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綦涕干
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1 2006 年第 64 卷化学学报 Vol. 64, 2006 第 13 期, 1349~1354 ACTA CHIMICA SINICA No. 13, 1349~1354 研究论文柚皮素柚皮苷与溶菌酶相互作用的荧光光谱法研究杨冉 a 屈凌波 *,b 陈晓岚 b 李建军 ( a 中国药科大学生药教研室现代中药教育部重点实验室南京 ) ( b 郑州大学化学系化学生物重点实验室郑州 ) b 李萍 *,a 摘要应用荧光光谱法研究了 50% 甲醇 / 水体系中柚皮素柚皮苷与溶菌酶分子间的结合反应. 以 Lineweaver-Burk 双 25 倒数方程和能量传递原理分别计算了两者与溶菌酶反应的结合常数 (K) 和结合距离 (r): K 柚皮素 = , K 柚皮苷 = ; r 柚皮素 =3.21 nm, r 柚皮苷 =3.30 nm, 以及由热力学参数的计算判断了两种分子与溶菌酶之间的作用力类型. 结果表明 : 柚皮素柚皮苷均能与溶菌酶以疏水作用相结合形成非共价化合物, 从而导致溶菌酶内在荧光的静态猝灭 ; 相对柚皮素, 柚皮苷与溶菌酶的结合距离增大, 作用强度减弱, 表明黄酮分子上多糖的取代不利于黄酮分子与蛋白之间的亲和作用. 根据 Haslam 等提出的多酚 - 蛋白质反应模型, 从分子水平初步探讨了糖取代对黄酮分子与蛋白相互作用减弱的原因. 关键词荧光光谱法 ; 溶菌酶 ; 柚皮素 ; 柚皮苷 ; 能量传递 Studies on the Interaction of Lysozyme with Naringein and Naringin by Fluorescence Spectroscopy YANG, Ran a QU, Ling-Bo*,b CHEN, Xiao-Lan b LI, Jian-Jun b LI, Ping*,a ( a Key Laboratory of Modern Chinese Medicines, Ministry of Education, Department of Pharmacognosy, China Pharmaceutical University, Nanjing ) ( b Key Laboratory of Chemical Biology, Department of Chemistry, Zhengzhou University, Zhengzhou ) Abstract The interactions between lysozyme (Lys) and naringein or naringin were studied by fluorescence spectroscopy under 50% CH 3 OH/water circumstance. The binding constants and bind distance of naringein- Lys and naringin-lys were calculated according to Lineweaver-Burk equation and Föster energy transfer 25 theory, which were shown as K Naringein = , r Naringein =3.21 nm and K Naringin = , r Naringin = 3.30 nm, respectively. The results showed that both of them could form non-covalent compounds with Lys mainly through hydrophobic interaction force. Relative to naringein, the binding affinity of naringin to Lys decreased obviously. These suggested that the sugar substitution in the structure of flavonoid is not helpful to the binding of flavonoid-protein. According to the polyphen-protein interaction mode presented by Haslam, the reason resulted in weaker bonding affinity of naringin to Lys was analysed in the level of molecule. Keywords fluorescence spectroscopy; lysozyme; naringein; naringin; energy transfer 研究表明, 许多化合物活性的实质在于其与生物体内靶向大分子之间弱的相互作用, 活性的高低取决于它们与靶向分子之间作用的方式和亲和力的大小 [1]. 蛋白质是生物体内具有重要生理功能的大分子, 是药物发挥药效的重要载体和靶分子, 探讨具有药理活性的小分子与蛋白的相互作用及作用机理, 对于了解药物发挥药效 * lipingli@public1.ppt.js.cn; qulingbo@zzu.edu.cn Received July 22, 2005; revised November 15, 2005; accepted March 27, 国家自然科学基金 (No ) 河南省杰出青年科学基金河南省高校创新人才工程资助项目.

2 1350 化学学报 Vol. 64, 2006 的作用机制, 揭示药物效用的实质内涵具有重要意义. 溶菌酶是一种广泛分布于生物体内的小分子碱性蛋白, 长期以来一直被作为一种模型体系, 用于研究蛋白的空间构象酶动力学以及分子进化分子免疫间的关系 [2]. 同时它也是生物体内不可或缺的重要的非特异性体液免疫因子, 能够和很多的外源和内源性物质结合, 从而行使其抗菌消炎抗病毒等诸多的生物功能 [3]. 关于溶菌酶与外源性小分子的研究很少有报道, 本研究组 [4,5] 的陈晓岚等曾通过 ESI/MS 和荧光光谱法对 7- 羟基黄酮 5,7- 二羟基黄酮及其磷酰化产物与溶菌酶的相互作用进行过研究. 本文主要对具有抗炎抗肿瘤抗氧化等很好药理活性的黄酮类化合物柚皮素 (Naringein) [6] 及其糖代产物柚皮苷 (Naringin) [7] 与溶菌酶的作用进行研究, 旨在通过柚皮素柚皮苷与溶菌酶作用的对比, 探讨糖取代对黄酮类化合物与生物大分子作用的影响及与它们活性的关系. (50% 甲醇 / 水溶解 ); 0.5 mol L -1 的 NaCl 溶液 (50% 甲醇 / 水溶解 ). 实验所用试剂均为分析纯, 水为二次蒸馏水. 1.2 实验方法在 200~900 nm 范围内, 扫描 mol L -1 溶菌酶溶液的激发光谱和发射光谱, 找到其最大激发和发射波长为 λ ex /λ em =280 nm/334 nm. 在此条件下, 考察了不同缓冲介质 ph 及离子强度对溶菌酶荧光性质的影响, 结果表明在 mol L -1 Tris HCl 缓冲介质 (ph 7.2) 和 0.1 mol L -1 NaCl 离子强度下, 溶菌酶的荧光相对比较灵敏且稳定. 由于柚皮素柚皮苷几乎不溶于水, 实验中以 50% 甲醇 / 水为溶剂配制两种小分子的储备液. 然而考虑到甲醇对溶菌酶荧光性质的影响, 我们考察了甲醇对溶菌酶荧光性质的影响, 实验结果表明 50% 甲醇对溶菌酶的荧光没有影响. 因此本实验采取在 50% 甲醇 / 水体系中对柚皮素柚皮苷与溶菌酶的作用进行研究, 同时体系保持 mol L -1 Tris HCl 缓冲介质 (ph 7.2) 和 0.1 mol L -1 NaCl 离子强度. 1.3 具体步骤图式 1 柚皮素柚皮苷的结构 Scheme 1 The structure of naringein and naringin 1 试验部分 1.1 仪器与试剂 Hitach F-4500 荧光分光光度计, HP UV-8453 紫外分光光度计, HA-180MF 电子分析天平, 岛津 TB-85 恒温水浴, ph-3s 酸度计. 溶菌酶 (Sigma, >99%) 溶液 : 将一定量的溶菌酶晶体溶于二次重蒸水中, 配制成浓度为 mol L -1 的溶液 ; mol L -1 柚皮素 mol L -1 柚皮苷溶液 ( 中国药科大学生药教研室提供, 纯度为 99.5%): 称取适量的样品, 以 50% 甲醇 / 水溶解, 用时稀释至合适浓度. ph mol L -1 Tris HCl 缓冲溶液 : 在 10 支 10 ml 的具塞试管中, 依次加入 1.0 ml 0.1 mol L -1 Tris HCl 缓冲溶液, 0.8 ml 0.5 mol L -1 NaCl 溶液, 0.1 ml mol L -1 溶菌酶溶液和一定量的 mol L -1 柚皮素柚皮苷溶液, 然后用 50% 甲醇 / 水稀释至 4 ml. 将试管置于恒温仪中分别调节水温至 25 和 37, 以 280 nm 为激发波长, 激发和发射光谱狭缝宽度均为 5.0 nm, 记录柚皮素柚皮苷对溶菌酶的荧光猝灭光谱图 ( 图 1). 实验浓度条件下的柚皮素和柚皮苷均无荧光发射. 由于两分子在溶菌酶的激发波长 (280 nm) 和发射波长 (334 nm) 下均有一定吸收, 因此其猝灭行为下包含有内滤光效应. 实验中柚皮素和柚皮苷在 280 和 334 nm 下的吸收均不超过 0.3. Steiner [8,9] 等提出, 如果吸收值不超过 0.3 时, 内滤光效应可以用以下公式予以校正 : F C =F a e (A1+A2)/2 (1) 其中 F a 和 F C 分别代表校正后和观察到的荧光强度, A1 和 A2 则是小分子溶液在激发和发射波长处的吸收值. 本文采用此公式对内滤光效应予以校正. 除特别说明以外, 以下计算所用的荧光强度均为校正内滤光后的荧光值. 2 结果与讨论 2.1 柚皮素柚皮苷对溶菌酶荧光光谱的影响蛋白质的荧光光谱是蛋白分子中荧光生色基团的

3 No. 13 杨冉等 : 柚皮素柚皮苷与溶菌酶相互作用的荧光光谱法研究 1351 种类结构和所处微环境及其分布情况的反映, 由溶菌酶发射光谱的特征可知其内源荧光主要表现为分子内色氨酸残基的发射 [10]. 由图 1 可知 : 随着柚皮素柚皮苷的加入, 334 nm 左右溶菌酶的最大荧光发射峰逐渐降低, 并且柚皮素使溶菌酶的最大发射红移 16 nm. 蛋白中色氨酸残基的最大发射波长与其所处环境的极性密切相关 [11], 由发射波长的改变可判断蛋白质构象的变化. 上述现象说明柚皮素的加入使溶菌酶构象发生了变化, 发射波长红移, 表明色氨酸残基所处环境疏水性降低 [12], 这种变化是柚皮素分子与溶菌酶分子发生相互作用的佐证. 但柚皮苷的加入只是引起溶菌酶内在荧光的有规律的猝灭, 仅从这一点还不足以证明它们之间发生了相互作用, 为了探讨这种猝灭是否是因为它们之间发生了作用而造成的, 下面通过动态猝灭常数和静态猝灭结合常数的计算来进一步地判断. 2 和图 3. 结果见表 1. Stern-Volmer 方程 : F 0 /F=1+K q τ 0 [Q]=1+K sv [Q] (2) Lineweaver-Burk 双倒数方程 : (F 0 -F C ) -1 =F K -1 F -1 0 [Q] -1 (3) 式中 F 0 为未加入化合物时蛋白的荧光强度, F 是加入化合物作用后蛋白的荧光强度, K q 为双分子猝灭过程速率常数, K sv 是动态猝灭常数, τ 0 是猝灭剂不存在时生物大分子的平均寿命, K 为小分子与蛋白的结合常数, [Q] 为猝灭剂的浓度. 图 2 柚皮素 (a) 和柚皮苷 (b) 与溶菌酶作用的 Stern-Volmer 图 Figure 2 Stern-Volmer plots of the interaction between Lys and naringein (a) or naringin (b) 图 1 柚皮素 (a) 和柚皮苷 (b) 于 25 对溶菌酶荧光光谱的影响 Figure 1 Effect of naringein (a) and naringin (b) on fluorescence spectra of Lys at 25 c Lys = mol L -1 in all cases. Peak from up to down: c naringein =(0, 2.2, 4.4, 6.6, 8.8, 11.0, 13.2, 15.4, 17.6, 19.8) 10-6 mol L -1 ; c naringin =(0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 12.5, 15.0, 17.5, 20.0, 22.5) 10-6 mol L 动态猝灭常数和静态猝灭结合常数的计算及猝灭机理的探讨荧光猝灭作用可分为动态猝灭作用和静态猝灭作用, 分别用处理动态猝灭的 Stern-Volmer [13] 方程和静态 [13] 猝灭的 Lineweaver-Burk 双倒数方程对其中的过程进行处理, 不同温度下柚皮素柚皮苷对溶菌酶作用的 Stern-Volmer 图和 Lineweaver-Burk 双倒数图, 分别见图一般情况下, 产生荧光猝灭作用的原因主要有三种 : 动态猝灭静态猝灭和发生非辐射能量转移等. 根据动态猝灭常数 K sv 静态猝灭的结合常数 K 随温度的变化可以对猝灭的机理进行判断. 对于动态猝灭作用, 温度升高将有利于荧光体和荧光猝灭剂分子的有效碰撞, 并可以促进电子的转移过程, 使 K sv 随温度的升高而增大 ; 若是静态猝灭, 温度升高, 产物的稳定性降低, 静态猝灭结合常数 K 将减小. 由图 2 和图 3 均可看出, 无论是动态猝灭的 Stern-Volmer 图还是静态猝灭的 Lineweaver-Burk 双倒数图, 曲线均有良好的线性关系, 且动态猝灭常数和静态结合常数都随温度升高而降低. 故可以初步判断, 柚皮素柚皮苷对溶菌酶内在荧光的猝灭为静态猝灭. 同时文献报道根据生物大分子的荧光寿命约为 10-8 s [14] 计算, 各类猝灭剂对生物大分子的扩

4 1352 化学学报 Vol. 64, 2006 ln(k 2 /k 1 )=ΔH/R(1/T 1-1/T 2 ) (4) ΔG=-RTln k (5) ΔS=-(ΔG-ΔH)/T (6) 图 3 柚皮素 (a) 和柚皮苷 (b) 与溶菌酶作用的 Lineweaver-Burk 图 Figure 3 Lineweaver-Burk plots of naringein-lys (a) and naringin-lys (b) interaction 表 1 不同温度下柚皮素柚皮苷与溶菌酶作用的猝灭速率常数 K sv 及结合常数 K Table 1 K sv and K of the interaction between Lys and naringein or naringin at different temperatures Stern-Volmer 方程 Lineweaver-Burk 方程 T/ Ksv /(L mol -1 ) R 2 K/(L mol -1 ) R 2 柚皮素柚皮苷散碰撞猝灭常数最大不超过 L mol -1 s -1[15], 由表 1 中结果可以看出, 柚皮素柚皮苷对溶菌酶荧光的猝灭速率常数 K q 均远大于 L mol -1 s -1, 因此综上分析的结果, 我们可以断定柚皮素柚皮苷对溶菌酶体系的荧光猝灭作用主要不是因为分子扩散和碰撞所引起的动态猝灭, 而是它们镶嵌在溶菌酶分子之间, 彼此结合形成了某种特定结构的超分子化合物所引起的静态猝灭. 2.3 作用力类型的确定有机小分子和蛋白质等生物大分子之间的结合力主要有疏水作用力范德华力和静电引力等 [20]. 不同小分子与蛋白质结合力的类型是不同的. 当温度变化不大时, 反应的焓变 ΔH 可以看作一个常数, 根据反应前后热力学参数焓变 ΔH 和熵变 ΔS 的相对大小, 可以判断小分子与蛋白质间的主要作用力类型. 热力学参数之间的关系如下 : 根据热力学公式以及不同温度下的 k, 计算柚皮素柚皮苷与溶菌酶作用的热力学参数见表 2. 由表中结果可知, 无论是柚皮素与溶菌酶的结合反应还是柚皮苷与溶菌酶的结合反应, 体系的热力学参数均 ΔS>0, ΔG<0, 表明柚皮素柚皮苷与溶菌酶的结合反应不但能进行, 而且可以自发进行. ΔS>0 是大分子与小分子之间以疏水作用力作用的标志. 但由于蛋白结构的复杂性, 小分子和蛋白之间往往同时存在几种作用力. 纯粹的疏水作用不仅表现为 ΔS>0, 而且 ΔH 也应大于零, 本实验的结果中 ΔH 略小于零, 表明它们之间还存在其它类型的作用力. 从分子的结构分析, 柚皮素柚皮苷为多羟基化合物, 羟基与蛋白分子氨基酸残基之间有可能形成氢键, 因此我们推断柚皮素柚皮苷与溶菌酶之间还存在氢键作用力. 表 2 柚皮素柚皮苷与溶菌酶结合的热力学参数 Table 2 Thermodynamic parameters of the interactions between Lys and naringein or naringin 柚皮素柚皮苷 T/ ΔH/(kJ mol -1 ) ΔS/(J K -1 ) ΔG/(kJ mol -1 ) 结合距离的计算根据 Föster 偶极 - 偶极非辐射能量转移原理 [14], 当两种化合物满足以下三个条件时会发生非辐射能量转移 : (1) 供能体发荧光 ; (2) 供能体的荧光发射光谱与受能体的吸收光谱有足够重叠 ; (3) 供能体与受能体足够接近, 最大距离不超过 7 nm. 由溶菌酶与柚皮素柚皮苷光谱叠加图 ( 图 4) 可知, 溶菌酶荧光光谱与柚皮素柚皮苷的吸收光谱有较大程度的重叠. 根据 Föster 原理, 能量转移效率 E 与距离 r 之间的关系 : E= R /( R +r 6 ) (7) 6 c 6 c 6 Rc = (K 2 Ф n -4 J) (8) R c 为能量转移效率为 50% 时的临界距离, K 2 为偶极空间取向因子, n 是介质折射指数, Ф 为供能体的荧光量子产率, J 为供能体的荧光光谱和受能体的吸收光谱间的重叠积分.

5 No. 13 杨冉等 : 柚皮素柚皮苷与溶菌酶相互作用的荧光光谱法研究 1353 [Q]=1 1 时溶菌酶的荧光强度, F 0 为没有加入柚皮素柚皮苷时溶菌酶的荧光强度, 根据测定结果计算出溶菌酶与柚皮素柚皮苷之间的距离, 结果见表 3. 柚皮素柚皮苷与溶菌酶之间的距离均小于 7 nm, 表明柚皮素柚皮苷与溶菌酶间均可发生能量转移, 它们对溶菌酶内在荧光的猝灭有可能是发生了分子间的能量转移而引起的. 2.5 柚皮素柚皮苷结构与溶菌酶结合模式及其活性关系的初步探讨图 4 溶菌酶的荧光光谱与柚皮素 (a) 和柚皮苷 (b) 的吸收光谱的叠加图 Figure 4 Overlap of absorption of naringein (a) and naringin (b) with Lys fluorescence spectra c Lys =c Naringein =c Naringin = mol L -1 J=Σ(F D (λ) ε A (λ) λ 4 Δλ)/Σ(F D (λ) Δλ) (9) 式中 F D (λ) 为供能体在波长 λ 处的荧光强度, ε A (λ) 是受能体在波长 λ 处的摩尔吸光系数, Δλ 为计算时分割的波长跨度. 由图 4, 把光谱重叠部分分割成很小的矩形, 依据式 (8) 求得柚皮素柚皮苷与溶菌酶的重叠积分, 将 J 值及 K 2, n, Ф 值代入式 (7), 即可求出临界距离 R c, 计算中空间取向因子 K 2 取供能体和受能体的各向同性随机分布的平均值的 2/3, 介质折射指数 n 取水和有机物的平均值 1.336, Ф 取室温下色氨酸的量子产率 0.118, 能量转移效率 E 可由 E=1-F/F 0 求出, 式中 F 为 [ 溶菌酶 ] 20 世纪 80 年代中期, Haslam 等对多酚 - 蛋白质反应机理进行过深入的探讨, 认为多酚类物质主要是通过大量酚羟基与蛋白质主链的 NHCO, 侧链上的 OH, NH 2 以及 COOH 形成氢键而发生多点结合, 且相互作用的强弱具有分子选择性 ; 反应的历程是多酚先通过疏水键向蛋白质分子表面靠近, 多酚分子进入疏水袋, 然后发生多点氢键结合 [21,22], 这是目前最完善的多酚 - 蛋白质反应机理, 也是黄酮类化合物与体内酶反应的基础. 由上述理论可以看出, 分子中氢键的多少分子的疏水性分子的空间体积是影响多酚与蛋白质作用的主要因素. 分子的疏水性常通过分子在正辛醇与水中的分配系数 P 来衡量. 为了进一步探讨新橙皮糖取代对黄酮分子与蛋白作用的影响原因, 我们通过 ChemDraw 粗略地估算了柚皮素柚皮苷的 log P 和分子体积 ( 见表 3). 由表中结果可知, 新橙皮糖的取代导致黄酮分子的疏水性大大降低, 同时分子的体积也变大. 疏水作用是主要发生在非极性基团之间的一种作用力, 分子的疏水性降低, 不利于分子之间的疏水作用的发生 ; 同时, 柚皮苷分子的空间体积增大, 使得它的空间位阻增大, 不利于其与溶菌酶之间的接近. 因此我们推断分子疏水性的降低和分子体积的增大可能是导致柚皮苷与溶菌酶作用减弱的主要原因. 黄酮类化合物是一类广泛分布于植物体内的低分子多酚类物质, 具有清除自由基抗氧化抗癌抗病毒等多种生物活性和药理作用, 其中最为重要的是抗氧化活性. 柚皮苷为柚皮素 7 位羟基被一分子新橙皮糖取代所生成的黄酮苷. 黄酮构效关系研究表明, 当黄酮上的羟基被大体积的糖取代时, 会降低黄酮的活性 [16,17]. Machha [18] 报道柚皮素相对柚皮苷具有更强的松弛血管降低心血管疾病的效用 ; Chan [19] 在黄酮抗氧化机理探讨表 3 柚皮素柚皮苷与溶菌酶作用的距离 Table 3 The distance of the interactions of Lys with naringein and naringin J/(cm 3 L mol -1 ) R 0 /nm E r/nm log P Molecular volume/(cm 3 mol -1 ) Naringein Naringin

6 1354 化学学报 Vol. 64, 2006 的过程中发现柚皮素具有更强的氧活化功能, 从而比柚皮苷具有更强的抗氧化作用. 柚皮素与溶菌酶的结合能力大于柚皮苷, 表明当黄酮上的羟基被大体积的二糖取代后会减弱黄酮与生物大分子之间的结合能力, 这与黄酮构效关系研究的结果相一致, 同时也与两种化合物活性强弱的报道相一致. 由此推断, 黄酮与蛋白的作用强弱与它们的活性具有相关性, 值得我们更深层次地研究. 3 结论本实验应用荧光光谱法研究了 50% 甲醇 / 水体系中柚皮素柚皮苷与溶菌酶分子间的结合反应. 以 Lineweaver-Burk 双倒数方程和能量传递原理分别计算了两者与溶菌酶反应的结合常数 (K) 和结合距离 (r): 25 K = , K = ; r 柚皮素柚皮苷柚皮素 =3.21 nm, r 柚皮苷 =3.30 nm, 以及由热力学参数的计算判断了两种分子与溶菌酶之间的作用力类型. 研究的结果表明, 柚皮素柚皮苷均能与溶菌酶以疏水作用相结合形成非共价化合物, 从而导致溶菌酶内在荧光的静态猝灭 ; 柚皮素柚皮苷与溶菌酶结合相对强弱的对比说明, 黄酮分子上大体积糖的取代会减弱黄酮分子与蛋白的亲和力, 所获的结论与黄酮构效关系以及两种小分子活性强弱的报道结果相一致, 说明黄酮分子与蛋白作用的强弱与黄酮分子的活性具有相关性. 因此黄酮与生物大分子之间相互作用的研究, 对于揭示黄酮分子活性的实质内涵具有重要意义, 所获的结果可为新的黄酮药物分子的设计提供有益的参考和依据. References 1 Pyle, A. M.; Morii, T.; Barton, J. K. J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, Jeffrey, S. N.; John, J. R.; Bruce, S. Z. Cancer Res. 1981, 4, Wang, D. L. Chin. Biotechnol. 2003, 23(9), 59 (in Chinese). ( 王佃亮, 中国生物工程杂志, 2003, 23(9), 59.) 4 Chen, X. L.; Yu, F.; Qu, L. B.; Zhao, Y. F. Acta Chim. Sinica 2004, 62(2), 188 (in Chinese). ( 陈晓岚, 于菲, 屈凌波, 赵玉芬, 化学学报, 2004, 62(2), 188.) 5 Chen, X. L.; Qu, L. B.; Zhang, T. Supramol. Chem. 2004, 16(1), Anne, W. H.; Yashomati, M. P. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003, 305, Seon, M. J.; Song, H. B.; Moon, K. J. Life Sci. 2001, 69, Steiner, R. F.; Weinry, B. L. Excited States of Protein and Nucleic Acid, Plenum Press, New York, Guo, Y. J. Experimental Technology of Fluorescence and Its Application in Molecular Biology, Science Press, Beijing, 1983 (in Chinese). ( 郭尧君, 荧光实验技术及其在分子生物学中的应用, 科学出版社, 北京, 1983.) 10 Wang, Y. L.; Wang, H. F. Acta Sci. Nat. Univ. Pekinensis 2002, 38(2), 159 (in Chinese). ( 王亚俐, 王海芳, 北京大学学报 ( 自然科学版 ), 2002, 38(2), 159.) 11 Klainert, B.; Bryszewska, M. Bioeletrochemistry 2002, 55, Li, N.; Wei, Y. J. J. Hebei Normal Univ. (Nat. Sci. Ed.) 2003, 27(2), 176 (in Chinese). ( 李娜, 魏永巨, 河北大学学报 ( 自然科学版 ), 2003, 27(2), 176.) 13 Lakowicz, J. R. In Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New York, Yang, P.; Gao, F. The Principles of Bioinorganic Chemistry, Science Press, Beijing, 2002 (in Chinese). ( 杨频, 高飞, 生物无机化学原理, 科学出版社, 北京, 2002.) 15 Jiang, C. Q.; Gao, M. X.; Meng, X. Z. Spectrochim. Acta, Part A 2003, 59, Cholbi, M. R. Experientia 1991, 47, Moraa, A.; Pay, M.; Rios, J. L. Biochem. Pharm. 1990, 40(4), Machha, A.; Anwar-ul Hassan, G.; Mohd, R. M. Life Sci. 2003, 74, Chan, T.; Galati, G.; Brien, P. J. Chem.-Biol. Interact. 1999, 122, Ross, D. P.; Sabramanian, S. Biochemistry 1981, 20, Shi, B.; He, X. Q.; Haslam, E. J. Am. Leather Chem. Assoc. 1994, 89, Hemingway, R.; Laks, P. Plant Polyphenols, Plenum Press, New York, 1992, p (A LI, L. T.; FAN, Y. Y.)

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doc 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2011, 46 (6): 677 682 677 染料木素与 β- 葡萄糖苷酶相互作用的研究张耀东 *, 高裙裙, 郁彩虹 ( 陕西省生命分析化学重点实验室, 陕西师范大学化学与材料科学学院, 陕西西安 710062) 摘要 : 本文研究了染料木素与 β- 葡萄糖苷酶的相互作用采用荧光光谱法研究了染料木素与 β- 葡萄糖苷酶的结合反应,