冲溶液中的红外光谱 ; 图 10(b) 为 BSA 和 BSBD 混合溶液的红外光谱减去缓冲溶液和 BSBD 的红外光谱. 对比这两个图, BSA 与化合物结合后, BSA 酰胺带的谱峰从 1635 和 1538 cm -1 分别移到了 1630 和 1527 cm -1, 以上结果进一步说明了 BSBD 与 BSA 发生了作用, 引起了 BSA 二级结构的改变. 3 结论本文报道合成了一种新的 1,2,5- 硒二唑衍生物 BSBD, 利用 1 H 核磁共振, 电喷雾质谱等对其结构进行了表征. 通过 MTT 法发现 BSBD 对各种肿瘤细胞的生长均具有较好的抑制作用, 特别对 Neuro-2a 小鼠脑神经瘤细胞表现出很好的选择性. 流式结果显示, BSBD 可呈剂量效应的诱导肿瘤细胞中 Sub-G1 凋亡峰的累积染色质固缩及凋亡小体的形成, 这些说明了 BSBD 主要是通过诱导细胞凋亡发挥其抗肿瘤活性. 接下来, 我们采用多种光谱法研究了硒杂环化合物 BSBD 与牛血清白蛋白的相互作用. 通过比较不同温度下猝灭常数随温度变化的规律, 推测此猝灭类型为静态猝灭 ; 并计算了 283, 288 和 303 K 下的结合常数, 求出结合位点分别为图 10 BSA (a) 及其与 BSBD (b) 结合物的红外光谱图 Figure 10 IR spectra of BSA (a) and its conjugate with BSBD (b) 1.15, 1.28 和 1.22, 此结果表明 BSBD 可以通过与 BSA 形成 BSBD-BSA 复合物来猝灭 BSA 的内源荧光. 由热力学公式计算得到各种热力学参数, 进一步推导出 BSBD 于 BSA 结合过程中起主导作用的是氢键和范德华力. 而同步荧光紫外 - 可见吸收光谱红外光谱和圆二色光谱的结果显示 BSBD 与 BSA 结合后, 能够改变 BSA 的内部结构. 这些实验结果对研究化合物与白蛋白相互作用提供了可靠的实验依据, 也对进一步了解白蛋白的结构和功能具有一定的参考价值. References 1 Jisha, V. S.; Arun, K. T.; Hariharan, R. D. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, Ashoka, S.; Seetharamappa, J.; Kandagal, P. B.; Shaikh, S. M. T. J. Lumin. 2006, 121, Gao, J.-Q.; Guo, Y.-W.; Wang, J.; Wang, Z. Q.; Jin, X. D.; Cheng, C. P.; Li, Y.; Li, K. Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 2011, 78, Banerjee, T.; Singh, S. K.; Kishore, N. J. Phys. Chem. B 2006, 110, Surh, Y. J. Nat. Rev. Cancer 2003, 3, 768.

9 No. 11 罗懿等 : 具有抗癌活性的新型硒杂环化合物的合成及其与牛血清蛋白的相互作用 Tapiero, H.; Townsend, D. M.; Tew, K. D. Biomed. Pharmacother. 2003, 57, Liu, W.-Q.; Yin, X.-H.; Cai, X.-T.; Zhang, Z.-Y.; Li, R.-X.; Chen, S.-H.; Xu, X.-H. Chin. J. Org. Chem. 2010, 30, 1066 (in Chinese). ( 刘文奇, 尹显洪, 蔡喜田, 张尊英, 李若信, 陈四海, 许新华, 有机化学, 2010, 30, 1066.) 8 Shi, Y.-P.; Chen, B.-Q.; Ma, J.; Liu, Y.-M.; Li, C.-W. Acta Chim. Sinica 2011, 69, 2561 (in Chinese). ( 史艳萍, 陈宝泉, 麻静, 刘玉明, 李彩文, 化学学报, 2011, 69, 2561.) 9 Zou, J.-H.; Zheng, W.-J.; Yang, F.; Zeng, X.-H.; Bai, Y. J. Anal. Sci. 2005, 21, 381 (in Chinese). ( 邹家浩, 郑文杰, 杨芳, 曾鑫华, 白燕, 分析学报, 2005, 21, 381.) 10 Chen, T.-F.; Zheng, W.-J.; Wong, Y.-S.; Yang, F. Biomed. Pharmacother. 2008, 62, Chen, T.-F.; Wong, Y. S.; Zheng, W.-J.; Liu, J. Chem.-Biol. Interact. 2009, 180, Li, Z.; Shang, L.-P.; Deng, H.; Zhi, T.-X. Spectrosc. Spectral. Anal. 2009, 29, 1925 (in Chinese). ( 李朕, 尚丽平, 邓琥, 职统兴, 光谱学与光谱分析, 2009, 29, 1925.) 13 Sahoo, B. K.; Ghosh, K. S.; Dasgupta, S.; Dasgupta, S. Biopolymers 2009, 91, Papadopoulou, A.; Green, R.; Frazier, R. J. Agric. Food Chem. 2005, 53, Sandhya, B.; Ashwini, H. H.; Shankara, S. K.; Kalanur, Umesha, K.; Umesha, K. J. Pharm. Biol. Anal. 2011, 54, Ross, P. D.; Subramanian, S. Biochemistry 1981, 20, Ibrahim, N.; Ibrahim, H.; Kim, S.; Nallet, J. P.; Nepveu, F. Biomacromolecules 2010, 11, Sun, Y.; Fan, J.; Hu, X.-Y.; Liu, L.-S.; Hu, C.-M.; Yin, C.; Wei, S. Acta Chim. Sinica 2011, 69, 937 (in Chinese). ( 孙洋, 樊君, 胡晓云, 刘露莎, 胡春梅, 尹辰, 魏嵩, 化学学报, 2011, 69, 937.) 19 Barratt, E.; Bingham, R. J.; Warner, D. J.; Laughton, C. A.; Phillips, S. E. V.; Homans, S. W. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, Zhou, Q.-H.; Wang, Y.-Q.; Zhang, H.-M. J. Instrum. Anal. 2007, 26, 368 (in Chinese). ( 周秋华, 王彦卿, 张红梅, 分析测试学报, 2007, 26, 368.) 21 Cheng, Z.-J.; Zhang, Y.-T. Sci. Direct 2008, 879, Li, C.-X.; Liu, S.-P.; Liu, Z.-F.; Hu, X.-L. Acta Chim. Sinica 2011, 69, 1408 (in Chinese). ( 李翠侠, 刘绍璞, 刘忠芳, 胡小莉, 化学学报, 2011, 69, 1408.) 23 Kandagal, P. B.; Ashoka, S.; Seet, H. J.; Shaikh, S. M. T.; Jadegoud, Y.; Ijare, O. B. J. Pharm. Biomed. Anal. 2006, 41, 393. (A Zhao, X.)

1 13 1. 2. 2 1 H NMR 谱的测定 1 H NMR 20 6 VARIAN INOVA - 400 MHz 7 [9] 1. 2. 3 相溶解度法测定 < 0. 01 mm MTX 15 3 Q 7 5 10 15 20 25 mg 20 ~ 30 mm β - 1

1 13 1. 2. 2 1 H NMR 谱的测定 1 H NMR 20 6 VARIAN INOVA - 400 MHz 7 [9] 1. 2. 3 相溶解度法测定 < 0. 01 mm MTX 15 3 Q 7 5 10 15 20 25 mg 20 ~ 30 mm β - 1 32 1 12 ~ 16 2013 Journal of Mountain Agriculture and Biology * 黄英 1, 马艳辉 2, 王娟 2, 陶朱 2, 薛赛凤 2 2, 祝黔江 1. 550025 2. 550025 以七元瓜环为主体, 抗癌药物甲氨蝶呤为客体, 利用 1 H NMR 技术和紫外可见吸收